關 鍵 詞：虎杖、反式白藜蘆醇、細胞懸浮培養 作者：

高瞻一班專題研究報告

作品名稱：還我清「白」──利用微生物生化轉換白藜蘆醇之研究

關 鍵 詞：虎杖、反式白藜蘆醇、細胞懸浮培養 作者：

高二七班 彭筱芳 高二五班 紀承緯

指導老師：

王姍佩

廖青軒

摘 要

虎杖（Polygonum cuspidatum Sied. et Zucc.）為蓼科多年生半木質化草本，內含多酚類化 合物－反式白藜蘆醇（trans-resveratrol）具有多種生物活性，如防止心血管疾病、抑制低密度 脂蛋白、抗腫瘤、降低冠狀心臟病的發生及延年益壽等。經初步試驗得知 X 品系有較佳之生 物活性，故將 X 品系之虎杖持續繼代，同時建立虎杖懸浮細胞培養系統，並持續繼代培養，

維持細胞活力。根據虎杖細 胞生長曲線得知，在第 14~16 天為最佳細胞繼代培養時間。將 懸浮細胞照射強度為 15 W 的 UVC 燈管 20 min、30 min 後，再加入 Aspergillus oryzae 將 piceid 轉化成 resveratrol，初步以 HPLC 分析結果得到白藜蘆醇訊號。

壹、 研究動機

在現代，癌症已成了一種文明病，而白藜蘆醇此種萃取物，可以製作成保健食品的方式供 人實用以達到防癌、抗癌的效果，相當有用。雖然在紅酒中即可得到，但是，含量過低且萃取 成本高，實在令人失望。還好在台灣原生種虎杖中發現它含有大量的白藜蘆醇，於是取回實驗 室培植繼代，不久繼代成果出來，發現在實驗時培植出來的品種萃取出的不是白藜蘆醇，而是 化學結構僅與白藜蘆醇相差不遠的 piceid，所以我們希望藉由此次實驗，利用課程中所學過的 植物組織培養及細胞懸浮培養並透過菌種的生理活性達到將 piceid 轉換成白藜蘆醇的目的。

貳、 研究目的

產於高山之原生虎杖可自然產生白藜蘆醇，但遷離原棲息地之直系繼代虎杖無法產生白藜 蘆醇，取而代之的是 piceid，本次實驗目的及是藉由 Aspergillus oryzae 產生之二次代謝物將 piceid 轉換為白藜蘆醇。

參、 研究設備及器材

一、材料

1. 虎杖(Polygonum cuspidatum)

2. 米麴菌(Aspergillus oryzae) BCRC30104ヽBCRC30123ヽBCRC30156

二、設備

﹝一﹞ 器材與儀器

1. 量筒〈250ml、500ml〉 2. 培養皿

3. 培養瓶 4. 血清瓶

5. 三角瓶〈125ml〉 6. 微量滴管 Pipettement1cc、0.5cc 7. 含蓋玻璃試管〈50cc〉 8. 磁石

9. 接種環 10. 石蠟膜

11. 鋁薄紙 12. 數位相機

13. 高壓滅菌釜 14. RO 逆滲透

15. PH 檢測儀 16. 電磁加熱攪拌儀

17. 微波爐 18. 烘箱

19. 藥品秤 20. 懸浮震盪培養儀

21. 無菌操作台

22. 高效液相層析分析儀〈High performance liquid chromatography〉

﹝二﹞ 藥品

1. 虎杖組織培養基〈以下僅以 N

01

05

MS 基本培養基 9.5ml

NAA 0.2mg/ml

BA 0.2mg/ml

Vitamins and organics 0.5ml

蔗糖 3g

洋菜 0.7g

加 dd water 至總體積 100ml

2. 虎杖細胞懸浮培養液〈以下僅以 D

₁

MS 基本培養基 38ml

2,4-D 0.2mg/ml

Vitamins and organics 2ml

蔗糖 12g

加 dd water 至總體積 400ml

3. LB Broth

Yeast extract 5g

Peptone 10g

NaCl 10g

加 dd water 至總體積 1000ml

4. 快速培養基 PDA〈Potatoes Dextrose Agar〉

Potatoes infusion from 200g

Dextrose 20g

Agar 15g

加 dd water 至總體積 1000ml

肆、 研究過程與方法

一、虎杖莖段備製

﹝一﹞目的：將莖段備製與表面消毒，以做為組織培養培植體來源。

1. 由虎杖母株切取單莖節為培植體，先以清水沖洗約 10 分鐘後，浸泡於 70％酒精消毒 30 秒後倒掉並用無菌水洗淨一次。

2. 以 2-3％（v/v）的次氯酸鈉溶液加 1～2 滴的 Tween 20，置於超音波震盪器進行表面 消毒 15 分鐘後，移至無菌操作台以無菌水清洗 2-3 次，及完成培植體消毒程序。

二、虎杖植株繼代

﹝一﹞目的：透過持續繼代以供給日後實驗各階段試驗使用。

１. 配置培養基：

﹝1﹞ 配製成份如下之 N

01

05

MS 基本培養基 47.5ml

NAA 0.25ml

BA 1.25ml

Vitamins and organics 2.5ml 圖二、虎杖母株 圖一、虎杖根莖

﹝2﹞ 將混合溶液加入 15g 蔗糖和 3.5g 洋菜，放入磁石置於加熱攪拌儀上攪拌，

再加入蒸餾水至 250ml 持續攪拌待糖溶解。

﹝3﹞ 將混合溶液倒入量筒定量，加入蒸餾水至 500ml 後，繼續放回加熱攪拌 儀攪拌。

﹝4﹞ 以 HCl 和 NaOH 調整溶液的 pH 值至 pH5.7，即為最適合虎杖生長發育的 培養液。

﹝5﹞ 於訂定 pH 值後繼續攪拌，待攪拌混合均勻後送至微波爐加熱兩分鐘，若 有沉澱取出攪拌後再次微波加熱兩分鐘，重複動作約五次後即無沉澱產 生。

２. 在培養瓶中倒入 20ml 培養液，以鋁薄紙密封，以 2 大氣壓 121℃高溫高壓濕熱 滅菌 15 分鐘。

３. 於 消 毒 過 後 的 無 菌 操 作 台 中 ， 於 約 含 有 30g/L sucrose, 0.2mg/L NAA 及 0.5mg/LBA 之 MS 固體培養基中植入由虎杖切下的 Y 字莖節。

４. 結果顯示：

試驗過程中將虎杖持續繼代，共繼代了二十五瓶培養瓶之虎杖 X 品系，約 250 株，以供各階段試驗使用。

圖三、虎杖繼代成品

三、虎杖細胞懸浮培養

﹝一﹞目的：建立懸浮細胞培養之母瓶。

１. 配置培養液：

﹝1﹞ 配置成分如下之Ｄ

₁

MS 基本培養基 38ml

2,4-D 2ml

Vitamins and organics 2ml

﹝2﹞ 將混合溶液加入 12g 蔗糖，放入磁石置於加熱攪拌儀上攪拌，再加入蒸餾 水至 300ml 持續攪拌待糖溶解。

﹝3﹞ 將混合溶液倒入量筒定量，加入蒸餾水至 400ml 後，繼續放回加熱攪拌 儀攪拌。

﹝4﹞ 以 HCl 和 NaOH 調整溶液的 pH 值至 pH5.7，即為最適合虎杖細胞生長發 育的培養液。

２. 將培養液全數倒入血清瓶後，以 2 大氣壓 121℃高溫高壓濕熱滅菌 15 分鐘後取 出靜置於桌面待其冷卻。

３. 於已完全消毒之無菌操作台上，取經無菌培養之虎杖植株之莖段，將其置於約含 有 30g/L sucrose, 0.2mg/L NAA 及 0.5mg/LBA 之 MS 固體培養基中，在常溫下培 養約二週即可發現有癒傷組織形成。將生長良好且結構鬆散，均質之癒傷組織約 0.5g，置於含 48ml 液體培養之 125ml 三角瓶內，在平面迴轉式震盪器上，以 110rpm 震盪培養。

４. 結果顯示：

成功繼代，建立懸浮細胞培養之母瓶。

四、虎杖細胞繼代

﹝一﹞目的：在虎杖懸浮細胞培養系統中，持續繼代培養，維持細胞活力。

１. 根據虎杖細胞生長曲線得知，在第 14~16 天為最佳細胞繼代培養時間，所以兩 週換一次上層 28ml 培養液，同時取出顏色呈褐色的老舊細胞，完成繼代。

２. 結果顯示：

實驗過程中將虎杖 X 品系細胞持續繼代，共 9 瓶，以供給日後實驗各階段試驗 使用。

五、活化 Aspergillus oryzae

﹝一﹞目 的 ： 將 自 食 品 工 業 研 究 所 買 回 之 三 株 菌 株 編 號 分 別 為 ： BCRC30104 ヽ BCRC30123ヽBCRC30156 之 Aspergillus oryzae 活化以將其培養生長，以供給日後 實驗各階段使用。

１. 配置培養液：

﹝1﹞ 配置成分如下之混合溶液 LB Broth

Yeast extract 0.5g

Peptone 1g

NaCl 1g

﹝2﹞ 將混合液置於加熱攪拌儀加入蒸餾水至 50ml，於均勻攪拌後，倒至定量筒加 圖四、虎杖細胞繼代成品

２. 將培養液全數倒入血清瓶後，以 2 大氣壓 121℃高溫高壓濕熱滅菌 15 分鐘。

３. 於 無 菌 操 作 臺 上 將 自 食 品 工 業 研 究 所 所 買 回 之 三 株 菌 株 ﹝ BCRC30104 ヽ BCRC30123ヽBCRC30156﹞分別以接種環植入 LB Broth，保存於 24℃並持續以觸 動式震動器震動將原冷凍之菌株震散以利活化。

４. 結果顯示：

成功活化細菌，並得以進行下一步之繁殖培養。

六、培養 Aspergillus oryzae

﹝一﹞目的：繁殖培養已活化之 Aspergillus oryzae，以供給日後實驗各階段試驗使用。

１. 配置快速培養基 PDA

﹝1﹞ 取快速培養基 PDA19.5 克，加蒸餾水至總體積 500 克。

﹝2﹞ 以加熱攪拌儀均勻攪拌後，全數倒入血清瓶，以 2 大氣壓 121℃高溫高壓濕 熱滅菌 15 分鐘。

﹝3﹞ 滅菌後，迅速取出，於無菌操作台，將培養液倒入培養皿中，以石蠟膜封起，

避免污染。

２. 於平板基上，採劃線培養以分離菌株。

３. 結果顯示：

成功培養並繁殖 Aspergillus oryzae，並藉由其二次代謝產物將 piceid 轉化成 resveratrol。

﹝一﹞目的：將採集之野生虎杖根段，逢機選取 5 株，切取部分根部組織以高效液相層析 分析儀(High performance liquid chromatography)進行白藜蘆醇含量分析。

１. 首先配置光電二極陣列偵測器，使用分析管柱為 Lichospher RP-18。室溫下以 A 溶液：97.5 %甲醇＋2.5%醋酸；B 溶液：97.5%二次水＋25%醋酸為移動相，脫氣 後進行梯度沖提處理程序。

２. 前 40 分鐘以 30%的溶液，70%的 B 溶液，起始流速為 0.5mL/min。達 40 分鐘時，

將 A 溶液比例提升至 70%，B 溶液降為 30%。而第 45 分鐘時，比例維持不變，

而其目的是為了將後面的 peak 清洗乾淨。

３. 接著用 50% MeOH 再次確認分析管柱有無清洗乾淨，時間為 10 分鐘，偵測波長 為 306nm。

八、標準曲線之繪製

取 trans-resveratrol 之標準產品，分別以精確配置 5 及 20ng/μL 兩個濃度之標準品溶 液，標準品溶液注射量有 10、20、40、60μL 等四種體積，供 HPLC 分析測定。每組組合 處理，重複注射三次進行分析，將 3 次總和加以平均，以成分濃度為橫座標，積分面積為 縱座標，利用線性回歸分析獲得直線方程式，繪製標準檢量線圖。

伍、 研究結果

採集虎杖根段，利用 HPLC 的移動相梯度變化，測定白藜蘆醇標準品與虎杖根萃取 液。經光電二極體陣列偵測器在波長 306nm，流速 0.5ml/min，且管住溫度維持在 25℃條 件下分析，分析時間為 45 分鐘。由圖五可得知，萃取液在注射後第 15～16 分鐘內有反式 白藜蘆醇的訊號出現。分析栽培過後 11 株不同編號數據，其中顯示株根部的白藜蘆醇含量 較高，取樣分析白藜蘆醇含量達 0.87±0.07mg/g。

AU

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40

nm

220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00 360.00 380.00 230.4

304.9

圖五、虎杖根莖萃取液中白藜蘆醇的含量測定。

利用 HPLC 溶劑的梯度變化來做測定，電二極體陣列偵測器探測波長在 306 nm、流速 0.5 ml/min、管柱溫度維持在 25 ℃，分析時間為 45 分鍾 條件下進行分析。(A) 白藜蘆醇標準品 (B) 虎杖根 Line 051111.

陸、 討論

一、環境氣候的改變影響白藜蘆醇的產出率：

經分析後，由圖五可知，於高山採集之原生種虎杖，其白藜蘆醇含量遠超過同母株經過繼 代、並以 Aspergillus oryzae 之二次代謝產物轉換過的個體。而在模擬高山氣溫、日照、溼 度與刺激生長之生長激素等各式條件情況下，推估會產生這種結果的原因是基於土壤中含 礦物質的改變和隨季節變換而改變之日照時數等多方面無可比擬外界的環境因素影響。

二、Aspergillus oryzae 菌株之間造成的差異性：

因此次實驗時間緊迫，僅以 BCRC30123 之二次代謝產物作為轉換的關鍵。

三、未來準備進行的實驗包括：

１. 調整培養室之燈光照射時數，以確定是否因日照時數的改變，而造成白藜蘆醇產出量的 差異性。

２. 深入了解 Aspergillus oryzae 之三株菌〈BCRC30104ヽBCRC30123ヽBCRC30156〉二次 代謝產物造成白藜蘆醇產出率的差別。

柒、 結論

將懸浮細胞加入 Aspergillus oryzae 後，初步經 HPLC 分析結果得到萃取液在注射後第 15～16 分鐘內出現白藜蘆醇訊號，同時亦得知其二次代謝物也可將 piceid 轉化成 resveratrol。在未來，

此萃取、分析技術成熟發展後，即可生產大量且富生理活性的 resveratrol。

捌、 參考資料及其他

壹、中文部分

１. 趙大衛等﹝民 96﹞。高中基礎生物第二章﹝55 頁﹞。台南市：翰林書局。

２. 趙大衛等﹝民 96﹞。高中生物上冊第三章﹝86-87 頁﹞。台南市：翰林書局。

３. 趙大衛等﹝民 97﹞。高中生物上冊第三章﹝89、93 頁﹞。台南市：翰林書局。

４. Neil A. Campbell‧Jane B. Reece﹝2005﹞。生物學上冊第三十一章﹝779 頁﹞。台北市：偉 明圖書有限公司。

５. Neil A. Campbell‧Jane B. Reece﹝2005﹞。生物學下冊第三十八章﹝981-982 頁﹞。台北 市：偉明圖書有限公司。

６. 鄭漢臣﹝民 93﹞。藥用植物學第三版﹝189-191 頁﹞。台北市：文光圖書有限公司

７. 黃資容﹝民 95﹞。臺灣原生種虎杖組織培養繁殖與反式白藜蘆醇之分析。私立明道大學材 料暨系統工程研究所碩士論文，未出版，彰化縣。

貳、網路資源

一、中文部分

１. 劉霞﹝民 98 年 2 月 25 日﹞。生命周期調節發現新機制。科技日報。民 98 年 3 月 9 日，取 自：http://www.stdaily.com/big5/stdaily/2009-02/26/content_913057.htm

２. 查無作者〈民 96 年 9 月 11 日〉。植物組織培養知識概要。農博網。民 98 年 3 月 9 日，取 自：http://biology.aweb.com.cn/news/2007/9/11/11002612.shtml

３. 陳雪芬、柯嘉昀〈無日期〉。植物組織培養。國立清華大學。民 98 年 3 月 9 日，取自：

http://life.nthu.edu.tw/~g874222/homework9.htm

４. 未知〈民 95 年 11 月 9 日〉。植物細胞懸浮培養。生物秀。民 98 年 3 月 10 日，取自：

http://www.bbioo.com/bio101/2006/7998.htm

５. 賴衍寯〈民 90 年 2 月 7 日〉。培養基配置殺菌何吳俊操作要領。民 98 年 3 月 10 日，取自：

http://www.cnferment.net/Soft/fajiao/200612/20061221134735190.pdf

二、英文部分

１. Dale Robertson. The skinny on ... Resveratrol. Chron.com. Retrieved February 9, 2009,from