利用Nested PCR與DNA定序方法鑑定 保育類穿山甲藥材及其製劑

盛頓公約、我國野生動物保育法、中國大陸野生 保護法與野生藥材資源管理條例，均將其列名為 第二級的保育動物，輸出輸入皆須受到當地政府 的許可管制。

傳統中藥視穿山甲的鱗片為重要成分，其功 用在中醫藥委員會中醫藥資訊網上說明為：通經 絡，下乳汁，潰癰疽，市售中藥製劑多見於通 乳、活血方面用途。藥材使用上，是將穿山甲捕 殺，取下鱗甲曬乾剝下鱗片，此稱「山甲片」，

將其經過砂炒後稱為「炮山甲」，再將炮山甲浸 醋稱為「醋山甲」或「醋甲片」⁽¹⁾，各類型的使 用依處方而不同。穿山甲的肉亦在民俗醫學中視 為補藥，因此穿山甲族群，在人工圈養不易的情 形下，長期以來面臨相當大的捕獵壓力。

雖然各國對穿山甲有立法保護，但是濫捕濫 用的事件卻層出不窮，路透社報導泰國官方沒收 穿山甲數量在2001年有1944只，到2002年前7個月 卻暴增到10763只，這些穿山甲走私轉運到中國

前　言

動 物 性 藥 材 約 佔 所 有 中 藥 材 種 類 的 15%~20%，然而在棲息地環境破壞，與人為的 大量獵捕下，動物性藥材的來源逐漸枯竭，但藥 材的需求並未因此而減少，更因為人口的增加，

中藥使用量逐步攀高，大量取自野生動物的中藥 材，加深了野生動物的生存壓力與滅種危機。在 維持生態多樣性與環境保育的觀念普及下，對於 野生動物的保護，開始受到重視，中藥使用野生 動物作為藥材的舉措，更引起各界的關注。

穿山甲為鱗甲目（Pholidota）鯪鯉科，共有1 屬7種，4種分布在非洲：大陸長尾穿山甲（Manis tetradactyla）、白腹穿山甲（M. tricuspis）、大 穿山甲（M. gigantea）與南非穿山甲（M. tem- mincki），另外3種分布在亞洲南部，包括中國 穿山甲（M. pentadactyla）、爪哇穿山甲（M.

javanica）和印度穿山甲（M. crassicaudata）。華

利用 Nested PCR與DNA定序方法鑑定 保育類穿山甲藥材及其製劑

呂康祖　羅吉方　張憲昌　林哲輝 第三組

摘　要

穿山甲藥材是取自保育類動物穿山甲的鱗甲片，為89年11月衛生署公告禁用之藥材，

本研究利用PCR與DNA定序方法鑑定中藥製劑是否含有穿山甲成分。將購自藥局之製劑檢 體，經過溶解溶液處理，並以另含有SDS的溶解溶液處理穿山甲鱗片檢體，再以有機溶液 萃取方法抽取DNA，之後用DNA純化套組的吸附DNA的原理，純化抽取的DNA。再以粒腺 體12S rRNA基因作為PCR的模板，利用普遍性引子進行PCR，並設計專一性引子進行nested PCR。nested PCR的產物以自動定序儀定序，將得到的DNA序列與GenBank的基因資料庫比 對分析，取得鑑定結果。結果顯示，穿山甲藥材山甲片、炮山甲與4件製劑檢體所含的穿 山甲成分均為中國穿山甲（Manis pentadactyla），此為華盛頓公約附錄二所列的保育類動 物。

關鍵字：穿山甲、PCR、nested PCR

作為食品或是中藥。我國雖然在民國78年就通過 野生動物保育法，但是據中央社2000年4月7日報 導，立委質疑市售171種中藥製劑均含有穿山甲成 分，有害我國在國際上形象，所以在同年11月衛 生署與農業委員會分別公告穿山甲不得入藥以及 非經主管同意不得買賣。

即使經過立法、公告保護限制，但是保育類 動物穿山甲的管理仍有其盲點，其一就是中藥製 劑入藥的問題－有否不肖業者將穿山甲入藥做成 製劑，以現今檢驗方法，不論是物理化學等等，

均無法有效驗證是否市售藥品含有穿山甲成分，

如此難保我國不淪為東南亞走私罪犯的幫兇，亦 或引發國際輿論的指責與撻伐，因此新的檢驗技 術的開發，將是政府方面的重要課題。

中藥的鑑定目前已經使用有物理、化學與分 子生物技術的檢驗技術，但在中藥製劑部分，當 多種中藥材經過磨碎、熬煮、過濾等等製作過 程，想要以現有技術鑑定其中藥材的基原，便顯 得困難重重。本局前研究中，完成了龜苓膏中龜 板基原的鑑定，將經過長時間熬煮且藥材成分達 到十數種的龜苓膏，克服微量DNA萃取及鑑定專 一性的困難，鑑定出所含之龜板基原，確認其是 否使用保育類龜類製作龜苓膏，同時解決龜鹿二 仙膠同時含兩種動物成分，相互干擾鑑定的問題

(3)。

在本次實驗中，將採取前研究上相同的實驗 策略，檢體方面，嘗試由穿山甲的鱗片、炮山甲 入手，再到市售含穿山甲的中藥製劑的鑑定；方 法方面，將配合檢體的形式，修改檢體DNA萃取

方式，其次同時應用動物粒腺體12S rRNA基因的 普遍性引子，再配合針對穿山甲設計的引子，進 行nested PCR的DNA擴增程序，以此鑑定穿山甲 的有無及其種類，而研究成果將對保育類動物管 理與中藥製劑成分鑑定，有所裨益。

材料與方法

一、材料

㈠檢體（檢體名稱與編號如表一）

1. 藥材：廠商送驗查驗登記藥材山甲片及炮 山甲各一件。

2. 製劑：共6件，於民國92年間陸續由台北地 區之藥局、藥妝店採購含穿山甲之中藥製 劑4件，及對照用去穿山甲成分製劑2件。

㈡試藥

1. 一般化學藥品：購自Sigma（St. Louis, MO, U.S.A.）、Merck（Darmstadt, Ger- many）、Amresco（Ohio, U.S.A.）。

2. DNA純化套組：QIAquick PCR purification kit （QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）。

3. Tag聚合酶及核苷酸dNTP：Taq Master Kit

（5X Tag Master Mix contain 1.25u Taq polymerase，reaction buffer，MgCl2 7.5 mM，200 µM dNTP）購自Protech（Taipei, Taiwan）

4. 引子：購自MWG-biotech（Germany）、

Qiagen（Germany）

F: AGAAATGGGCTACATTTTCT

表一、檢體鑑定結果

檢體編號 檢體名稱 鑑定結果

M 山甲片藥材 Manis pentadactyla

Mb 炮山甲藥材 Manis pentadactyla

M1 通乳丸 Manis pentadactyla

M2 通乳丸 Manis pentadactyla

M3 通乳丸 Manis pentadactyla

M4 健乳丸 Manis pentadactyla

M5 真人活命飲（去穿山甲） 未檢出穿山甲成分

M6 復元活血湯（去穿山甲） 未檢出穿山甲成分

R: GAGGGTGACGGGCGGTGTGT

MF: G G G C TAC AT T T T C TA A A AC AG (R=A+G)

MR: G C T T YA G R G C C K A R T T C A G (R=A+G, Y=C+T, K=G+T)

MF1: CAGAACACAAACGAATACCC 5. 瓊脂膠體：Agarose 3：1 HRB購自Amresco

（Ohio, U.S.A.）

6. 100 bp ladder marker及6倍載入膠片緩衝 液：購自Protech（Taipei, Taiwan）

7. 定序：委託明欣公司（Taipei, Taiwan）進 行

㈢器材

1. 迷你電泳槽及鑄膠器（Mupid II, Cosmo Bio, Chuo-Ku, Tokyo, Japan）

2. 聚合酶連鎖反應器（Gradient Palm-cycler, Corbett Research Co., Australia）

二、方法

㈠DNA萃取與純化

將檢體山甲片、炮山甲及製劑檢體磨碎或 切碎，取100 mg置於1.5 mL微量離心管中，

加入1 mL之溶解溶液（lysis buffer, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM EDTA, 1% N-lauroyl sarcosine sodium salt, and 1 mg/mL proteinase K），56℃水浴1小時（山甲片、炮山甲之 lysis buffer需另加2% SDS）。吸取溶液部 分，加入與溶液等體積之phenol：chloro- form：isoamyl alcohol（25：24：1; v/v/v），

混合，以12000 x g離心5分鐘。離心後取水 層，加入0.7倍體積之isopropanol及1/10體積 之3 M sodium acetate，以12000 x g離心5分 鐘。離心後倒去上清液，使沉澱物風乾後，

加入無菌水50-100 µL溶解。以Chaotropic salts DNA純化套組純化DNA，步驟依套組說 明，使最後洗出體積為50 µL之DNA溶液。

㈠PCR與nested PCR

取DNA溶液1 µL作模板，50 µM primer F、

R 各0.5 µL進行第一次PCR，條件為94℃

/30sec，58℃/30sec，72℃/30sec共25 cycles。

取第一次PCR產物取2 µL作模板，primer MF、MR各0.75 µL進行第二次PCR（nested P C R ） ， P C R 條 件 為 9 4 ℃ / 3 0 s e c ， 5 5 ℃ /30sec，72℃/30sec共25 cycles。

為再確認製劑含有穿山甲Manis pentadactyla 成分，另取第一次PCR產物取0.5 µL作模 板，primer MF1、MR各1 µL進行第二次PCR

（nested PCR），PCR條件為94℃/30sec，

58℃/30sec，72℃/30sec共25 cycles。

㈢電泳與定序分析

取第二次PCR產物5 µL，與6倍載入膠片緩 衝液1 µL混合，置入2%瓊脂膠體，在電泳 槽（+）極端加入0.5 µL 10 mg/ml ethidium bromide後，進行電泳，電泳條件100V、30 分鐘，置於紫外光照射檯觀察，確認PCR 結果，以數位相機拍攝結果。PCR結果確認 後，委託明欣（Taipei, Taiwan）進行DNA 定序，將定序結果與美國國家衛生院之Gen- Bank資料庫進行序列比對，得到鑑定結果。

結果與討論

自89年底衛生署公告禁用穿山甲入藥後，除 通乳丸類的製劑，其他製劑即以去除穿山甲成分 後，申請換證再上市銷售，市售品應皆有「去穿 山甲」標示，或於成分標示處已無穿山甲成分。

本次實驗於市面購買檢體時，購得通乳丸類中藥 製劑仍標示有穿山甲成分，故另再購入兩件去穿 山甲成分之復元活血湯、仙方活命飲作為對照之 用。

在檢體的處理上，就前研究對於龜苓膏的處 理方法，針對穿山甲製劑的形式，套用相同的溶 解溶液以及純化方式，可順利萃取純化製劑檢體 的DNA；但對於山甲片及炮山甲檢體，原有的溶 解溶液配方並無效果，經過多次嘗試，最後在溶 解溶液再加入SDS成分，才順利萃取得到DNA。

將萃取純化的檢體DNA進行PCR反應，所使 用的引子仍然是粒腺體12S rRNA基因的普遍性 引子⁽⁴⁾（R、F）進行第一次PCR，之後，因為製 劑檢體的藥材成分複雜，考慮到所萃取得到穿山

甲成分的DNA含量可能很少，而通乳丸類的製劑 檢體也含有鹿茸的第二種動物成分，並且考量到 專一性，依據nested PCR的理論，收集GenBank 中所有種類的穿山甲序列資料，並應用wobble的 引子設計，另行設計一對專屬鯪鯉科動物的引子

（MF、MR）進行nested PCR，以專一性地放大 製劑中可能含有的穿山甲DNA。

Nested PCR產物約114 bps大小，將之以電泳 分析結果，於圖一顯示有114 bps的片段出現，而 在炮山甲（Mb）的位置有片段出現，顯示本實 驗可自炮製過的穿山甲鱗片中萃取出DNA，另在 製劑M1到M4上，都可以看到有DNA片段出現，

顯示含穿山甲製劑檢體一如標示，含有穿山甲成 分。再將這些片段作定序分析，所有檢體序列相 同，再與GenBank比對，鑑定結果如表一所示，

其穿山甲成分均為中國穿山甲Manis pentadactyla

，而將所得定序的序列與GenBank比對序列之間 的差異，發現所有檢體都有二處共4個鹼基與Gen- Bank序列資料不同的地方，這些差異可能顯示族 群或棲地的特異性，並意示著這些檢體的穿山甲 成分來源可能相同，序列的比較與差異見圖二。

為了更加確認這些製劑確實含有穿山甲成 分，因此接下來的實驗特別就之前的定序鑑定結 果－中國穿山甲Manis pentadactyla，設計專一針 對其放大的引子（MF1），再進行nested PCR作 確認，以兩件標示已除去穿山甲成分的製劑M5、

M6作為對照，進行實驗，結果如圖三，顯示作山 甲片（M）及製劑檢體M1皆出現96 bps片段，而 圖一、 利用專屬鯪鯉科動物的引子進行nested PCR之電

泳結果。Lane 1:100 bps ladder maker, Lane 2~7:依序 是檢體 M、Mb、M1~M4, Lane 8: blank (no template)

1 50

Sample M1 GGGCTACATTTTCTAAAACAGAACACAAACGAACG CCCTAATGAAAACGA GenBank GGGCTACATTTTCTAAAACAGAACACAAACGAATA CCCTAATGAAAACGA

51 100

Sample CCAAAGGAGGATTTAGTAGTAAGCTAAGAATAGAAAGCTTAGCTGAA GenBank TTAAAGGAGGATTTAGTAGTAAGCTAAGAATAGAAAGCTTAGCTGAA

101 114 Sample CTCGGCTCTAAAGC GenBank CTCGGCTCTAAAGC

GGG GGG

圖二、GenBank資料庫Manis pentadactyla序列(gi:12700661)與製劑檢體M1定序序列比對

作為對照的M5、M6與blank皆無片段出現，並將 此次製劑檢體M1的PCR產物做定序，序列與之前 結果相同，確認前述的鑑定結果，製劑中確實含 有Manis pentadactyla的成分。

實驗結果確定所購得的市售穿山甲製劑通乳 丸類檢體，均含有Manis pentadactyla的成分，而 這些為通乳丸類的中藥製劑，其成分有鹿茸、白 芷、當歸、木通、穿山甲、黃耆及蜂蜜，實際上 所謂「通乳」效果的成分仍是以穿山甲為主，如 果依據政府命令除去穿山甲成分，或以其他藥材 如王不留行取代，如此是否會使藥材成分間失去 原有的交互關係而影響藥效，此更需要更進一步

的探討與研究，而目前就本局所進行的一些研究 中發現，中藥藥材中的指標成分在不同的方劑藥 材組成中，其移行率會有所不同，也就是說如果 方劑的成分藥材改變，其藥效成分釋出的比例或 組成也會因之不同，如此而來，原方劑在改用替 代藥材或刪除其中一種成分時，實應有仔細的評 估。

雖然在89年政府已公告禁用穿山甲，但本研 究92年所購入之製劑檢體，仍檢出有穿山甲之成 分，這些檢體應為禁令生效前所生產，尚未銷售 完畢的部分產品，這卻也顯示出上市後（Post- Market）藥品的監督管理，有其重要性與必需 性，而本研究之方法，正可提供給中藥上市後監 督管理之用。

結　論

本次研究的結果確認實驗方法可應用於中藥 製劑中藥材穿山甲基原的鑑定，而應用序列分析 比對的方法，更可鑑定鱗片或炮製過的鱗片藥材 是來自何種穿山甲，這不僅有助於保育類動物的 保護與管理，更進一步，對保育類動物入藥的中 藥使用與管理將有助益。

參考文獻

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W. 1992. Evidence form 12S ribosomal RNA sequences that onychophorans are modified arthropods. Science 258: 1345- 1349.

1.

2.

3.

4.

9

კΟǵаჹ

Lane 1:100 bps ladder maker, Lane 2:ξҘТ(M), Lane 3:ऀξҘᇙᏊᔠᡏ M1,Lane 4ǵ5:ѐऀξҘᇙᏊ M5ǵM6, Lane 6: blank (no template)

1. 2. 3. 4. 5. 6.

←96 bps

圖三、 以對Manis pentadactyla專一之引子（MF1）進行 nested PCR的電泳結果。

Lane 1:100 bps ladder maker, Lane 2:山甲片(M), Lane 3:穿山甲製劑檢體M1,Lane 4、5:去穿山甲製劑 M5、M6, Lane 6: blank (no template)

Identification of Pangolin Scales and Its Preparations by Nested PCR and DNA Sequencing Methods

KANG-TSU LU, CHI-FANG LO, HSIEN-CHANG CHANG AND JER-HUEI LIN

Pharmacognosy Division

ABSTRACT

A polymerase chain reaction (PCR) with DNA sequencing method has been developed to identify pangolin used in Chinese medicinal raw material and preparations. The samples of pangolin scales, collected from local dispensaries, were treated by lysis buffer, extracted their DNA by organic solution, and then purified using the commercial kit. In this study, we formulated the lysis buffer containing SDS and sarcosyl, and took advantage of the specificity of the kit to purify DNA. Taking mitochondrial 12S rRNA gene as the target template, the modified universal and newly designed primers were used for PCR and for nested PCR respectively. The nested PCR products were sequenced and the obtained sequences were compared with GenBank databases. The results indicated that the species of pangolin in the samples of raw material and preparations were Manis pentadactyla listed in CITES appendix II.

Key words: pangolin, PCR, nested PCR