光化學動力療法之系列研究---理想經皮吸收藥劑及螢光監測儀器之開發

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告

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※ 光化學動力療法之系列研究：理想經皮吸收藥劑及螢光監測儀之開發

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計畫類別：□個別型計畫　　□整合型計畫 計畫編號：NSC89－2314－B－006－095－

執行期間：88 年 8 月 1 日至 89 年 7 月 31 日

計畫主持人：王德華 E-mail：[email protected]

共同主持人：蔡瑞真、方炎坤、沈茂昌、許漢銘

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

執行單位：國立成功大學皮膚科

中　華　民　國 89 年 09 月 17 日

行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

光化學動力療法之系列研究：理想經皮吸收藥劑及螢光監測儀之開發

The Sequential Studies of Photodynamic Therapy: Development of Optimal Transdermal Delivery Agent and The Fluorescence Monitor Machine

計畫編號：NSC 89-2314-B-006-095 執行期限：88 年 8 月 1 日至 89 年 7 月 31 日

主持人：王德華 執行機構及單位名稱：國立成功大學皮膚科 E-mail：[email protected]

共同主持人：蔡瑞真¹、方炎坤²、沈茂昌³、許漢銘⁴

執行機構及單位名稱: 國立成功大學臨床葯學研究所¹、電機工程研究 所²、高雄醫學大學外科³、國立成功大學皮膚科⁴

一、中文摘要

光化學動力療法(Photodynamic

therapy, PDT)是一種嶄新的癌症治療法，在 新一代感光劑中，5-Aminolevulinic acid (5-ALA)是目前最被廣泛研究的感光劑前 驅物，在癌細胞中會被代謝成 Protoporphrin IX (PpIX)，經由 405nm 藍光激發後，會釋 放出 635nm 之紅色螢光，細胞內之 PpIX 濃度，與螢光強度成正比，因此監測螢光 強度變化，即可達到監測葯物代謝的目 的，然而目前的螢光監測儀，動輒百萬元 台幣，另一方面，臨床上最常使用 20%5- ALA 來治療皮膚癌，而 5-ALA 亦為昂貴之 葯物，因而找出一個經濟實用的螢光監測 系統以及找出一個降低葯物濃度卻不失療 效之葯物配方，是許多學者努力的方向。

主持人在 88 年度進行 PDT 於鱗狀細 胞癌之應用：生體內及生體外之研究，本 計畫為延續上一計劃，分為兩部份：1.經濟 實用之螢光監測儀之開發，2.理想經皮吸收 藥劑之開發。在 1.的部份，我們採用去年 計畫所建立的紫外線誘導無毛鼠鱗狀細胞 癌模式，嚐試利用解剖顯微鏡連接 CCD 及 電腦，作線上觀察腫瘤於吸收感光劑後之 螢光變化，發現由於螢光之亮度很低，非 要採用昂貴的高敏感度 CCD，有違我們的 研究目的，因而改採用數位相機長時間曝 光模式下攝取腫瘤之螢光照片，發現可成 功擷取清晰的圖片供數位分析。因此我們 利用此方法進行監測第 2.部份實驗之葯物 動力學，並與國外知名螢光監測儀 Spex SkinSkan (Jobin Yvon Ltd., UK)比較，發現 其相關性很高。

在 2.的部份：理想經皮吸收藥劑方

面，我們分別採用不同組合之配方，包括 不同濃度之 5-ALA 溶液加入不同濃度經皮 吸收促進劑 Dimethyl sulfoxide (DMSO)，

代 謝 抑 制 劑 deferoxamin methansulfonic, (Desferal^®, CIBA-GEIGY Ltd., Switzerland, 以下簡稱 DES)，發現加入代謝抑制劑 DES 最能提高腫瘤組織之藥物濃度及延遲藥物 代謝，其中以 2%5ALA 加上 10%DES 溶液 為最佳之組合。

總括來說，我們已成功的利用數位相 機擷取數位影像及影像分析來達到螢光監 測的目的，並且找出一組有效提升藥物吸 收的配方，大大降低了 PDT 的治療成本，

有利此項嶄新治療廣泛應用，嘉惠癌症病 患。

關鍵詞：光化學動力療法、螢光監測系統、

經皮吸收、紫外線誘發鱗狀細胞癌、無毛 鼠。

Abstr act

Photodynamic therapy (PDT) began to bloom as a new promising therapy against cancers in recent 10 years. 5-

aminolevulinic acid (5-ALA) was one of the most well studied prodrugs, which turns into the photosensitizer protopophrin IX (PpIX) in cancer cell. PpIX, the new second generation photosensitizer emits 635nm red fluorescence under 405nm blue light

excitation. The intensity of red

fluorescence correlates well with the cellular content of PpIX and thus can be used for drug monitoring. Twenty precent 5-ALA cream was often used to treat skin cancers in clinical practice. However, the fluorescence

intensity monitoring system (around million NT dollars) as well as 5-ALA are quite expensive. To develop an effective yet inexpensive fluorescence intensity monitoring system and 5-ALA topical formulation is therefore mandatory.

The project composed of two arms: 1.

To develop an effective, inexpensive

fluorescence monitor device during PDT, 2.

To develop a cost effective formulation for transdermal delivery of 5-ALA.

By using UV-induced squamous cell carcinoma in hairless mice skin model we established in the last NSC project, we found that digital camera could effectively capture fluorescence image for digital analysis. A good correlation between the fluorescence kinetics analyzed with digital images and with a commercial machine Spex SkinSkan^® (Jobin Yvon Ltd., UK).

To develop a better formulation for transdermal absorption, we combined 5-ALA solution with different concentrations of enhancer (DMSO), elimination inhibitor (DES, deferoxamin methansulfonic,

Desferal^®, CIBA-GEIGY Ltd., Switzerland) and monitoring fluorescence kinetics for 32 hours after 4-hour occlusion. We found that 2% 5-ALA with 10% DES appeared to be the best formulation for transdermal absorption.

In summary, we found that digital imaging was a cheap and effective way to monitor fluorescence kinetics during PDT.

Two percent 5-ALA with 10% DES provided a stronger and longer fluorescence intensity in tumor tissue in comparison to other combinations. It implied that it could be used for clinical studies in stead of 20% 5- ALA which usually used, though it may probably unnecessary.

Keywor ds: Photodynamic therapy, 5- aminolevulinic acid, UV-induced squamous cell carcinoma, fluorescence monitor device, transdermal delivery

二、緣由與目的

由 於 光 化 學 動 力 療 法 (Photodynamic therapy, PDT)是利用感光劑吸收特定波長 的可見光，在氧的存在下，造成單價氧及 自由基來達到滅殺腫瘤效果(Fig 1)，由於具

高度的選擇性(1)，在許多非黑色素瘤皮膚 癌(non-melanoma skin cancer)的治療中，已 有相當不錯的成效，新一代的感光劑中又 以 5-aminolevulinic acid (5-ALA)的研究最 多，並且於去年獲美國 FDA 通過用以治療 皮膚癌前癌病變：日光性角化症；過去的 外用 5-ALA 配方，皆是採用經驗法則，大 多採用 20%藥膏為主(1)，然而，有愈來愈 多的証據顯示並非必要(2,3)，因此本計畫 延續去年計畫，採用紫外線誘發無毛鼠產 生鱗狀細胞癌的動物模式(4,5)，希望找出 一個提高藥物吸收減少用藥成本的較佳配 方。另一方面，由於組織吸收 5-ALA 後，

會 在 組 織 內 代 謝 成 為 Protoporphrin IX (PpIX)，在 405nm 的藍光激發下，可產生 635nm 之紅色螢光，螢光之強度與組織內 藥物濃度成正比，因此監測組織的螢光變 化，可以達到分析活體內藥物動力學的效 果(1,6)，但目前的螢光監測儀，動輒百萬 元台幣，因此本計畫的另一目的為開發一 個經濟有效的螢光監測系統。

三、結果與討論

經由每週 5 天以 200mJ/cm²的 UVB 照 射無毛鼠鼠背，平均約 62 天後會長出腫 瘤，停止紫外線照射後，腫瘤仍會持續產 生及變大(4)。選取 3mm 大小的鱗狀細胞癌 (4)為腫瘤組(T)(Fig 2)，而同一只老鼠無腫 瘤部位為 N 組，以 2%5ALA 配合高低濃度 (2%，10%)之經皮吸收促進劑 DMSO 及代 謝抑制劑 DES 作預試驗，在密封四小時 後，於各時間點(0，4，5，6，7，8，24，

28，32 小時)，以 SkinSkan^®(激發光 405nm，

偵測螢光 600-650nm, peak 635nm)監測其 螢光強度變化，希望在各種組合中找出能 達到與臨床上常用的 20%5-ALA 水溶液(目 標 值 ) 之 螢 光 強 度 ， 發 現 2%5- ALA+10%DES 為最佳組合(Fig 3A-C)，因 此 針 對 下 列 組 合 ： 2%5-ALA ， 2%5- ALA+10%DES ， 20%5-ALA 作 進 一 步 實 驗，每一組取四只老鼠，密封 4 小時後，

以 Kodak DC290 數位相機，連接 7X 近拍 鏡頭，固定於攝影架上，以固定的距離及 1.5 秒 的 長 時 間 曝 光 ， 在 Wood’s Lamp(340-410nm, peak365nm)下攝影其紅

色螢光(Fig 2)，輸入電腦 PC 後，以 NIH Image 1.61, (Wayne Rasband ， National Institutes of Health, Bethesda MD, USA)分 析 其 螢 光 強 度 (Fig 4A-C) ， 發 現 與 SkinSkan^®所得圖形相符，証明與數位相 機，配合 NIH Image 分析，可得到相近於 SkinSkan^®所得之螢光強度曲線。

5-ALA 是一種 prodrug，在組織內代謝 成感光劑 PpIX，再經由 ferrochelatase 與 Fe⁺⁺的作用下，代謝成 heme，而 DES 為一 種 Fe⁺⁺螯合劑，與 ferrochelatase 競爭性的 與 Fe⁺⁺結合，延長 PpIX的代謝(1)(圖 1)，

在圖 3,4 可見各種組合配方於給藥後第 5 小時達到高峰值，而 2%5-ALA+10%DES 此組配方，達到高峰後一直維持在高原期 至 32 小時，而 2%5-ALA 與 20%5-ALA 組 則在 24 小時至 28 小時回到原來之螢光背 景值，在正常皮膚的測試(5)，PpIX應在 24 小時內完全代謝，在此實驗中，所有實驗 組之螢光代謝均較延遲代謝，推測可能與 腫瘤的 ferrochelatase 功能較差有關(1)，而 加入 DES 更大大的延誤了 PpIX之代謝，雖 然如此，與無腫瘤皮膚(N)的比值，仍維持 於約 3 倍以上，此點在臨床上很重要，因 為我們希望腫瘤內的 PpIX濃度愈高愈好，

而正常皮膚則愈低愈佳，才可以達到殺死 腫瘤細胞而減低破壞正常皮膚的目的，這 方面在 20%5ALA 則無法達到(3,7)，雖然此 組配方之螢光高峰值稍高於其餘兩組，但 並無統計上之差異(Mann-Whitney Test，

P>0.05)，而此配方對腫瘤選擇性低，在臨 床上使用上可能損害到正常之皮膚；然 而，是否必須破壞腫瘤組織周圍正常組織 才能達到根除腫瘤組織的必要條件，仍待 進一步的研究。

愈來愈多的研究指出高濃度 5-ALA 並 非必要(2,3,7)，我們的結果與其他學者相 符，因為 2%的 5-ALA 與 20%相差十倍，

而 DES 價格很低，經皮膚投葯，幾無副作 用，這配方大大降低了製葯成本，我們的 成果可以進一步進行動物及臨床的 PDT 治 療試驗，以驗証其療效。

四、計畫成果自評

我們的研究建立了一個最接近人類鱗

狀細胞癌的動物模式，為日後探討各種紫 外線致癌機轉(carcinogenesis)或各種治療 鱗狀細胞癌的一個良好實驗模式。經由測 試經皮吸收促進劑及代謝抑制劑，我們找 到了低濃度 2%5-ALA，加上 10%DES 溶 液，可達到接近目前常用之 20%5ALA 之 葯物吸收，而且有較佳選擇性，以數位相 機攝取數位影像，經由免費分析軟體 NIH Image 分析，便可成功的 in vivo 監測 PpIX 的代謝，經由以上的發現，PDT 的治療成 本將可大幅降低，將有利更多的研究人員 投入相關研究及臨床應用。

五、參考文獻

1. Peng Q, Warloe T, Berg K, et al. 5- Aminolevulinic acid-based photodynamic therapy. Clinical research and future challenges. Cancer. 79:2282-308, 1997.

2. Wong TW, Sheu HM, Lee JYY, Fletcher RJ. Photodynamic therapy for Bowen’s isease (squamous cell carcinoma in situ) of the digit. J Dermatol Surg. (submitted).

3. Jeffes EW, McCullough JL, Weinstein GD, et al. Photodynamic therapy of actinic keratosis with topical 5-aminolevulinic acid. A pilot dose-ranging study. Arch Dermatol 1997;133:727-32.

4. Wong TW, Hsieh WT, Fang YK, Sheen MC. The application of photodynamic therapy in squamous cell carcinoma: in vivo and in vitro studies. 1999; NSC 882314B006105 report.

5. van der Veen N, de Bruijn HS, Berg RJ, Star WM. Kinetics and localisation of PpIX fluorescence after topical and systemic ALA application, observed in skin and skin tumours of UVB-treated mice. Br J Cancer 1996;73:925-30.

6. Ackermann G, Abels C, Baumler W, et al.

Simulations on the selectivity of 5-

aminolaevulinic acid-induced fluorescence in vivo. J Photoch Photobio B

1998;47:121-8.

7. Fehr MK, Chapman CF, Krasieva T, et al.

Selective photosensitizer distribution in vulvar condyloma acuminatum after topical application of 5-aminolevulinic acid. Am J Obstet Gynecol 1996;174:951- 7.

Glycine + Succinyl-CoA ALA-synthase

5-ALA Topical 5-ALA

administration +

PBG DMSO

PpIX

Ferrochelatase DES Heme

Fig. 1. Porphyrin metabolism in mammalian cells. Application of ALA bypass the rate determining step of heme on ALA synthase which leads to PpIX accumulation. DMSO enhances topical delivery of ALA

theoretically while DES acts as a competitive inhibitor of ferrochelatase (red line represent inhibition).

Fig. 2. After 4 hours occlusion with 5-ALA solution, vivid red fluorescence (635nm) could be seen on the UV-induced squamous cell carcinoma of the hairless mouse skin under Wood’s lamp (340-410nm, peak 365nm) excitation.

Fig. The fluorescence intensity measured by Skinskan (3A-C) and by digital imaging captured with digital camera (4A-C).

Note the similarities between two measurement systems.

The scales in Fig3 were proportional reduced in order to compare with Fig 4.

T-2, T-2+10, T-20: tumor occluded 4 hr with 2% ALA, 2%ALA+10%DES, 20%ALA respectively; N: normal appearance mice skin.

Fig. 4B

Time (hr)

0 4 8 12 16 20 24 28 32

Fluorescence intensity

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

240 ^T-2+10

N-2+10

Fig. 4C Time (hr)

0 4 8 12 16 20 24 28 32

Fluorescence intensity

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

T-20 N-20

Fig. 3A Time (hr)

0 4 8 12 16 20 24 28 32

Fluorescence intensity(x3.5x10exp-3uA)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

T-2 N-2

Fig. 3B

Time (hr)

0 4 8 12 16 20 24 28 32

Fluorescence intensity (x3.5x10exp-3uA)

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

T-2+10 N-2+10

Fig. 3C ^{Time (hr)}

0 4 8 12 16 20 24 28 32

Fluorescence intensity (x3.5x10exp.-3uA)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

T-20 N-20

Fig. 4A ^{Time (hr)}

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Fluorescence intensity

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

T-2 N-2