計畫名稱：幾丁聚醣及其獨特衍生物在組織工程支架上之應用: 合成; 支架製作暨與細 胞及脂肪幹細胞作用之探討 計畫編號：94-2213-E-006-088 計畫期限：2005/08/01-2006/10/31 計畫主持人：林睿哲教授 執行機構：成功大學 中文摘要 幾 丁 聚 醣 Chitosan 是 一 種 glycoaminoglycan，具有良好的生物相容性和生物 降解性，可以被應用在組織工程的細胞支架材 料。在過去的研究中，發現在細胞支架中加入細 胞 外 基 質 中 低 分 子 量 的 glycoaminoglycan 如 chondroitin sulfate 或 keratin sulfate，可以有效促 進細胞的吸附和生長情形，因此本研究嘗試在 chitosan 第六個碳上的-OH 上導入磺酸根功能 基 ， 來 模 仿 細 胞 外 基 質 中 低 分 子 量 glycoaminoglycan 的結構。 同時我們建立起 chitosan 第二個碳上 amino group 的保護與去保護策略，因為帶正電性的 amino group 被認為是 chitosan 在細胞培養上具有 獨特生化特性的主要因素。表面分析和血小板吸 附測試的結果，也證明本研究已經得到具有氨基 保護策略的磺酸化 chitosan，並具有促進血小板 吸附的特性，可以提供後續研究進行進一步的組 織工程應用探討。 此外，本研究也嘗試將磷酸根導入 chitosan 第六個碳上的-OH，來模仿細胞膜磷脂質的特性。 關鍵字：幾丁聚醣、磺酸化、保護基、組織工程、 細胞支架 Abstract
Chitosan, a kind of glycoaminoglycan, has good biocompatibility and biodegradation capability, and can be applied as scaffold material in tissue engineering. In addition, blending same low molecular weight glycoaminoglycan such as chondroitin sulfate or keratin sulfate in scaffold, has been indicated to improve cell adhesion and cell proliferation.
With an aim to imitate these low molecular weight glycoaminoglycan in structure, this study tried to directly sulfonate the hydroxy groups at C6 of chitosan. At the same time, protection strategy was used to keep the amino groups at C2 of chitosan intact, which was known as the major positive functional group of chitosan with special biological characteristics in cell culture. The results of surface analysis and platelet adhesion assay indicated that sulfonation of chitosan with amino group protection strategy was established and that could improve the platelet adhesion. These modified chitosan sample can be utilized the following study in tissue engineering.
In addition, to imitate the character of phospholipids in cell membrane, surface phosphorylation has been attempted in this study to incorporate phosphoric groups on the C6 of chitosan.
Keywords: chitosan, sulfonation, protection, tissue engineering, scaffold 一、實驗緣起與目的 在組織工程的研究中，製備細胞支架的材質 本身與其表面性質會影響到在其上培養之細胞生 長與分化的情形。在過去的研究中發現，若利用 細胞外基質中短分子鏈的胺基葡聚醣(GAG)如硫 酸 軟 骨 素 (chondroitin sulfate) 或 硫 酸 角 質 素 (keratin sulfate)等來修飾細胞支架的表面，可以提 高細胞生長與分化的情形(1-3)。但這些短鏈的胺基 葡聚醣因純化不易而價格高昂，限制了在組織工 程上的應用。因此本計畫將用官能基改質的技 術，在低成本的幾丁聚醣之第六個碳上氫氧基 (-OH)導入磺酸化-OSO3H 官能基，使幾丁聚醣具 有與這些短鏈胺基葡聚醣近似的結構。期望能提 高細胞的生長和分化的能力，而能降低製備細胞 支架的成本，以增進組織工程發展。 本研究與過去 chitosan 的改質方法有很大的 不同，前人的研究主要是在幾丁聚醣上反應性較 高的-NH2官能基上，進行磺酸化或其他官能基的 改質(4-6)。然而 chitosan 上帶正電的-NH 2官能基被 認為是使 chitosan 具有獨特生化特性的主要因 素，在-NH2官能基上進行改質可能會使 chitosan 失去原有的促進細胞增生分化的優良特性 因 此 本 計 畫 則 先 以 保 護 基 將 高 反 應 性 的 -NH2官能基保護後，在幾丁聚醣的一級-OH 上進 行磺酸化的反應，再進行去保護基反應，藉此保 留住 chitosan 特有的正電性-NH2官能基。 此改質方式也同時使幾丁聚醣具有再進行第 二階段改質的能力，如在本研究接續的計畫中， 可利用保留下的高反應性-NH2官能基，進一步進 行表面蛋白質固定化的改質。 有鑑於目前在細胞支架上的修飾，主要都以 模仿細胞外基質為主，而未能進一步仿效生物細 胞膜結構，因此本計畫也嘗試建立一新的官能基 改 質 技 術 ， 在 幾 丁 聚 醣 第 六 碳 上 導 入 磷 酸 化 -OPO3H2官能基，使幾丁聚醣同時具有胺基(-NH2) 官能基與-OPO3H2官能基，來模仿組成細胞膜的 磷脂質的正負電兩性結構。
二、實驗方法
1.
Preparation of chitosan membrane(1) 將 chitosan 溶於 1%的 acetic acid aqueous solution，配製成 2% chitosan solution。取 40ml 此 chitosan solution 加入塑膠培養皿 中，乾燥後成膜。
(2) 加入 0.2% NaOH/EtOH 使膜脫附，並持續 浸泡在 0.2% NaOH/EtOH 進行中和
2.
Surface modification of chitosan with amino group protected strategy2.1 Protection of amino group
(1) 將 2.41g 的 N-ethoxycarbonylphthalimide 以 及 14.4g 的 Na2CO3溶於 150ml 的去離子水 中，攪拌溶解後，加入 chitosan 膜並持續 攪拌反應 24h。 (2) 反應後，以去離子水清洗，然後浸泡在去 離子水中，並持續以乾淨的去離子水置換。 2.2 Sulfonation of chitosan (1) 將 0.5g 的 SO3/pyridine 溶於 150ml 的去離 子 水 中 ， 加 入 氨 基 保 護 後 或 未 保 護 的 chitosan 膜反應 5h。 (2) 反 應 後 先 以 去 離 子 水 清 洗 ， 再 以 0.1N NaOH 清洗，接著浸泡在去離子水中，並 持續以乾淨的去離子水置換。 2.3 Phosphorylation of chitosan (1) 將 chitosan 乾燥後放入含有 100ml THF 的 四井反應瓶中，接著在冰浴下緩慢加入 POCl3和 triethylamine，反應 5h。 (2) 將 100ml 飽和 NaHCO3水溶液加入四井反 應瓶中，繼續攪拌 overnight。 (3) 以去離子水清洗後，再浸泡在去離子水 中，並持續置換新的去離子水。
2.4 Deprotection of amino group
(1) 將 amino group 被保護的 chitosan 試片加入 150ml 的去離子水中，然後加入 0.01ml 或 0.05ml 的 NH2-NH2 進行去保護反應。 (2) 反應 3h 後，以去離子水清洗，然後浸泡在 去離子水中，並持續以乾淨的去離子水置 換。
3.
表面氨基的定量 (1) 將 chitosan 試片浸泡在 5×10 M 的 acid orange7 酸性染料溶液中，浸泡 5h 後取出， 以去離子水清洗表面後，再浸泡在 1×10-3 N 的 NaOH 中進行脫附。 (2) 取適量脫附後的溶液，測量波長 485nm 下 的吸收值，與濃度的檢量線對照後，可得 到表面氨基的數量。4.
表面性質的量測 反應後的試片，分別利用 ESCA、ATR-FTIR 以及 SEM 和 EDS 進行表面性質的分析。5.
血小板吸附實驗 (1) 先 將 chitosan 試 片 浸 泡 在 pH7.4 的 Hepes-Tyrodes buffer 中 1h。接著將試片取 出，在 5%CO2 37 。 C 的培養箱中浸泡血小 板濃厚液(PRP)1h。 (2) 以 Hepes-Tyrodes buffer 清洗後，浸泡 2 vol% of glutaraldehyde in Hepes buffer 30 分 鐘進行固定。 (3) 固定後以 Hepes-Tyrodes buffer 清洗，然後 依序以 0%, 25%, 50%, 75%,100%將 buffer 先 置 換 成 去 離 子 水 後 ， 再 依 序 置 換 成 EtOH，然後利用臨界點乾燥(CPD)，鍍金 後進行 SEM 量測。 三、結果與討論 1. chitosan 表面氨基的保護和去保護策略 Chitosan 上具有的 amino group 被認為是影 響 chitosan 生 化 特 性 的 主 要 因 素 ， 同 時 也 是 chitosan 結構中具有較高的反應能力的官能基， 在本計畫中嘗試建立起 chitosan 上-NH2官能基的 保護與去保護策略及其方法條件。由 ATR-FTIR 的 結 果 可 以 發 現 保 護 基 反 應 後 的 試 片 在 3000~3500 cm-1有較明顯的吸收峰(圖一)，可能是 由於 phthalic protection groups 所含苯環結構造成 的貢獻，由 ESCA 的結果(表一)，在 C1s 圖譜中 保護基反應後的 chitosan 試片 C-H 所佔比例由原 先未改質 chitosan 的 9.25%提高到 13.50%(表 二)，在 O1s 圖譜中保護基反應後的試片 C=O 所 佔比例也從原先未改質 chitosan 的 8.81%大幅提 高 到 20.82%( 表 三 ) ， 因 此 可 以 當 作 phthalic protection groups 成功接枝上的證明。 經由酸性染料分子對表面氨基的定量(表 四)，也證明經由此保護和去保護的策略，可以在 磺酸化反應後部分回復 chitosan 所具有的 amino groups。但同時我們也由 ESCA 的結果發現較高 濃度的去保護反應試劑，可能會切斷 chitosan 結 構上的醚鍵結產生-OH，使 C1s 和 O1s 圖譜中 C-O 的比例都增加(表二,表三)，而且可能會切斷導入 的磺酸根官能基，使 S 的訊號消失(表一,表三)。 此保護和去保護策略將使幾丁聚醣具有兩 階段改質的能力，提供本實驗室日後在幾丁聚醣 改良應用上有更多樣性的選擇，我們也將繼續嘗 O O O OH OH NH2 O NHCOCH3 HO HO m n O CN O O Na2CO3 (aq) O O O OH OH N O HO HO m n O O NHCOCH3 SO3 / Pyridine r.t. O O O OSO3H OSO3H N O HO HO m n O O NHCOCH3 r.t. H2N-NH2 O O O OSO3H OSO3H NH2 O NHCOCH3 HO HO m n O + POCl4,triethylamine/ THF NaHCO3(aq) O O O OH OH NH2 O NHCOCH3 HO HO m n O CN O O Na2CO3 (aq) O O O OH OH N O HO HO m n O O NHCOCH3 O + O O O OPO3H2 OPO3H2 N O HO HO m n O O NHCOCH3 r.t. H2N-NH2 O O O OPO3H2 OPO3H2 NH2 O NHCOCH3 HO HO m n試尋找更好的保護與去保護方式，來提高改質後 的 amino group 量。 2.chitosan 表面磺酸化 由 ATR-FTIR 的結果，在 850~1200cm-1的範 圍(圖二)，經過磺酸化反應後的 chitosan 試片吸收 峰的圖形明顯與未經過磺酸化的 chitosan 試片不 同，這是由於導入的磺酸根新增加 S-O 的吸收所 造成的貢獻。由 ESCA 表面性質的分析，除了高 濃度去保護基試劑反應後的試片以外，其餘經過 磺酸化的試片都有 S 訊號出現(表一,表三)，可以 證明本研究已經成功在 chitosan with amino group protected strategy 下進行磺酸化的改質。 血小版吸附實驗的結果發現具有氨基保護 策略的磺酸化 chitosan 試片，與未改質 chitosan 試片比較，具有促進血小板吸附，但卻不會引起 血小板活化聚集的特性(圖三,圖四)，表示具有氨 基保護策略的 chitosan 磺酸化後仍然具有良好的 血液相容性質，此特性可以增加改質後 chitosan 未來在與血液相關細胞組織上的應用，後續我們 也將繼續探討改質後 chitosan 對其他細胞生長分 化的影響。 3.chitosan 表面磷酸化 由 EDS 的結果(圖五)可以證明此反應方法的確 能夠將磷酸根導入 chitosan 結構中，在目前執行 中的計畫裡，我們將繼續尋求最佳化的磷酸化反 應條件，並進一步探討磷酸化改質後的 chitosan 對細胞生長分化的影響。 四、結論 在此計畫中，本實驗室已經建立起 chitosan 上表面氨基的保護與去保護策略，並在此策略下 成 功 進 行 表 面 磺 酸 化 的 改 質 ， 將 磺 酸 根 導 入 chitosan 結構中。未來將繼續探討磺酸化改質後 chitosan 在組織工程上的應用。 C: unmodified chitosan PC: protected chitosan
PCD: protected chitosan then deprotected by 6.62 × 10-4M NH2-NH2(aq)
CS: sulfonated chitosan
PCS: protected then sulfonated chitosan
PCSD(0.01): protected and sulfonated chitosan then deprotected by 1.32 ×10-4M NH
2-NH2(aq)
PCSD(0.05): protected and sulfonated chitosan then deprotected by 6.62 × 10-4M NH
2-NH2(aq)
圖一：ATR-FTIR 在 2300-3800cm-1的吸收峰
圖二：ATR-FTIR 在 800-1300cm-1的吸收峰
表一::Atomic % and atomic ratio of ESCA data
C1s N1s O1s S2p C/N O/N S/N C 59.32 7.09 33.58 0.00 8.37 (6.28)a 4.74 (4.14) 0.00 PC 60.16 7.75 32.10 0.00 7.76 (13.16) 4.14 (5.86) 0.00 PCD 57.99 6.20 35.82 0.00 9.35 (6.28) 5.78 (4.14) 0.00 CS 50.17 7.36 40.17 2.30 6.82 (6.28) 5.46 (9.72) 0.31 PCS 48.50 7.63 41.23 2.64 6.36 (13.16) 5.40 (8.86) 0.35 PCSD 0.01 49.24 6.99 41.87 1.90 7.04 (6.28) 5.99 (9.72) 0.27 PCSD 0.05 58.16 7.73 34.11 ＜0.01 7.52 (6.28) 4.41 (9.72) <0.01 a The values in parentheses correspond to the theoretical values based on the stoichiometry of the compounds
表二：C1s of ESCA data C-H (%) C-N (%) C-O (%) C-O-C (%), C=O (%) C 9.25 (1.88)a 22.30 (16.04) 45.41 (64.20) 23.04 (17.92) PC 13.50 (30.21) 21.02 (8.96) 41.53 (35.83) 23.95 (25.00) PCD 11.00 (1.88) 13.65 (16.04) 53.34 (64.20) 22.00 (17.92) CS 7.54 11.44 52.59 28.43 PCS 5.81 14.03 53.41 26.74 PCSD0.01 3.90 11.44 60.08 24.59 PCSD0.05 10.85 17.18 49.16 22.81
a The values in parentheses correspond to the theoretical values based on the stoichiometry of the compounds
wavenumber(cm-1) 2800 3000 3200 3400 3600 3800 Ab s o rban c e 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 C PC PCD Wavenumber(cm-1) 800 900 1000 1100 1200 1300 Ab s o rb an ce -0.04 -0.02 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 C P-C P-C-D C-S P-C-S P-C-S-D(0.01) P-C-S-D(0.05)
表三：O1s of ESCA data
C=O (%) C-O (%) C-O-C (%) S-O (%) C 8.81 (3.00)a 72.50 (72.75) 18.69 (24.25) 0.00 PC 20.82 (31.33) 65.23 (51.50) 13.95 (17.17) 0.00 PCD 8.07 (3.00) 73.13 (72.75) 18.79 (24.25) 0.00 CS 22.95 41.45 20.53 15.06 PCS 29.28 38.16 20.16 12.39 PCSD0.01 21.52 44.93 23.36 10.19 PCSD0.05 7.07 77.49 15.44 0.00 a The values in parentheses correspond to the theoretical values based on the stoichiometry of the compounds
表四：表面氨基定量 sample C PC PCD CS PCS PCD (0.01) PCD (0.05) mole/cm2 (×107) 7.90± 0.20 1.32± 0.27 3.07± 0.11 0.90± 0.01 1.03± 0.07 1.70± 0.04 3.45± 0.03 C CS PC PCD PCS PCSD0.01 PCSD0.05 圖三：血小板吸附之 SEM 量測 圖四：血小板吸附數量 圖五：chitosan 表面磷酸化 References:
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