國立立臺灣大學臨臨床動物醫學研究所 碩士論論文
Graduate Institute of Veterinary Clinical Science School of Veterinary Medicine
National Taiwan University Master Thesis
高免血漿應用於犬瘟熱患犬治療療效果之評估
The Therapeutic Efficacy of Hyperimmune Plasma in Canine Distemper Dogs
朱鳳軒 Feng-Hsuan Chu
指導教授﹕ 蘇璧伶 博士 闕玲玲玲玲 博士 Advisor: Bi-Ling Su, Ph. D Lin-Lin Cheuh, Ph. D
中華民國 101年年 8月
August, 2012
誌謝
兩兩年年多的研究所生涯結束了了，這是一段雖艱辛但充實的日子。首先要感謝我的 指導老老師，蘇璧伶老老師。感謝老老師在初稿撰寫之時，不不辭辛勞勞、日以繼夜的批改 我那雜亂亂無章的文字和內容，沒有老老師的辛勤指導也就沒有本論論文的完成。同時 也非常感謝老老師在我還是大學部學生時，就讓我感受到臨臨床病理理的樂樂樂樂趣與重新體 認到對待流流浪浪動物的正確態度度。就讀讀研究所期間，不不僅在獸醫臨臨床醫療療知識識上獲 得扎實且深刻的訓練練，也學習到老老師對待動物的真心與認真，讓我深刻體認到做 為臨臨床獸醫師應有的嚴謹態度度與關懷流流浪浪動物的使命。我會不不斷地充實自己，努 力力成為一位優秀的獸醫師，以不不負老老師的教導!同樣地，十分感謝我的另外一位 指導老老師，闕玲玲玲玲老老師。感謝老老師兩兩年年來來在病毒學、分子生物學與實驗室技巧上 的指導與幫助，還有對於我研究方向的指引與建議，使我得以順利利的完成本論論文。
感謝闕老老師總是耐心的教誨，並且時常的關心與鼓勵勵，使我總能繼續充滿力力量量的 往前邁進。
感謝財團法人國家動物實驗中心的梁梁鍾鼎副研究員，謝謝學長提供病理理方面所 需的材料料、技術與指導，學長總是不不嫌棄地十分友善且耐心的教導，尤其是最後 一段時間，學長百忙之中仍抽空大力力協助，使本論論文的病理理相關部分得以完善，
真的非常感謝學長的幫忙。感謝王金金和老老師在口試時的指導與鼓勵勵，還有統計學 方面的指正與協助。謝謝老老師!
此外，要大力力感謝仙瑩瑩學姊在論論文寫作上的協助，不不但犧牲門診時的休息時間，
繁忙的門診結束後還絞盡腦汁幫我熬夜審閱與修改，真的是千言萬語都都道不不出我 的感激，謝謝學姊!還有感謝仁帥學長詼諧的開導與建議，在極光時感受到學長 與學姊你們樂樂樂樂天與正面的生活處事態度度，總讓我能重新充滿電繼續往前!感謝家 妤學姊研究所期間的照顧與幫助，當時學姊一個人獨撐大局還要兼顧我們，辛苦 學姊了了!感謝澄憶與依妲學姊適時的鼓勵勵、關心與協助，讓我能安然度度過研一那 段徬徨的日子；感謝品辰辰與柏惠的陪伴，一同打拼互相協助，當我被卡在七樓樓作
實驗時也幫我分擔了了許多事情，讓我最終總算能順利利走完這條路路，謝謝你們，相 信你們都都能很順利利地完成學業，大步地朝自己的夢想邁進! 品辰辰加油，妳可以的!
感謝子庭學姊總是不不厭其煩的教導我實驗上的各種問題，讓從未做過基礎實驗的 我，能很快地熟悉各種實驗的步驟、技巧與原理理，同樣地也感謝立立恩學長與映庭 學姊總是耐心地幫我解惑。感謝敏琇與婉婷對於我實驗上的協助；感謝筱婷學姊、
琮斐、舒郁、琦琦對於工作上的分擔，你們大家也讓我生活中增加許多調劑和歡 樂樂樂樂。擔任 Intern 期間的夥伴:印庭、鴻偉、柏誌與依真，很高興能跟優秀的你們 合作，感謝你們的支持與協助，讓我能順利利度度過那段多頭燒的日子。感謝 Intern 期間外科與住院部各位學長姐們的指導，讓我獲益益良良多。感謝檢驗科的姜哥、安 怡學姐、羅羅敏、佩珊、家伶、雅凌凌和臆晴晴學姊與智堅學長在臨臨床診斷技術上的幫 助與照顧。感謝可可、小毛驢、妹妹、弟弟、旺旺、Golden、Lucky 等參參與治療療 可愛的狗兒們，讓我更更深地體會到生命的輕與重，因為你們研究才有了了意義。
親愛的老老媽，謝謝妳始終尊重與支持我的決定，給予我堅定的扶持與鼓勵勵；我 最愛的薏安，謝謝妳一直以來來的陪伴，給予我溫暖與奮鬥的原動力力；感謝薏安的 爸媽這段日子悉心的照顧與關心。因為有你們大家在背後無怨無悔的包容與支持，
我才得以完成學業，往夢想跨出一大步。謝謝大家，我終於畢業了了!
目錄錄---i
表次---iii
圖次---iv
中文摘要---v
Abstract---vii
第一章、序言---1
第二章、文獻探討---2
第一節、歷歷史背景---2
第二節、犬瘟熱病毒之介紹---2
2.2.1 分類類及特性---2
2.2.2 流流行行病學---4
2.2.3 傳播途徑與排毒模式---4
2.2.4 致病機制---5
第三節、感染犬隻病毒清除之免疫反應---7
第四節、臨臨床特徵---8
第五節、診斷---9
2.5.1 血液學檢查---9
2.5.2 腦脊髓液檢查---9
2.5.3 快速診斷試劑---9
2.5.4 免疫學診斷技術---10
2.5.5 病毒分離離---10
2.5.6 分子生物學技術---10
第六六節、治療療與預防---11
第三章、材料料與方法---13
第一節、動物來來源---13
第二節、血檢值與影像學診斷---13
第三節、巢式聚合酶連連鎖反應(Nested polymerase chain reaction,nPCR)寡核苷 酸引子之選擇---14
第四節、以RT-nPCR偵測CDV核酸---14
3.4.1、病毒RNA的萃取---14
3.4.2、反轉錄錄反應(Reverse transcription, RT) ---15
3.4.3、聚合酶連連鎖反應(Polymerase chain reaction) ---15
3.4.4、巢式聚合酶連連鎖反應(Nested polymerase chain reaction,nPCR)---15
3.4.5、以電泳分析聚合酶連連鎖反應---16
3.4.6、陽性病例例之判讀讀---16
第五節、高免血漿之製作---16
3.5.1、犬源血漿來來源---16
3.5.2、中和抗體力力價試驗---16
3.5.2.1、細胞及病毒---16
3.5.2.2、血清中和試驗 (Serum neutralization test) ---17
第六六節、組織病理理學診斷與免疫化學染色(Immunohistochemistry, IHC)---17
第七節、統計分析---17
第四章、結果---18
第一節、動物基本資料料---18
第二節、Group 1 RT-nPCR結果與臨臨床症狀狀之關聯聯性分析---18
第三節、高免血漿之治療療成效---18
第四節、四十隻犬瘟患犬之血檢值與影像學診斷分析---19
4.4.1 出現神神經症狀狀犬瘟患犬之血檢值與影像學診斷分析---19
4.4.2 從未出現神神經症狀狀犬瘟患犬之血檢值與影像學診斷分析---19
第五節、中和抗體力力價之影響---20
第六六節、Group1出現神神經症狀狀患犬之RT-nPCR結果與組織病理理學診斷分析-20 4.6.1 Group1中出現神神經症狀狀患犬存活組與死亡組之分析---20
4.6.2 Group1中出現神神經症狀狀死亡患犬之組織病理理學與免疫化學染色(IHC) 診斷結果---20
第七節 類類固醇給予時間之影響---21
第五章、討論論---23
參參考文獻---30
附表---43
附圖---59
附錄錄一---62
表次
表一：二十一隻接受高免血漿治療療之犬瘟熱發病犬(Group1)基本資料料---43
表二：十九隻未接受高免血漿治療療之犬瘟熱發病犬(Group2)基本資料料---44
表三：四十隻犬瘟熱發病犬之年年齡分布---45
表四：Group1 就診時各部位 RT-nPCR 結果與臨臨床症狀狀之關聯聯性---46
表五：四十隻犬瘟熱發病犬之存活率率率與死亡率率率結果---47
表六六：Group 1b 與 Group 2b 於就診時體溫與血液學結果---48
表七：Group 1b 與 Group 2b 於就診時二次性感染嚴重程度度分數數---49
表八：Group 1b 與 Group 2b 於就診時 RT-nPCR 結果---50
表九：Group 1a 與 Group 2a 於就診時體溫與血液學結果---51
表十：Group 1a 與 Group2 a 於就診時二次性感染嚴重程度度分數數---52
表十一：Group 1a 與 Group 2a 於就診時 RT-nPCR 結果---53
表十二：Group1 之中和抗體力力價、病毒清除時間與存活時間---54
表十三：Group 1b 中存活組與死亡組於出現神神經症狀狀當時 RT-nPCR 結果---55
表十四：Group 1b 之死亡患犬於死前 RT-nPCR 結果---56
表十五：Group 1b 之死亡患犬腦部之組織病理理學與免疫化學染色診斷結果---57
表十六六：Group 1b 之死亡患犬肺臟、腎臟、脾臟與消化道之免疫化學染色診斷 結果---58
圖次:
圖 1：四十隻犬瘟熱發病犬各組別間存活率率率與死亡率率率之比較---59 圖 2：編號 16、17 與 18 患犬小腦白質之組織病理理學與免疫化學染色診斷結果----60 圖 3：編號 19、20 與 21 患犬小腦白質之組織病理理學與免疫化學染色診斷結果----61
摘要
犬瘟熱(Canine distemper, CD)為一具高傳染力力與高致死率率率的疾病，臨臨床上造 成全身系統性感染，伴隨著免疫抑制，動物發病早期中和抗體力力價之高低會影響 疾病的結果，若若中和抗體力力價持續較低，病毒將無法被清除，進而感染中樞神神經 系統造成漸進性且多變的神神經症狀狀，出現神神經症狀狀的患犬通常會死亡，僅有少數數 能耐過。臨臨床上之治療療主要為對症支持治療療，但死亡率率率仍然很高。被動免疫被認 為能有效的控制疾病的惡惡化，然而目前並無實際應用於犬瘟熱患犬療療效的報告。
本研究目的為評估高免血漿應用於自然感染犬瘟熱患犬的臨臨床療療效。
本研究收集自 2009 年年 5 月至 2011 年年 7 月間，至台大動物醫院就診，以 RT-nPCR 方式確診為犬瘟熱感染之 40 隻患犬，根據治療療方式之不不同分為兩兩組 (Group)，進一步分析其治療療組合的效果。Group 1(n=21)為接受高免血漿與對症 支持治療療組，Group 2 (n=19)則為僅接受對症支持治療療組。總存活率率率在 Group 1 為63.6%，Group 2 則為 36.8%。比較兩兩組中出現神神經症狀狀患犬，group 1 與 group 2 的存活率率率分別為 50 及 7.7 %，且有統計上的差異異(p<0.05)。此外，Group 1 神神經 症狀狀發生率率率為36.4%，低於 Group 2 的 53.8%。Group 1 與 Group 2 於治療療期間才 出現神神經症狀狀患犬存活率率率分別為75%和 14.3%，兩兩組間存活率率率雖無顯著差異異 (p=0.088)，但呈現上升之趨勢。Group 1 中死亡的七隻患犬有六六隻於就診時已經 出現神神經症狀狀，此六六隻患犬進行行屍體解剖，免疫化學染色顯示各器官與腦中皆有 不不等程度度之病毒分布，其中五隻患犬(83.3%)腦部病理理結果歸類類於犬瘟熱中樞神神 經病程之急性期。曾有報告認為過度度的抗病毒體液免疫反應可能引發衛星脫髓鞘 效應，此現象於這些解剖的患犬病並未被發現。Group1 中出現神神經症狀狀時，其 存活組與死亡组的血液檢體陽性率率率分別為57%及 0%，兩兩組間血液檢體的陽性率率率 有統計上的差異異(p<0.05)。此外，發生神神經症狀狀同時仍有病毒血症的患犬其死亡 率率率為100%。
本研究證實合併給予高免血漿之治療療方式，能提升臨臨床上犬瘟熱患犬的存活 率率率，特別是出現神神經症狀狀的患犬。給予高免血漿能幫助病毒的清除，降降低神神經症 狀狀的發生率率率，因此確診為犬瘟熱感染後，及早合併給予高免血漿為一極佳的治療療 策略略。
Abstract
Canine distemper virus (CDV) is a highly contagious pathogen of dogs causing high mortality. CDV infection can result in a systemic infection with severe immunosuppression. The magnitude of neutralization antibody titers correlates with the outcome of the disease. The constant lack of effective neutralization antibodies causes viral persistence in early stage, and the virus will invade central nervous system (CNS) causing diversely and progressively neurological signs. Dogs with neurological signs usually die, only a few can survive. Supportive or symptomatic therapy is most recommended, however, the mortality of neurological distemper remain very high. Passive immunity was thought to be efficacious in control of disease; nevertheless, the efficacy was never demonstrated in vivo. The aim of this study was to evaluate the clinical efficacy of canine hyperimmune plasma in dogs with canine distemper.
Forty dogs confirmed with CDV infection by RT-nPCR, presented at the National Taiwan University Animal Teaching Hospital between May 2009 and July 2011, were enrolled in this study and divided into two groups for further analysis of different therapeutic combinations. Group 1 (21 dogs) was treated with combination of hyperimmune plasma and supportive therapy. 19 dogs were included in group 2 and were only treated with supportive therapy. The total survival rates were 63.6% and 36.8% in group 1 and group 2, respectively.
The survival rates of dogs with neurological signs were 50% and 7.7% in group 1 and group 2, respectively. The survival rate of dogs with neurological signs was significantly higher in group1 than in group2 (p<0.05). Furthermore, the incidence of neurological signs in group 1 was 36.4% and lower than in group 2 (53.8%). The survival rate of dogs appeared neurological signs during therapy was 75% and 14.3% in group 1and group 2, respectively. No
significant difference was found between the groups in survival rate (p=0.088), however, it existed an increasing trend. Six of the 7 non-survival dogs in group 1had presented neurological signs at presentation. The immunohistochemistry (IHC) examinations of the six autopsic dogs revealed different degrees of viral distributions in various organs and even in brain. According to pathological results of brain, five of them (83.3%) categorized to be acute stage of
neurological distemper. A reported side effect, eg. excessive antiviral humoral immune response might trigger the bystander demyelination, was not
observed in this study. In group 1, the positive detection rates of whole blood sample by RT-nPCR upon appearance of neurological signs were 57% in the non-survival group and none in the survival group. There was a significant difference between the two subgroups. In addition, the mortality of dogs presented neurological signs together with viremia was 100%.
In this study, treatment combined with canine hyperimmune plasma was demonstrated to increase survival rate of CDV-infection, especially the dogs have presented with neurological signs. Administration of hyperimmune plasma benefited to eliminate the virus and to decrease the incidence of neurological signs. Therefore, administration of hyperimmune plasma as soon as possible after confirmed diagnosis represents a good therapeutic strategy in the treatment of CD dogs.
第一章 序言
犬瘟熱(Canine distemper, CD)為犬瘟熱病毒所媒介之具高傳染力力與高致死率率率 的疾病。犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)，隸隸屬於黏液病毒科(family Paramyxoviridae)、麻疹病毒屬(genus Morbillivirus)，是具有封套的負向單股 RNA
病毒。在犬隻感染中，全年年齡均有感受性，以3-6 月齡的幼犬最具感受性，臨臨床 上會出現多系統性之症狀狀，如發燒、咳嗽、下痢痢、嘔吐皮膚、角膜結膜炎、皮膚 紅疹、關節炎等及黏液化膿性鼻分泌泌物等症狀狀。感染後良良好的體液免疫反應 (humoral immunity)與細胞媒介免疫反應(cell-mediated immunity)為清除犬瘟病毒 的關鍵，而中和抗體被認為是清除病毒顆粒粒與預測疾病預後的重要因子，感染後 抗體力力價之高低將影響病毒能否被清除，若若病毒無法被清除一直持續感染上皮與 淋淋巴組織，將進而感染中樞神神經系統造成漸進性且多變的神神經症狀狀，出現神神經症 狀狀之犬隻通常會死亡，僅有少數數能耐過。
臨臨床上對於犬瘟熱治療療方式為給予對症支持治療療，但死亡率率率仍然很高。一般 仍建議施打疫苗來來提高其防護力力。發病後，增加被動免疫的抗體力力價被認為是一 種有效的治療療方式，小鼠或貂在研究上給予抗血清或單株抗體的預防性治療療，也 能出現保護的作用，然而目前並無評估被動免疫治療療應用於臨臨床自然感染犬瘟熱 患犬療療效的報告。本研究欲使用高免血漿治療療自然感染犬瘟熱之患犬，評估其療療 效及探討可能之機制。
第二章 文獻探討 第一節 歷歷史背景
早於 1761 年年歐洲即首度度出現犬瘟熱(Canine distemper, CD)之報告，在 19 世 紀初Jenner 等人即對犬瘟熱的病程發展與臨臨床症狀狀做出詳細的病例例敘述(Lauder et al.,1954)，不不過其致病病原-犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)則至 20 世 紀初(1906 年年)，才被 Carré 鑑定出來來。目前本病為遍佈全世界的傳染性疾病，也 包括台灣地區。
第二節 犬瘟熱病毒之介紹 2.2.1 分類類及特性
犬瘟病毒基於病毒的型態、結構及基因上的特性被分類類歸納為副黏液病毒科 (family Paramyxoviridae)的麻疹病毒屬(genus Morbillivirus)，此麻疹病毒屬同時也 包含了了人的麻疹病毒(measles virus) 、牛瘟病毒(rinderpest virus) 、小反芻獸疫病 毒(pest des petits ruminants virus)、Porpoise distemper virus、Phocine
distemper virus、Dolphin distemper virus，且這些病毒在抗原性及病原性上也有緊 密的關聯聯性(Bolt et al., 1997; Hirama et al., 2004)；犬瘟病毒具有封套，其大小近 16 kb，為負向、單股、線型之 RNA 病毒。病毒粒粒子為多形性，但通常呈球形或 絲狀狀，直徑約150-300 nm(Sidhu et al., 1993; von Messling et al., 2003)。
犬瘟熱病毒基因體包含 6 段結構蛋白質基因，可轉譯成 6 種結構蛋白質，分 別為核蛋白鞘(Nucleoprotein, N)、磷酸蛋白質(Phosphoprotein, P)、基質蛋白質 (Matrix protein, M)、融合蛋白質(Fusion protein, F)、血球凝集素(Haemagglutinin, H) 與大蛋白質(Large protein,L) (Hirama et al., 2004; Rima et al., 1986)。N 蛋白質功用 為將基因體RNA 緊密包裹住。大蛋白質形成病毒 RNA 聚合酶，為病毒蛋白質 中最大的結構性蛋白質，大蛋白質與磷酸蛋白質連連結成L-P 蛋白質複合物，具有 轉錄錄酶的活性，可進行行病毒RNA 轉錄錄及複製等作用。病毒的封套由 F 蛋白質、
H 蛋白質及 M 蛋白質所組成(De Vries et al., 1988; Seki et al., 2003)。M 蛋白質可 調節病毒的轉錄錄與包裝，於病毒的組合(assembly)及出芽(budding)上扮演重要腳
色。F 蛋白質以不不活化的形式形成-F0 蛋白存在於新合成之病毒封套表面，具有 細胞融合作用，將病毒封套及宿主細胞膜黏合在一起，使感染細胞形成一個大而 多核的融合細胞(syncytium)。而藉由細胞融合，病毒可直接由一個細胞傳播至另
一個細胞，所以F 蛋白質於犬瘟病毒傳染之致病機制及持續感染上扮演著重要角
色，然而F0 蛋白質必須藉由宿主細胞的蛋白酶切切割成雙硫硫鍵連連結的 F1 及 F2 白
質才具有生物活性，而此切切割為病毒具有傳染性之必要條件。血球凝集H 蛋白
質也是位於病毒封套表面的醣蛋白質，可使病毒和細胞附著，進一步媒介和活化 F 蛋白質與細胞的融合，而在犬瘟病毒感染過程中，H 蛋白質為一主要免疫原，
可誘發中和抗體的產生，以抑制病毒與細胞受器結合，且此蛋白質所誘發的中和 抗體力力價比F 蛋白質所誘發的中和抗體力力價為高(Appel et al., 1982; De Vries et al., 1988; Hirayama et al., 1991; Murphy, 1999)，此外 H 蛋白質更更決定了了病毒對細胞的 趨向性，並能控制病毒在腦的星狀狀細胞之擴散(von Messling et al., 2001;
Wyss-Fluehmann et al., 2010)。P 基因除了了合成 P 蛋白質外，還會合成非結構性的 C 蛋白質及 V 蛋白質，P 蛋白質主要功用與 N 蛋白質的構成及伴隨 RNA 的合成 有關，C 蛋白質主要功用為使病毒能在周邊血液單核球細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中轉錄錄，V 蛋白質則與病毒 mRNA 的合成有關(Wakasa et al., 2000)。
犬瘟病毒只有一種血清型，但有報告認為不不同基因型(genotypes)的犬瘟病毒 具不不同的毒力力及細胞趨向性，例例如Snyder Hill 病毒株被認為與造成灰質腦炎有 關，而A75/17 病毒株則被認為能導致脫髓鞘腦炎(McCullough et al., 1974b;
McCullough et al., 1974a;Orlando et al., 2008)，日本也曾從爆發的犬瘟病犬中分離離 出不不同基因型的犬瘟病毒。
犬瘟病毒在宿主細胞內複製後由細胞膜出芽至細胞外，在低溫下較穩定，於 0-4 oC 下可保存數數週，若若於-70 oC 下可保存長達 7 年年以上。最適 pH 值範圍為 4.5-9 之間。其在一般環境中極不不穩定，乾燥高溫(50-60 oC，30 分鐘；37 oC，1 小時；
室溫下3 小時)、陽光、肥皂及其他化學藥品，如乙醚(ether)、氯仿(chloroform)、
0.75%苯酚(phenol)、0.5% 福福馬林林(formalin)及 0.3%四級銨
(quaternary ammonium compound)等皆可使其失去活性，喪失感染能力力(Koestner, 1975)。
2.2.2 流流行行病學
犬瘟熱病毒感染範圍廣泛，除了了犬隻之外，也可以感染許多肉食性動物及海 洋哺乳類類動物(Appel et al., 1994; Bolt et al., 1997; Hashimoto et al., 2001)，包含獅 子 (Panthera leo)、老老虎、浣熊(Lednicky et al., 2004a)、豹、狼狼、狐(Martella et al., 2002)、白鼻心(Paguma larvata)、石虎(Felis bengalensis)、鼬獾(Melogale moschata subauantiaca) (Chen et al.,2008;Ikeda et al.,2001)、雪猴(Yoshikawa et al.,1989)、恆 河猴(Zhao et al., 2010)及海豹(Phoca caspica) (Seibel et al., 2007; Wohlsein et al.,2007)都都有感染犬瘟病毒的病例例。
犬瘟熱全年年齡均有感受性(Moro et al.,2003)，以 3-6 月齡的幼犬最具感受性，
感染後約50-70%犬隻呈現不不顯性感染(subclinical infection)，感染後臨臨床症狀狀的 嚴重程度度受病毒的毒力力、感染時的年年齡、宿主的免疫狀狀態和環境壓力力影響 (Krakowka et al.,1980; Martella et al.,2008)。
自 1990 年年開始，世界各地於犬或野生動物均陸陸續爆發犬瘟熱的疫情或是犬 瘟熱的病例例數數增加之報告，而有些已接受完整定期疫苗接種的犬隻仍有被感染的 案例例報告(Hashimoto et al., 2001; Mochizuki et al.,1999)，也有研究指出在施打過疫 苗的犬隻身上檢測到犬瘟熱病毒；分離離出不不同於疫苗株的犬瘟熱病毒株(Jozwik and Frymus,2002; Lan et al.,2006b)。
2.2.3 傳播途徑與排毒模式
犬瘟熱病毒的傳染途徑以吸入為主，感染動物主要由口鼻分泌泌物排毒。急性 感染時無論論是否已出現臨臨床症狀狀，其任何分泌泌物或排泄物都都可能帶有犬瘟病毒 (Lednicky et al., 2004b;Sidhu et al., 1993; von Messling et al., 2003)。
2.2.4 致病機制
犬瘟病毒主要利利用與宿主細胞上的 CD150/SLAM(signaling lymphocyte activation molecule, SLAM)受器之結合來來進入細胞，此受器表現於胸腺細胞、活 化的淋淋巴球、巨噬細胞以及樹突細胞上(dendritic cells)(Ono et al., 2001)。犬瘟病 毒感染的致病機制可分為全身性感染及中樞神神經系統感染兩兩大部分：
一、全身性感染：犬瘟病毒感染以飛沫為主途徑，病毒侵入呼吸道上皮後，
24 小時內會於上呼吸道組織中的巨噬細胞內複製，之後隨局部淋淋巴循環至咽咽喉 上的扁桃腺及支氣管淋淋巴結，接著於其中的巨噬細胞及單核球內大量量複製(Appel, 1970)，感染後 3-6 天開始出現第一次毒血症，會伴隨發燒的情形，此時病毒經 淋淋巴管與血液擴散到全身的淋淋巴組織內進一步複製，並破壞淋淋巴組織，這些淋淋巴 組織包含脾臟淋淋巴濾濾泡、胃及小腸黏膜固有層(lamina propria)、腸繫膜淋淋巴結及 肝臟庫弗氏細胞(Kupffer’s cell) (Appel, 1970; Wright et al., 1974)，使患犬併發淋淋巴 球減少(lymphopenia)及持續長時間的免疫抑制現象(Appel,1969; Krakowka et al., 1980,1982)。T 細胞較 B 細胞容易易被感染，Ｔ細胞中又以 CD4+淋淋巴球會因感染 而快速減少並持續數數週，CD8+淋淋巴球之減少則較不不嚴重，且相對也較快恢復復 (Tipold et al.,2001)。感染後 8-9 天，會再出現第二次毒血症並伴隨高燒的現象，
大量量的病毒透過血液循環散佈至全身上皮細胞與神神經系統，造成多系統性的臨臨床 症狀狀，同時也可能因免疫抑制導致二次性細菌感染，使病情惡惡化(Appel,1969;
Appel and Gillespie,1972; Blixenkrone-Møller, 1989; Blixenkrone-Møller et al.,1989;
Okita et al.,1997)。
二、中樞神神經系統感染：病毒進入神神經系統最主要的路路徑是由白血球相關之 血源性感染(hematogenous infectivity)(Rockborn, 1958; Summers et al., 1979)，感染 後5-6 天，即可在中樞神神經系統的微血管與小靜脈內皮偵測到病毒抗原的存在；
感染後8 天可在圍管的淋淋巴球、星狀狀細胞的軸突(astrocytic foot processes)偵測到 抗原的存在(Summers et al., 1987)，感染後 10 天，病毒會在脈絡叢上皮細胞 (choroid plexus epithelium)大量量複製並釋放新病毒(progeny virus)到腦脊髓液中，
緊接著會感染室管膜細胞(ependymal cells)，再擴散到室管膜下的白質部
(Vandevelde et al.,1985 b)。另有文獻提出可能除了了血行行方式外，有感染 CNS 的其 他途徑，實驗感染之貂被發現犬瘟病毒利利用嗅神神經進入中樞神神經系統，但有關自 然感染犬隻是否也可經由此方式進入中樞神神經系統則還未被證實(Beineke et al., 2009;Rudd et al., 2006）。此外有報告認為病毒與抗體結合所產生之免疫複合體的 沉積，會對血腦障壁(blood-brain barrier)造成破壞，有助於病毒與免疫細胞進入 中樞神神經系統，導致後期脫髓鞘損傷的惡惡化(Beineke et al.,2009;Frisk et al., 1999;
Greene and Appel, 2012)。
犬瘟病毒進入 CNS 後造成損傷之病程大致可分為急性期(Acute stage)和慢性 期(Chronic stage)。急性期之髓鞘損傷約始於感染三週後，通常伴隨有嚴重的免 疫抑制，此急性期之髓鞘損傷會持續至感染約6-7 週待免疫系統開始恢復復之後即 逐漸進入慢性期。急性期之病理理特徵為缺乏圍管現象(Perivascular cuffs)，損傷處 沒有免疫細胞的浸潤，病灶為病毒本身直接所造成的非發炎性破壞(Vendevelde et al.,1982;Vandevelde and Zurbriggen,2005)。因此急性期髓鞘損傷的形成與被感染 的神神經細胞種類類有關，其中受感染的寡樹突細胞(Oligodendrocytes)及小膠質細胞 (Microglial)被認為與急性期之脫髓鞘損傷最具關聯聯性。文獻指出寡樹突細胞會因 病毒的感染而使代謝作用出現異異常，進而導致脫髓鞘(demyelination)。不不過因為
整個腦中被感染的寡樹突細胞小於10%，而脫髓鞘的損傷卻幾乎遍佈整個神神經系
統，所以學者認為受感染的寡樹突細胞會造成部分髓鞘脫失。(Glaus et al.,1990;Graber et al.,1995;Schobesberger et al.,2002; Vandevelde and
Zurbriggen,2005)。而造成廣泛神神經損傷的主因則是小膠質細胞此時會被活化，提 高吞噬能力力與釋放氧自由基(oxygen radical)，進而造成寡樹突細胞與髓鞘的廣泛 傷害(Botteron et al.,1992;Griot-Wenk et al.,1991)。慢性期之髓鞘損傷約發生於感染 6-7 週後，當免疫系統恢復復時，在原先急性期損傷處會開始出現圍管現象
(Perivascular cuffs)，出現淋淋巴球(Lymphocytes)、漿細胞(Plasma cells)與單核球 (Monocytes)的浸潤，此時會因發炎反應而進一步造成髓鞘的損傷(Vendevelde et
al.,1981)。慢性病程階段造成神神經損傷之發炎反應機制主要為衛星效應(Bystander mechanism)，其機制為與持續感染犬瘟病毒的腦細胞接合的抗犬瘟病毒抗體或是 抗犬瘟病毒的抗體-病毒免疫複合物(Immune complexes)，會與附近的巨噬細胞 (Macrophage)產生作用，刺刺激巨噬細胞釋放出氧自由基及毒素，破壞寡樹突細胞 及髓鞘，導致嚴重的脫髓鞘損傷(Botteron et al.,1992;Burge et al.,1989;Griot et al.,1989)。此外也有文獻推測補體依賴性的抗體媒介之體液細胞毒殺殺作用 (complement-dependent antibody mediated humoral cytotoxicity) (Vandevelde et al.,1982, 1986)與抗體依賴性 T 細胞媒介之細胞毒殺殺作用(antibody-dependent T-cell mediated cytotoxicity) (Vandevelde et al., 1982; Alldinger et al.,1996;
Wu¨nschmann et al., 1999)也可能是慢性階段造成脫髓鞘傷害之機制。
第三節 感染犬隻病毒清除之免疫反應
病毒的清除分為體液免疫反應(humoral immunity)與細胞媒介免疫反應 (cell-mediated immunity)兩兩部分。體液免疫反應的強弱與病程發展具有相關性，
若若缺乏有效的體液免疫反應，將導致急性且致命的結果。一般而言，在感染初期 會先產生具有保護力力的抗病毒N 蛋白抗體(anti-viral nucleoprotein antibodies)，感 染10-14 天後開始產生中和抗體，包含抗病毒 H 與 F 封套蛋白抗體(anti-viral H and F protein specific antibodies)，其作用為中和細胞外游離離之病毒顆粒粒，並抑制病毒 在細胞間之散佈，當病毒進入細胞後，中和抗體則需要補體協助進行行補體媒介之 體液細胞毒殺殺作用(complement-mediated humoral cytotoxicity)清除被感染的細胞，
因此此時抗體力力價之高低將影響病毒能否被清除，可用來來預測病程發展之結果 (Appel et al., 1982; Beineke et al., 2009; Ho and Babiuk, 1980; Krakowka et al., 1975;
Miele and Krakowka, 1983)，且其中的抗病毒 H 蛋白抗體，能預防中樞神神經損傷 的發生(Rima et al.,1991)。中和抗體於疾病早期較能有效地清除病毒，在晚期組 織器官已被大量量病毒感染後，並無法完全把病毒清除，此時需依靠細胞媒介免疫 反應幫助清除病毒。細胞媒介免疫反應的抗病毒之淋淋巴球媒介細胞毒殺殺作用
(lymphocyte-mediated cytotoxicity)可有效地將感染細胞內的病毒清除，因此此作 用的缺乏或延遲會使病毒持續存在中樞神神經系統(Krakowka and Wallace, 1979;
Shek et al., 1980; Appel et al., 1982)。
第四節 臨臨床特徵
感染犬瘟熱病毒後，其潛伏期約 1 至 4 週，臨臨床上會出現多系統性
(multisystemic)之症狀狀。感染後 3-6 天會出現第一次發燒，且有輕微之非特異異性 之臨臨床症狀狀包含食慾不不振、倦怠、漿液性眼鼻分泌泌物增加、扁桃腺炎與淋淋巴球減 少(Appel et al., 1982; Krakowka et al., 1980)，於感染後 6-9 天病毒開始散佈至各器 官之上皮組織，並於數數天後出現第二次發燒，並開始發展成更更嚴重與較具特異異性 之臨臨床症症，包括咳嗽、下痢痢、嘔吐、皮膚、角膜結膜炎、皮膚紅疹及關節炎等 (Kim et al., 2001b;Okita et al., 1997; von Messling et al., 2003;Wright et al., 1974)，
此時患犬容易易因二次性細菌感染造成肺炎，漿液性眼鼻分泌泌物也會因感染轉為黏 液化膿性。
動物感染後若若能誘發較強之免疫反應，特別是病毒特異異性中和抗體增加，可 將病毒從組織中清除，此時患犬有可能恢復復；但若若免疫反應不不佳，病毒將會持續 感染上皮與淋淋巴組織，進而感染中樞神神經系統造成漸進性且多變的神神經症狀狀 (Parker, 1978;Greene and Appel, 1998;Schobesberger et al., 2005)。而出現神神經症狀狀 之犬隻通常會死亡，僅有少數數能耐過，因此神神經症狀狀的出現與否為評估本疾病預 後及感染後是否能恢復復的最重要指標(Beineke et al., 2009; Vandevelde and
Zurbriggen, 2005)。當病原進入中樞神神經系統會造成急性脫髓鞘腦炎，常見見之神神 經症狀狀包括肌震孿(myoclonus)、嚼口香糖糖樣癲癇(chewing gum seizures)、共濟失 調(ataxia)、迴旋運動(circling)、感覺過敏(hyperesthesia)、肌肉僵硬(muscle rigidity)、
疼痛、恐懼及癲癇(seizures)等，耐過犬隻也可能出現終身肌震孿之後遺症(Beineke et al., 2009; Vandevelde and Zurbriggen, 2005)。不不顯性感染及耐過急性全身性症狀狀 之犬瘟熱患犬，神神經症狀狀亦可能出現於復復原後數數週或數數月(Raw et al., 1992)，因
此即使患犬從全身性症狀狀復復原後亦要注意仍可能會出現神神經症狀狀。此外神神經症狀狀 也會出現於無全身性感染病史，且曾施打過疫苗之免疫不不全的成年年犬隻(Jozwik and Frymus,2002)，另外也有報告指出少數數病例例於接種減毒疫苗後出現包涵體腦 炎的情形(Hartley, 1974)。因此在施打疫苗前須詳細評估犬隻的健康狀狀況，以利利疫 苗的施打能產生最適當之免疫反應。
第五節 診斷
犬瘟熱可依據臨臨床症狀狀、血液學檢查與腦脊髓液檢查來來幫助進行行鑑別診斷，
另外則可使用快速診斷試劑、免疫診斷技術、病毒分離離、分子生物技術及病理理學 來來進行行確診。
2.5.1 血液學檢查
可能出現淋淋巴球減少(lymphopenia)及嗜中性球輕微上升之情形。血液抹片、
Buffy coat 及骨髓抹片經 Wright-Leishman 染色後可能發現嗜酸性包涵體，主要存 在於淋淋巴球，而單核球、嗜中性球及紅血球也可能會出現。淋淋巴球內之包涵體大 小約3 μm，呈卵卵圓形且常單一出現，而出現於紅血球中之包涵體則較小，呈圓 形且數數目較多(Greene and Appel, 1998)。血液生化指數數則不不具特異異性。
2.5.2 腦脊髓液檢查
一般在懷疑中樞神神經系統受到感染或是出現神神經症狀狀時做此檢查，結果與炎 症反應相關，其腦脊髓液中的蛋白質濃度度會增加(>25 mg/dl)、細胞數數亦會增加且 以淋淋巴球為主(> 10 cells/μl)。
2.5.3 快速診斷試劑
利利用商品化套組檢測病毒抗原，取疑似感染犬隻之血清、全血、眼鼻分泌泌物、
唾液或尿尿液等，依操作手冊與試劑混合後，滴入免疫色層分析盤
(immunochromatographic kit)中靜待數數分鐘即可判讀讀結果，但此檢測方式之敏感性
較低。
2.5.4 免疫學診斷技術
包括免疫螢光分析(immunofluorescence assay,IFA)、酵素連連結免疫吸附分析 (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫組織化學染色
(immunohistochemistry, IHC)。IFA 可利利用單株或多株抗體直接運用於臨臨床上的眼 結膜、鼻腔黏膜及陰道抹片，不不過此方法有其侷限性，容易易有偽陰性的情形產生 (Jozwik and Frymus, 2005)。而 ELISA 檢測方面可區分為抗犬瘟病毒抗體 IgM 及 犬瘟病毒抗原的檢測兩兩種，在Soma 等人的報告中分別比較檢測血清中抗原及 IgM 之敏感性，其結果在 IgM 之檢測為陰性的 10 個病例例中，仍有 3 個病例例被檢 測出犬瘟病毒抗原，因此文獻指出利利用ELISA 檢測犬瘟病毒抗原比抗犬瘟病毒 抗體IgM 具有較高的敏感性(Gemma et al., 1995; Soma et al., 2003; von
Messling et al., 1999)。利利用 IHC 檢測犬瘟病毒抗原的文獻相當多，但因發病犬隻 身體狀狀況不不適合接受麻醉，所以此方法較少運用於臨臨床來來診斷犬瘟熱，而於患犬 之皮膚、鼻黏膜及腳墊等生檢樣本有相當高的檢出率率率(Haines et al., 1999; Liang et al., 2007)。
2.5.5 病毒分離離
可使用感染的動物組織或將血液低速離離心後取其 buffy coat 與有表現 CD150/SLAM 的細胞共同培養即可分離離出病毒，但此檢驗十分耗時較不不適用於 臨臨床之診斷。
2.5.6 分子生物學技術
此技術常利利用於流流行行病學的研究，RT-PCR、RT-nPCR 及原位雜交技術(in situ hybridization, ISH )被最為廣泛使用(Frisk et al., 1999; Shin et al.,2004)。一般皆在 犬瘟病毒的Ｎ或Ｐ基因設計具特異異性引子對進行行檢測，其中以RT-nPCR 之敏感 性較高(Jozwik and Frymus, 2005)。臨臨床上可檢測之檢體包涵腦脊髓液、全血、唾
液、尿尿液與眼結膜、鼻腔、咽咽喉、陰道及直腸拭子。一般RT-nPCR 的增幅極限 為1 TCID50(50 % of tissue culture infectious dose)，且於注射完犬瘟熱疫苗後 14 天即偵測不不到病毒，藉此可區別疫苗引起的偽陽性反應(Kim et al., 2001b)；近年年 有研究結合多引子對(multiplex)進行行 RT-nPCR 可區分疫苗株和野外株(Si et al., 2010)。雖然 ISH 的診斷具有高特異異性與敏感性，但由於操作費時且不不適用於動 物生前之診斷，因此此技術多用於探討病變之機制(Grone et al., 2003; Moro et al., 2003)。
第六六節 治療療及預防
雖然有非常多針對犬瘟熱的研究文獻發表，但臨臨床上對於犬隻犬瘟熱治療療方 式的建議至今仍無太大的改變，通常為給予支持治療療(supportive care)、對症治療療 (symptomatic management)以及抗生素治療療二次性細菌感染，不不過其治療療效果有 限，且無法預防或降降低神神經症狀狀之出現，而於神神經症狀狀出現後，無有效之治療療方 式，通常病情將只會逐漸惡惡化，造成死亡。
此外有學者認為利利用被動免疫方式能保護動物對抗病毒感染，其中與犬瘟病 毒同屬的麻疹病毒及立立百病毒使用抗血清或是抗H 單株抗體進行行預防性治療療，
對於實驗感染的小鼠或倉鼠具有保護能力力(Giraudon and Wild,1985;Guillaume et al.,2004;Hathaway et al.,1998)。犬瘟病毒的研究中，在 in vitro 顯示相對較高的中 和抗體力力價能降降低病毒的毒力力與散佈能力力；在in vivo 方面，以腹腔預防性投予 anti-H 單株抗體於實驗感染犬瘟病毒小鼠，顯示具有 100%保護力力(Hirayama et al.,1991; Ho and Babiuk,1979; Wyss-Fluehmann et al.,2010)，中和抗體主要包含的 就是anti-F 與-H 抗體，所以被動提供患犬中和抗體應為一具潛力力的犬瘟熱治療療 方式，但這些文獻皆僅限於細胞學或是實驗感染小鼠上的研究，目前仍無評估被 動免疫應用於臨臨床自然感染犬瘟患犬療療效的報告。
預防方面，於 1950 年年代即發展出減毒的疫苗，犬瘟熱疫情受到有效的控制，
但常因一些因素造成疫苗免疫失敗，造成失敗的可能原因包含不不當的疫苗計畫、
疫苗保存不不當、移行行抗體干擾、施打疫苗前已被感染、流流行行之病毒株與疫苗株不不 同(Lan et al., 2006b; Martella et al., 2008)，以及犬隻因緊迫或是有其他併發症而使 免疫力力下降降(Krakowka et al., 1982; Max and Appel,1978)等因素。另外有報告提出 急性腦炎會發生在少數數接種減毒疫苗後之病例例，推測可能原因為減毒馴化不不完全 或接種犬隻注射疫苗時剛好處於免疫抑制之情況。目前建議幼犬最佳接受疫苗免 疫年年齡為6-8 週齡，之後 2-4 週為周期進行行補強，直至 16 週齡為止，若若從 6-8 週齡開始施打疫苗，至16 週齡的期間共會接受 4 次疫苗注射；大於 16 週齡犬隻，
初次注射疫苗完，2-4 週再進行行補強一次即可。首次疫苗計畫結束之後，依使用 的疫苗種類類與居住環境之不不同，每1 至 3 年年補強注射一次(Gore et al., 2005; Green et al.,2012; Martella et al., 2008)。
第三章 材料料與方法 第一節 動物來來源
自 2009 年年 5 月至 2011 年年 7 月間，至台大動物醫院就診之患犬，臨臨床上出現 發燒、呼吸道、消化道及神神經症狀狀等疑似犬瘟熱感染病例例，採集全血、尿尿液、眼 結膜、鼻腔、口腔及直腸拭子等各種檢體，以RT-nPCR 方式偵測確定病毒核酸 存在，藉此確診為犬瘟熱感染病例例。
此期間共有 55 例例確診病例例，排除確診後沒有於台大動物醫院接受任何治療療 或因經濟因素中途停止接受治療療之15 例例患犬，總計 40 隻患犬納入本研究進行行統 計分析，根據治療療方式之不不同與神神經症狀狀出現之狀狀態，將40 隻犬瘟患犬分為下 列列幾組(Group)：
第二節 血檢值與影像學診斷
21 隻接受犬源高力力價免疫血漿治療療之犬瘟患犬，依據是否出現神神經症狀狀與 病程階段之不不同，進行行一系列列血檢、RT-nPCR 檢測與臨臨床肺炎感染嚴重程度度之比 較，血檢項目包含血液學(全血球計數數與白血球分類類)及血清生化學(albumin、total protein、ALT、AST、ALP、BUN、creatinine、glucose、Na+、K+、Cl-)，RT-nPCR 為採集全血、尿尿液、眼結膜、鼻腔、口腔及直腸拭子等六六個部位檢體進行行檢測，
連連續兩兩週病毒檢測皆為陰性者定義為清除病毒，血檢時間與RT-nPCR 檢測包含 初次就診，開始治療療後7 ± 3 天、14 ± 3 天、21 ± 3 天、28 ± 3 天、35 ± 3 天的檢驗值與檢測結果，並分別定義為治療療後一週(1 week after treatment)、治療療 後兩兩週(2 week after treatment)等以此類類推。全身性發炎反應與肺炎感染嚴重程度度 分級依下列列兩兩個項目計分：白球總數數與肺部影像學之肺炎嚴重程度度。白血球總數數 Group
1(n=21) 接受高免血漿治療療及對症支持治療療
1a(n=7) 從未出現神神經症狀狀者
1b(n=14) 於就診時或是治療療期間出現神神經症狀狀者
2(n=19) 僅接受對症支持治療療
2a(n=6) 從未出現神神經症狀狀者
2b(n=13) 於就診時或是治療療期間出現神神經症狀狀者
17000-25000 為一分、25000-35000 為兩兩分、35000-45000 為三分；肺炎嚴重程度度：
一個肺葉葉被侵犯為一分、兩兩個肺葉葉被侵犯為兩兩分、三個肺葉葉被侵犯為三分、大於 四個肺葉葉被侵犯為四分。存活時間的計算為自犬隻就診起至動物自然死亡，或因 神神經症狀狀惡惡化而極度度痛苦進行行安樂樂樂樂死的時間。
第三節 巢式聚合酶連連鎖反應(Nested polymerase chain reaction,nPCR)寡核苷酸 引子之選擇
犬瘟病毒在 N 及 P 基因的保留留性相當高，因此有關犬瘟病毒核酸診斷的報 告皆在犬瘟病毒的N 或 P 基因設計特異異性引子對進行行檢測(Jozwi and
Frymus,2005;Kim et al.,2001a;Rzezutka and Mizakz,2002)。本實驗室先前已將所有 建檔於NCBI 上的犬瘟病毒之 P 基因序列列以 DNAstar 作為序列列分析比對，確定唯 一相同的序列列區域，設計四條引子，如下表所示：
CDV Onderstepoort, strain (AF378705)
第四節 以 RT-nPCR 偵測 CDV 核酸 3.4.1 病毒 RNA 的萃取
將溶於DEPC 水的拭子檢體、全血及尿尿液，取 300 μl 加 1ml Trizol reagent 劇烈烈震盪(vortex mixer)，再加入 200 μl chloroform (Merk)，劇烈烈搖動後於室溫靜 置2 分鐘，然後於 4 oC，以 12000 X g 離離心 10 分鐘。離離心後取出最上層水 500 μl，
加入等體積之isopropanol (Merk)至一新的 1.5 ml 微量量離離心管，溫和混合後，置 入-20 oC 冰箱並靜置 15 分鐘使核酸沉澱。以 12000 X g，4 oC 下離離心 15 分鐘後，
Primer
Nucleotide sequence (5’ 3’) Nucleotide
position Product size
PF4 ACTGGGGATATTCTTTCG 2301-2318
543 bp
PR4 TCAGTCTCTCCTTTAAGC 2824-2841
PF5 GCATGCTGATGGAAGAGG 2349-2366
305 bp
PR5 TTTCTGGGTCATCTTTGC 2636-2653
小心將上清液移除並加入1 ml 之 75%酒精精(ethanol)(Merck)，以移除核酸沉澱物 中之多餘鹽類類，經12000 X g4 oC 下離離心 5 分鐘後，並小心移除上清液，將 RNA pellet 以真空抽氣風乾。待乾燥後加入 11μl RNase-free water DEPC 水將 RNA pellet 溶解。
3.4.2 反轉錄錄反應(Reverse transcription, RT)
將溶於 11 μl DEPC 水中之 RNA 置入 0.6 ml 微量量離離心管，加入 1 μl 之 oligo dT 作為反向引子，並加入 4 μl 15x First-Strand Buffer (Invitrogen)、2 μl 0.1 M Dithiothreitol (DTT) (Invitrogen)、2.5 μM dNTP (GeneDirex)及 200 單位之 Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Invitrogen)後，以核酸 增幅器(Thermo cycler)進行行 RT，條件如下：
37 oC 反應 60 分鐘，72 oC 作用 15 分鐘將反轉錄錄酶不不活化以中止反應，94 oC 作用5 分鐘將核酸變性(denaturation)後，快速降降溫並維持於 4 oC 待進行行聚合酶鏈 鎖反應。
3.4.3 聚合酶連連鎖反應(Polymerase chain reaction)
將 1) 2 μl cDNA、2) 5μM 0.5 μl 的 PF4 引子、3) 5 μM 0.5 μl 的 PR4 引子、4) 2.5 mM dNTPs 1 μl (Viogene)、5) 3 μl Taq DNA polymerase 10x buffer(Viogene)、6) 0.5 μl Taq DNA polymerase (2 unit/μl) (GenePure)、7)加水至 30 μl，混合均勻後短暫離離 心，置於PCR 機器(Termal cycler)中進行行反應，以 94 oC 3 分鐘將核酸變性，接著 於94 oC 20 秒使 DNA 變性、57 oC 20 秒使特異異性引子黏合(annealing) 、72 oC 25 秒進行行延展反應(extension)並循環 35 次，最後於 72 oC 延展反應 5 分鐘，之後置 於4 oC 保存待後續使用於巢式聚合酶連連鎖反應(Nested polymerase chain
reaction,nPCR)
3.4.4 巢式聚合酶連連鎖反應(Nested polymerase chain reaction,nPCR)
取 1) 1 μl PCR 產物、2) 5μM 0.5 μl 的 PF5 引子、3) 5 μM 0.5 μl 的 PR5 引子、
4) 2.5 mM dNTPs 1 μl (Viogene)、5) 3 μl Taq DNA polymerase 10x buffer(Viogene)、
6) 0.5 μl Taq DNA polymerase (2 unit/μl) (GenePure)、7)加水至 30 μl，混合均勻後 短暫離離心，置於PCR 機器(Termal cycler)中進行行反應，以 94 oC 3 分鐘將核酸變性，
接著於94 oC 20 秒使 DNA 變性、57 oC 20 秒使特異異性引子黏合(annealing) 、72 oC 20 秒進行行延展反應(extension)並循環 35 次，最後於 72 oC 延展反應 5 分鐘，最後 置於4 oC 保存，待用於電泳分析。
3.4.5 以電泳分析聚合酶連連鎖反應
取 400 μl TBE buffer 加入 Mupid-2 (Cosmo Bio Co., ToKyo, Japan)水平電泳 槽中，加入20 μl (10mg/ml)溴化乙錠(Ethidium bromide, EtBr)，將泡好含 0.5 mg/ml EtBr 的 1.5% 洋菜膠(Agarose, Amresco)置入電泳槽中，取 10 μl 的 nPCR 產物加 入2 μl 的 6x loading dye 混合後注入洋菜膠中，並於電泳膠單或雙側注入 5 μl (100!g/ml)的 100 bp DNA marker ladder (GeneTeks BioScience)，以電壓 100 伏特 電泳30-40 分鐘後，在波長 312 nm 紫外燈下觀察並拍照。
3.4.6 陽性病例例之判讀讀
同一臨臨床疑似犬瘟熱病例例所送之檢體中，若若有任一檢體經 RT-nPCR 增幅出 預期305 bp 大小之犬瘟熱病毒 P 基因核酸片段，即判讀讀為感染犬瘟熱陽性病例例。
第五節 高免血漿之製作 3.5.1 犬源血漿來來源
選取健康且體重大於 25 公斤犬隻作為捐血狗，定期施打疫苗和健康檢查，
年年齡從1 歲至 6 歲不不等，於疫苗施打一個月後，每隻捐血犬收集 250 至 500 ml 全血，在無菌操作下，將全血以2500 rpm，4 oC 下離離心 30 分鐘後，收集上層血 漿注入無菌空血袋中，留留取約1 ml 血漿測定其中和抗體力力價，其餘置於-20oC 儲 存，以供臨臨床試驗使用。
3.5.2 中和抗體力力價試驗 3.5.2.1 細胞及病毒
B95a 細胞於 37oC，含 5% CO2 之環境下，以含有 10%胎牛血清(Fetal
bovine serum, FBS) (HyClone, Thermo Fisher Scientific)、100 IU/ml penicillin (Thermo Fisher Scientific)、100 μg/ml streptomycin (Thermo Fisher Scientific)之 RPMI medium 1640 (Gibco)進行行培養。所使用之病毒株為第 9 代之 NTU2005-2。
其細胞和病毒培養方法皆參參考先前文獻所述(Liang et al., 2008)。
3.5.2.2 血清中和試驗 (Serum neutralization test)
將所取得之血清於56 oC 作用 30 分鐘，進行行非動化(heat inactivation)去除補 體等可能之影響。先將B95a 細胞種於 96 孔盤，待 24 小時候進行行血清中和試驗。
取50 μl 血清以等量量含 2% FBS 之 RPMI medium 1640 進行行連連續兩兩倍稀釋，再與 50 μl 之 100 TCID50 (tissue culture infective dose 50%) 病毒液進行行混和經 37 oC，
5% CO2培養箱感作1 小時，把已接種細胞之 96 孔盤內培養液去除後，將此混和 液(mixture)接種至 96 孔盤，置入 37 oC，5% CO2培養箱培養5-6 天後，觀察每個 well 中之 CPE 出現情況，進行行中和抗體力力價之判定。
第六六節 組織病理理學診斷與免疫化學染色(Immunohistochemistry, IHC)
本研究接受高免血漿治療療死亡之患犬共六六隻，於死後進行行屍體解剖，採取其 大腦、小腦、脾臟、腎臟、肺臟與消化道進行行組織切切片染色與免疫化學染色，其 組織器官處理理方式與染色方法參參考先前文獻所述(Liang et al, 2007)。
第七節 統計分析
本研究中之各項血檢值取其平均值與標準差作為結果之呈現，統計分析軟體 使用SPSS 18.0 商業軟體 (SPSS 公司、芝加哥市、伊利利諾諾斯州、美國)。血檢值 比較使用Student’s t test。存活率率率與死亡率率率比較使用 Chi-square test，P 值小於 0.05 即達統計學之顯著水準，若若期望值小於5，則使用 Fisher’s exact test，P 值小於 0.05 即達統計學之顯著水準。
第四章 結果 第一節 動物基本資料料
接受高免血漿治療療的 Group1(n=21)，詳細基本資料料列列於表 1，其中 9 隻為公 犬(42.9%)，12 隻為母犬(57.1%)，10 隻(47.6%))為小於六六個月的幼犬，11 隻(52.4%) 為大於十二個月的成犬，未接受高免血漿的Group2(n=19)，詳細基本資料料列列於表 2，其中 8 隻為公犬(42.1%)，11 隻為母犬(57.9%)，10 隻(52.6%)為小於六六個月的 幼犬，1 隻(5.3%)為介於 6-12 個月的幼犬，8 隻(42.1%)為大於十二個月的成犬。
總計本研究 40 隻患犬，20 隻(50%)為小於六六個月的幼犬，1 隻(2.5%)為介於 6-12 個月的幼犬，幼犬平均年年紀為3.59 月齡，19 隻(47.4%)為大於十二個月的成犬，
成犬去除4 隻收容所來來源不不知確切切年年齡之患犬，其平均年年紀為 49.1 月齡。其再 依神神經症狀狀之有無分組，各組別存活與死亡患犬之間幼犬和成犬所占比率率率如表3 所示。同時混合感染其他病毒方面，接受高免血漿治療療的Group1 14 隻患犬(77.8%, n=18)同時感染犬小病毒，4 隻患犬(100%, n=4)同時感染犬冠狀狀病毒。Group 2 則 未進行行其他病毒混合感染之檢驗。
第二節 Group 1 RT-nPCR 結果與臨臨床症狀狀之關聯聯性分析
就診時 Group 1 RT-nPCR 陽性率率率方面，鼻腔拭子為 85.7%(n=21)，眼結膜拭 子為81%(n=21)，直腸拭子陽性率率率為 81%(n=21)，口腔拭子為 57.1%(n=21)，血 液檢體為36.4%(n=21)，尿尿液檢體為 63.6%(n=20)。各部位檢體的 RT-nPCR 結果 與其對應位置之臨臨床症狀狀發生率率率方面，結果顯示鼻腔拭子陽性且同時有呼吸道症 狀狀之比率率率為94.1%，眼結膜拭子陽性且同時有眼膿之比率率率 64.7%，直腸拭子陽性 且同時有消化道症狀狀之比率率率41.2%，尿尿液檢體陽性且同時有神神經症狀狀之比率率率 63.6%。各部位檢體的 RT-nPCR 結果與其對應位置之臨臨床症狀狀發生率率率皆無顯著差 異異。詳細結果列列於表4。
第三節 高免血漿之治療療成效
Group1(n=21) 與 Group2(n=19)皆接受包含抗生素、輸液等對症支持治療療，
Group1 另外給予靜脈持續注射高免血漿，Group2 則未給予高免血漿。
接受高免血漿治療療之 Group1 存活率率率為 63.6%，沒有接受高免血漿治療療之 Group 2 存活率率率則為 36.8%；Group1 有出現神神經症狀狀之患犬（Group 1b,n=14）存 活率率率為50%，Group 2 中有出現神神經症狀狀之患犬(Group 2b,n=13)存活率率率為 7.7%，
其存活率率率有統計上之顯著差異異，詳細結果列列於表5 與圖 1。Group1 於就診時沒有 出現神神經症狀狀之患犬為11 隻，其中 4 隻患犬於治療療間出現神神經症狀狀，神神經症狀狀 發生率率率為36.4%，Group 2 於就診時沒有出現神神經症狀狀之患犬為 13 隻，其中 7 隻 患犬於治療療間出現神神經症狀狀，神神經症狀狀發生率率率為53.8%。Group1b 於治療療期間出 現神神經症狀狀之患犬(n=4)存活率率率為 75%，Group 2b 於治療療期間出現神神經症狀狀之患 犬(n=7)存活率率率則只為 14.3%，Group1b 於治療療期間出現神神經症狀狀患犬之存活率率率有 顯著上升之趨勢(p=0.088)。
第四節四十隻犬瘟患犬之血檢值與影像學診斷分析 4.4.1 出現神神經症狀狀犬瘟患犬之血檢值與影像學診斷分析
將接受高免血漿治療療之 Group1 中出現神神經症狀狀患犬(Group 1b,n=14)與未接 受高免血漿治療療之Group 2 中出現神神經症狀狀患犬(Group 2b,n=13)進行行就診時(治 療療前)之實驗室與影像學診斷統計分析比較，結果顯示於就診時接受高免血漿治 療療組之體溫與白血球總數數顯著高於未接受高免血漿治療療組，顯示接受高免血漿組 發炎感染程度度較為嚴重；影像學方面接受高免血漿治療療組肺炎之情形則略略較未接 受高免血漿治療療組嚴重，兩兩組血液生化值與RT-nPCR 檢測結果比較無明顯差異異。
詳細結果列列於表6、7、8。
4.4.2 從未出現神神經症狀狀犬瘟患犬之血檢值與影像學診斷分析
將接受高免血漿治療療之 Group1 中從未出現神神經症狀狀患犬(Group 1a,n=7)與未 接受高免血漿治療療之Group 2 中從未出現神神經症狀狀患犬(Group 2a,n=6)進行行就診 時之實驗室與影像學診斷統計分析比較，結果顯示於就診時接受高免血漿治療療組 之血紅素、血容比與紅血球總數數顯著低於未接受高免血漿治療療組，且接受高免血 漿治療療組白血球總數數有白血球增多(Leukocytosis)之情形，顯示接受高免血漿組發
炎感染程度度較為嚴重，此慢性發炎反應也為造成其貧血之原因。影像學方面接受 高免血漿治療療組肺炎之情形則較未接受高免血漿治療療組嚴重，RT-nPCR 檢測結果 顯示接受高免血漿組之各部位檢體陽性率率率與每隻患犬於六六個採樣部位呈現陽性 的數數量量皆較未接受高免血漿組高，詳細結果列列於表9、10、11。
第五節 中和抗體力力價之影響
Group 1 中存活組(n=14)於病毒清除天數數與患犬本身中和抗體力力價間關聯聯性 之分析，結果顯示治療療前本身中和抗體力力價大於512 的患犬(n=3)，平均清除病 毒天數數為14 天，治療療前本身中和抗體力力價小於 128 的患犬(n=5)，平均病毒清除 天數數則為35.8 天。治療療前本身中和抗體力力價較低的患犬，於接受高免血漿治療療 期間，本身中和抗體力力價被提升(大於 512)，亦於 28 天以後陸陸續將病毒清除。
Group 1 死亡組(n=7) 存活天數數與治療療前本身中和抗體力力價之間則無關聯聯性。詳 細結果列列於表12。
第六六節 Group1 出現神神經症狀狀患犬之 RT-nPCR 結果與組織病理理學診斷分析 4.6.1 Group1 中出現神神經症狀狀患犬存活組與死亡組之分析
將 Group1 中出現神神經症狀狀患犬分為存活組(n=7)與死亡组(n=7)，比較出現神神 經症狀狀當時的檢體陽性率率率，結果顯示死亡组於全血檢體的陽性率率率顯著高於存活組，
且出現神神經症狀狀同時出現病毒血症的動物(n=4)其死亡率率率為 100%。死亡组在死亡 前至少有一個以上的不不同部位檢體仍呈現CDV 核酸陽性反應。詳細結果列列於表 13、14。
4.6.2 Group1 出現神神經症狀狀死亡患犬之組織病理理學與免疫化學染色(IHC)診斷結 果
總計六六隻經高免血漿治療療仍死亡患犬(編號 16、17、18、19、20、21)進行行組 織病理理切切片診斷，同時亦有進行行免疫化學染色用以確認犬瘟病毒分布之情形。
CNS 病變之急性期定義為只有輕微至無之免疫細胞浸潤的圍管現象
(perivascular cuffing)，慢性期則定義為嚴重程度度免疫細胞浸潤的圍管現象。本研
究經高免血漿治療療仍死亡患犬有五隻患犬(編號 17、18、19、20、21)屬於 CNS 病變之急性期，其中四隻(編號 17、18、19、21)之大腦白質有輕微圍管現象，兩兩 隻(編號 17、18)之小腦白質有輕微圍管現象，只有一隻患犬(編號 16)屬於 CNS 病變之慢性期，有嚴重之圍管現象。主要脫髓鞘病變皆位於小腦白質，五隻患犬 (編號 16、17、18、19、20)其小腦白質有嚴重程度度之脫髓鞘病變，編號 21 患犬 則有中等程度度之脫髓鞘病變。三隻患犬(編號 19、20、21)於大腦白質有輕微至中 等程度度之脫髓鞘病變，另外三隻患犬(編號 16、17、18)則於大腦白質側腦室周圍 才有輕微至中等程度度之脫髓鞘病變。三隻患犬(編號 17、19、20)於大腦灰質有中 等至嚴重程度度之神神經元壞死的腦軟化病變，編號21 患犬於大腦灰質側腦室周圍 才有中等程度度之神神經元壞死的腦軟化病變，其他兩兩隻患犬(編號 16、18)無明顯大 腦灰質之病變。
免疫化學染色之犬瘟熱病毒分布情形結果顯示，五隻急性期患犬(編號 17、
18、19、20、21)其小腦白質有中等至嚴重程度度之病毒分布，慢性期之患犬只於 小腦白質第四腦室周圍才有嚴重程度度之病毒分布，結果列列於圖 2、3。編號19 患 犬於大腦白質有廣泛性輕微程度度之病毒分布，其餘五隻患犬(編號 16、17、18、
20、21)皆於大腦白質側腦室周圍才有中等程度度之病毒分布；於大腦灰質三隻患 犬(編號 17、19、20)有廣泛性輕微至中等程度度之病毒分布，患犬編號 21 患犬於 大腦灰質側腦室周圍才有中等程度度之病毒分布，其餘兩兩隻患犬(編號 16、18)於大 腦灰質沒有檢測到病毒抗原。詳細結果列列於表 15。
於其他身體組織器官之病毒分布情形，四隻患犬(編號 17、18、20、21)於脾 臟並未檢測到病毒抗原，一隻患犬(編號 16)於脾臟檢測到少量量病毒，三隻患犬 (編號16、18、20)則於肺臟、腎臟與消化道有輕微至無之病毒抗原被檢測到，其 他三隻患犬(編號 17、19、21) 於肺臟、腎臟與消化道則有中等至嚴重程度度之病 毒存在。詳細結果列列於表 16。
第七節 類類固醇給予時間之影響
將 Group1 出現神神經症狀狀患犬分成存活組(n=7)與死亡組(n=7)進行行比較，結果 顯示出現癲癇後才給予類類固醇死亡率率率為100%(n=4)，而死亡組有一隻患犬死於細 菌共同感染之急性休克，不不列列入計算，死亡組其餘的患犬(n=2) 平均於神神經症狀狀 出現後第25 天開始給予類類固醇，存活組則平均於神神經症狀狀出現後第 3.8 天開始 給予類類固醇，結果顯示存活組於神神經症狀狀出現後至開始給予類類固醇的天數數顯著短 於死亡組。
第五章 討論論
犬瘟熱為一盛行行久遠且具高傳染性、高發生率率率與高死亡率率率的疾病，3-6 月齡 的幼犬感受性較高(Green et al., 2012)。本研究 40 隻患犬中，小於六六月齡之幼犬 佔50%，所占比例例較高，與文獻所述相符。接受高免血漿與未接受高免血漿治療療 各組別之存活和死亡患犬間，幼犬與成犬比例例約各占一半，並無明顯差異異，顯示 發病時之年年齡並非影響治療療成效的因子。一般犬瘟熱之診斷以RT-nPCR 的敏感 性最高(Jozwik and Frymus, 2005)，有文獻認為配合當下之臨臨床症狀狀採取該部位檢 體檢驗，可有較高之檢出率率率(黃 等，2005)；Saito 等人指出於臨臨床上出現神神經症 狀狀之患犬，其尿尿液檢體之檢出率率率為100%(Saito et al., 2005)。分析本研究中 Group1 於就診時採集之檢體，在具臨臨床症狀狀且同時呈現PCR 陽性的部位中，以鼻腔檢 體比率率率最高，眼結膜檢體次之，直腸檢體比率率率則最低。此外，本研究中出現神神經 症狀狀且同時尿尿液檢體為陽性的比例例為63.6%，雖較 Saito 等人結果為低，但仍有 六六成以上之陽性率率率，表示臨臨床上出現神神經症狀狀與尿尿液檢體陽性有一定之關聯聯性。
因此推論論出現呼吸道症狀狀、眼膿和神神經症狀狀與該部位呈現PCR 陽性較具關聯聯性，
而出現消化道症狀狀與腸道是否呈現PCR 陽性的關聯聯性較低。本研究中接受高免 血漿之Group 1 存活組有 83.3%同時伴隨犬小病毒之感染，死亡组則只有 50%，
顯示同時伴隨犬小病毒之感染並不不會影響治療療之成效，且血漿的輸入也可同時幫 助其耐過犬小病毒的感染。
至今為止對於犬瘟熱治療療方式的建議仍無太大的改變，支持治療療與對症治療療 僅對無神神經性系統性症狀狀患犬有較佳之療療效，能降降低其死亡率率率，但無法預測其後 續神神經症狀狀的發生率率率，且目前對於出現神神經症狀狀之患犬仍無有效的建議治療療方式，
通常於中樞神神經症狀狀出現後會逐漸惡惡化趨向死亡，死亡率率率極高，治療療通常無明顯 成效，僅有少數數得已耐過(Beineke et al.,2009; Green et al.,2012;Vandevelde and Zurbriggen,2005)。因此犬瘟熱患犬之神神經症狀狀出現與否為評估此疾病預後最重要 之指標。本研究中接受高免血漿治療療之Group1 總存活率率率為 63.6%，沒有接受高 免血漿治療療之Group 2 總存活率率率則為 36.8%；未接受高免血漿的 Group2 (n=19)
中，出現神神經症狀狀患犬之死亡率率率為92.3%，存活率率率低於 10%，證實出現神神經症狀狀 之患犬僅接受傳統對症與支持治療療死亡率率率仍然很高；然而接受高免血漿的 Group1(n=21)中，出現神神經症狀狀患犬之存活率率率提高為 50%，顯著高於未給予高免 血漿的Group2 (存活率率率只為 7.7%)，另外於就診時(治療療前)，接受高免血漿組的 全身性發炎反應與二次性感染程度度皆較未接受高免血漿組嚴重，但在經過高免血 漿之治療療後，其存活率率率卻顯著提升；此外，本研究中從未出現神神經症狀狀之患犬，
接受高免血漿組於就診時全身性發炎反應與二次性細菌感染程度度較未接受高免 血漿組嚴重，被病毒感染之程度度亦較為嚴重，但接受高免血漿治療療後，存活率率率亦 為100%。此兩兩者之結果顯示高免血漿之治療療確實能夠幫助清除病毒，降降低疾病 的嚴重程度度，顯著提升出現神神經症狀狀患犬的存活率率率。中和抗體能清除病毒顆粒粒並 降降低病毒的毒力力與散佈能力力(Hirayama et al.,1991; Ho and Babiuk,1979; Rima et al.,1991)。將犬瘟病毒感染犬隻腦細胞後，加入 anti-H 單株抗體能有效地阻止 病毒在犬隻腦細胞中之散佈(Wyss-Fluehmann et al.,2010)，Bollo 等人推測若若病毒 在中樞神神經系統(CNS)內廣泛散佈之前，腦中即有較高的中和抗體協助清除病毒，
就不不會造成更更嚴重的神神經症狀狀，使患犬能夠復復原(Bollo et al.,1986)。本研究中接 受高免血漿組其神神經症狀狀之發生率率率為36.4%，低於未接受高免血漿組之 53.8%，
且於治療療期間才出現神神經症狀狀之患犬，未給予高免血漿組之存活率率率只為14.3%，
給予高免血漿組之存活率率率則提升為75%，有顯著升高之趨勢，表示於發病早期未 出現神神經症狀狀前即接受高免血漿之治療療，被動提升中和抗體力力價協助清除病毒，
減少病毒的產生與散佈，降降低各組織器官的感染率率率，使患犬免疫抑制的情況可以 及早緩解，便便能降降低疾病之嚴重程度度與神神經症狀狀之發生率率率，此外雖神神經症狀狀出現 仍可以盡早協助清除病毒，減少神神經系統之損傷，提升患犬之存活率率率。
中和抗體力力價可被用來來預測犬瘟熱患犬的預後，Jozwik 等人於自然感染犬瘟 熱之九隻患犬中，發現發病後抗體力力價高低與病程的發展具有相關性，其中死亡 患犬之抗體力力價皆小於100 倍(Jozwik and Frymus, 2004)；而 Rima 等人則於實驗 感染犬瘟病毒誘發腦炎(encephalitis)的犬隻中，發現其死亡犬隻發病後之抗體力力
價皆明顯低於復復原犬隻(Rima et al., 1991)。以上各實驗與本研究抗體力力價數數值因 使用不不同細胞株及病毒株，而無法直接做比較，但其抗體力力價整體趨勢對於患犬 預後之影響則極為相似，患犬發病後若若抗體力力價較低則預後較差。本研究中接受 高免血漿治療療之存活組，治療療前中和抗體力力價較低，原本預測預後較差的患犬，
經過給予介於62064-182331.5 (titers x ml/kg)之高免血漿，其體內中和抗體力力價被 提升後(大於 512)亦可將病毒清除而復復原，顯示即使患犬發病後原先本身所產生 之抗體力力價雖較低，在經過高免血漿治療療後，確實能夠提升其體內中和抗體力力價，
幫助清除病毒，使患犬痊癒。
Penny 等人於貂實驗感染犬瘟病毒的研究中發現，血腦障壁(Blood-brain barrier, BBB)於感染後會受到破壞(Penny et al.,2010)，使身體組織中的病毒更更容易易 進入CNS，若若導致 CNS 中病毒的清除速度度始終慢於侵入的速度度，CNS 的病毒會 一直無法有效地被清除，而病毒的持續存在是造成神神經系統持續損傷的關鍵因子 (Beineke et al.,2009; Vandevelde and Zurbriggen,2005)。本研究高免血漿治療療組中，
死亡患犬皆因極度度的神神經症狀狀惡惡化而進行行安樂樂樂樂死，且死前至少於一個以上之檢體 呈現PCR 陽性，由組織切切片之免疫化學染色發現身體各組織器官(腎臟、肺臟、
消化道)皆存有不不等程度度之病毒分布，腦中亦有病毒存在，尤其於腦室(病毒進入 腦部的入口)周圍發現存在較多病毒量量，表示由各組織器官產生之病毒確實會持
續侵入CNS，各組織器官內之病毒一直沒有被清除，會使已出現神神經症狀狀之患
犬更更無法有效地及時清除CNS 內之病毒，神神經症狀狀持續惡惡化而死亡。此結果顯 示無法完全清除病毒是導致本研究中接受高免血漿治療療組之死亡患犬神神經症狀狀 持續惡惡化的主要原因。
中和抗體主要作用是清除游離離病毒顆粒粒並降降低病毒的毒力力與散佈能力力 (Hirayama et al.,1991; Ho and Babiuk,1979; Rima et al.,1991)，而病毒進入細胞後，
補體會結合中和抗體進行行補體媒介之體液細胞毒殺殺作用(complement-mediated humoral cytotoxicity)清除被感染的細胞，進而降降低疾病嚴重程度度。若若補體不不足時，
單純有較高之抗體力力價也無法有效清除病毒，會造成持續性感染。補體在同時有
