前 言
黃麴毒素( aflatoxin, 簡稱 AF )是一群結構 相似且相當安定的黴菌次級代謝產物,包括 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1...等,於 不當儲存之食品和飼料常被發現,其中又以 AFB1最常檢出,其毒性也最強。黃麴毒素對 人類及動物具有高度肝臟毒性、致突變性及
致癌性,是目前所知致癌性最強之真菌毒素
(1,2,10,19,21),在動物試驗中發現AFB1會高度親和
性地與粒線體中DNA 共價結合,也會與細胞 中其它巨分子作用而產生致突變性或致癌性
(1,2,4),造成人類急性肝臟疾病並導致肝細胞退
化、壞死及纖維化等症狀(1,4)。 產生AF 之主要黴菌為黃麴菌
及 ,另 亦可能
台灣地區總膳食之黃麴毒素調查
談國雄 林蘭砡 傅幼敏 施養志
第五組
摘 要
行政院衛生署為保障國民飲食安全,自90 年度委託行政院農委 會農業藥物毒物試驗所進行食品污染物國人總膳食調查計畫(Taiwan total diet study),上述計畫根據國民攝食習慣設計具代表性之食譜,
食品原料皆由分配之採樣地點的傳統市場、超市及量販店總共八處採 樣、混合,依食譜烹調後混勻,續供分析食品中農藥、重金屬、環境 污染物及真菌毒素等污染物,以評估國人經由攝食之危害風險。計畫 中有關黃麴毒素之分析係由行政院衛生署藥物食品檢驗局負責。92 年 度完成分析之樣品包括 主食類:米飯16 件及稀飯各 16 件 進口及 加工食品:碗稞、肉粽、八寶粥、花生、米漿、牛乳、起司及發酵乳 各8 件,共計 64 件,結果於 2 件米漿中檢出黃麴毒素 B10.18 及 0.32 ppb,於 5 件牛乳檢出微量黃麴毒素 M1 0.013~0.076 ppb; 93 年分析 樣品包括 主食類;米飯、稀飯各8 件 進口及加工食品:細米粉、
小米、麥片、低脂牛乳、脫脂牛乳、全脂奶粉、調味乳、羊乳各 8 件,共計 80 件,結果於 8 件低脂牛乳、7 件脫脂牛乳、8 件全脂奶 粉、8 件全脂牛乳及 8 件羊乳檢出黃麴毒素 M10.003~0.044 ppb。綜合 二年結果顯示,國人膳食之黃麴毒素檢出量極微,均低於食品中黃麴 毒素之限量標準( 液狀乳黃麴毒素 M1為0.5 ppb,其它食品之總黃麴 毒素限量為10 ppb)。
關鍵詞:總膳食調查、黃麴毒素、危害風險評估、主食類、進 口及加工食品
產毒。最適合黃麴菌生長及產毒之溫度依菌 種而異,範圍介於 30 38℃間,另黃麴菌生 長受到水分之影響極大,穀類及飼料水分含 量超過15 %或相對濕度在 80 %以上,較適 合黃麴菌之生長與繁殖。故防止AF 污染,最 直接的方式莫過於防止黃麴菌在穀類或飼料 上生長,藉著適當控制水分、濕度及氧氣含 量,可以有效的抑制AF 產生(1,2,6,12,15,20)。AF 經 常污染花生、玉米、米、麥、棉子及豆類等
農作物(1,2,6,10),另經由食物鏈,乳品及畜產品
亦可能遭受AF 之污染,其中 AFB1在動物體 內經由氫氧基化作用( hydroxylation )代謝成 AFM1而存在乳品中(1.4.9.11.13.15.18),研究顯示稚齡 小孩,在斷奶前也可能接觸到黃麴毒素,原 因係母親攝入污染AF 之食品並將 AFM1分泌 於乳汁中(3);此外啤酒、可可及水果乾等都曾 發現污染黃麴毒素(1)。
由上可知經由食品攝食 AF 之機率相當 高,且受到毒素污染之食品,在氣味與外觀 上皆不易辨識。有鑑於此,行政院衛生署為 保障國民飲食安全而進行食品污染物國人總 膳食調查計畫(Taiwan total diet study,以下 簡稱TDS),希望藉由 TDS 得知國人飲食中 攝取污染物之危害風險程度。TDS 在世界各 國已進行多年,其執行方法為各國依其國民 之攝食習慣設計食譜,於不同地區及季節採 集生鮮食材或即食食品,經食前處理後以食 用狀態分析其中污染物含量,再依不同年齡 層及性別之國民攝食量計算其檢出污染物中 可能之暴露量,以評估經由攝食而接觸污染 物 之 種 類 和 量 對 健 康 之 影 響(5)。美 國 於 1961 1987 年(partⅠ)及 1987 1993 年
(partⅡ)進行數十年之總膳食調查計畫,經 由調查結果後列出各種食品污染物污染食品 之情形,以做為評估其美國人民取食之風險
性。世界衛生組織(WHO)為確保世界各地 食品之安全性,亦於1976 年成立「全球環境 污染物調查中之食品污染物調查及評估計 畫」(Global Environment Monitoring System/
Food Contamination Monitoring and Assessment program,簡稱 GEMS / Food)(5,16,17),由此可 見,TDS 調查對國民飲食安全之重要性。
本計畫主辦單位為行政院衛生署,執行 單位為行政院農委會農業藥物毒物試驗所
(藥試所),合作單位為中央研究院生物醫 學研究所、台灣大學公共衛生研究所、財團 法人食品工業發展研究所及行政院衛生署藥 物食品檢驗局。TDS 計畫包括四項工作,1.計 畫規劃2.採樣及前處理 3.樣品分析:包括分 析方法之確認、實驗室品管作業及最低檢出 量之要求。4.結果計算及風險評估。其中 1、
2、4 項皆由農業藥物毒物試驗所負責,第 3 項樣品中黃麴毒素之分析部分由藥物食品檢 驗局負責。本報告彙集92 93 年藥試所製備 食品樣品之黃麴毒素分析結果數據,除供作 本局資料庫用,亦彙送藥試所進一步評估危 害風險,做為我國調查國民飲食中污染物質 之參考。
材料與方法
一、試驗材料
藥試所根據國民攝食習慣設計具代表性 之食譜,於92 93 年間由北、中、南、東採 樣地點之傳統市場、超市及量販店購買食品 原料,先混合,依食譜烹調後再均質,以抗 凍玻璃樣品罐裝填,冷藏運送至藥檢局檢 驗。樣品收到後置-20℃冷凍庫中保存並儘速 檢驗,二年共計送樣192 件。
二、器材及儀器
免疫親和性管柱:分析 AFB1、AFB2、 AFG1、AFG2採用美國Vicam 公司 AflaP
TM 及 分 析 AFM1 採 用 Vicam 公 司 AflaM1TM,為比較免疫親和性管柱效能,
分析起司中AFM1亦試用英國R. Bioph- arm 公司之 AFLAPREP。
高效液相層析儀
日本Hitachi 公司製造之 L-6000 幫浦( 碘 液衍生化使用)、L-7100 幫浦、 L-7480 螢光偵測器、L-7200 自動樣品注射器,
Eppendorf TC-50 管柱保溫器,數據處理 則以訊華公司層析儀積分數據處理系統
(SISC)進行。
液相層析管柱
採用日本 Nacalai 公司製造之 Cosmosil 5C18-AR ( 5µm,內徑 4.6 mm 250 mm ) 管柱。
三、試藥
AFM1標準品為美國 Supelco 公司之產 品,添加適量乙月青,使其濃度為1.0 µ g/mL,分裝至褐色小瓶後,冷凍備用。
使用時,以液相層析用移動相溶液稀釋 到 適 當 濃 度 備 用。AFB1、AFB2、 AFG1、AFG2標準品為美國Supelco 公司 Aflatoxin Mix Kit-M 之產品,原液濃度 AFB1:1 µg/mL、AFB2:0.3 µg/mL、
AFG1:1 µg/mL、AFG2:0.3 µg/mL,使 用時以50 %甲醇稀釋至所需之濃度。
氫氧化鈉及矽藻土為試藥級純品,二氯 甲烷、正己烷、乙月青、甲醇均為 LC 級,配製液相層析用移動相之水使用去 離子水。
四、方法
樣品萃取方法及淨化
液 狀 乳 係 依 據 衛 生 署 署 授 食 字 第 0939316929 號公告方法,起司係依據 Dragacci 等(8,10)方 法,其 他 檢 體 則 依 據 CNS 4090/N6097 方法製備檢液,液狀 乳、起司及其他檢體(包含花生及其製 品、米 飯、稀 飯、細 米 粉、小 米、麥 片)流程分述如下:
1. 液狀乳中黃麴毒素 M1:液狀乳(冷藏 或冷凍須回復至室溫)或優酪乳(混 勻後取25 mL 以 0.1 N NaOH 調整至 pH 至 6.5),離心 15 分鐘,移去上層 脂肪,取50mL 之液狀乳或全部之優 酪乳以1 滴/秒之速度通過疫親合性管 柱,以去離子水10 mL 清洗 2 次,氮 氣吹乾管柱後,以乙月青4 mL 流洗,
流洗出之檢液,以氮氣吹乾,續以移 動相溶液2 mL 復溶,以 0.45µm 濾膜 過濾,取100 µL 注入高效液相層析 儀。
2. 起司中黃麴毒素 M1含量之檢驗流程:
秤取10 g 起司於攪拌容器中,加入 Di- chloromethane 80 mL 及 Hyflo-supercel 5~10 g 高 速 攪 拌 2 分 鐘,用 Di- chloromethane 40 mL 沖洗攪拌容器並 以濃縮瓶收集,所得之混合物盡可能 用濾紙充分過濾,過濾液經35 40℃
蒸發乾燥(減壓濃 縮乾燥),乾燥 後濃縮瓶內之殘留物以 MeOH:Wat- er: -Hexane(1:30:50 mL)復溶
(充分搖動濃縮瓶,讓殘留物完全洗 出),復溶後之液體移入分液漏斗中 並上下搖動,然後收集水相層下層,
再以10 mL/ 次之去離子水萃取 2 次後 收集水相層。取出適量水相層通過免 疫親和性管柱,以2 3 mL/min 流速 通過管柱(相當於 1 滴/秒),以去離子 水(10 mL/次)通過免疫親和性管柱 2 次,以移除污染物,用1-2 mL 之 ac- etonitrile 沖洗出 AFM1,收集於玻璃小 管,Acetonitrile 以 N2吹乾,再以ac- etonitrile 500µL 充分溶解復溶,取 100µ L 檢液注入 HPLC。
3. 各類檢體中黃麴毒素 B1、B2、G1、G2
含量之檢驗流程:檢體充分混合後取 100 g 磨碎混勻,秤取混勻之花生及其 製品25 g 置於不銹鋼杯中秤取混勻,
加氯化鈉 5 g,加 60 %甲醇 125 mL
(穀類及其製品50 g,置於不銹鋼杯 中,加氯化鈉5 g,加 80 %甲醇 100 mL),以 15,000 rpm 均質 2 分鐘後,
用Whatman 1 號濾紙過濾,花生及其 製品取濾液20 mL 加去離子水 20 mL
(穀類及其製品,取濾液10 mL 加 40 mL 去離子水),用玻璃濾紙做細過 濾,取濾液10 mL,以 1 滴/秒之流速 分別通過免疫親和管柱,以去離子水 10 mL 清洗免疫親和管 2 次(1 滴/秒 之流速),取HPLC 級甲醇 1 mL 以 1 滴/秒流速通過免疫親和管柱,收集純 化液於有容量刻度之褐色玻璃管中,
加1 mL 去離子水使體積為 2 mL 之檢
液,取50µL 檢液注入高效液相層析 儀。
標準曲線製作
1. AFM1:以移動相溶液稀釋 AFM1,配 製成0.03、0.05、0.1、0.5、1、5、10 ppb 之各種濃度之標準溶液,每次取 100µL 注入高效液相層析儀,每種濃 度做三重複,由波峰所得之平均面積 對標準溶液之濃度做圖(見圖一)。
2. AFB1、AFB2、AFG1、AFG2:以50%
甲醇稀釋成各種濃度(詳 見下表)之標 準溶液,每次取50µL 注入高效液相層 析儀,每種濃度做三重複,由波峰所 得之平均面積對標準溶液之濃度做圖
(見圖二、三、四及五)。
回收率試驗
取不含AFM1之鮮牛乳、片狀起司、優酪 乳添加0.5、0.2 及 0.5 ppb AFM1備用,
另取不含AFB1、AFB2、AFG1、AFG2之 米飯、稀飯、碗稞、肉粽、八寶粥、花 生、米漿添加AFB10.5 ppb、AFB2 0.15 ppb、AFG1 0.5 ppb、AFG2 0.15 ppb 備 用,依材料與方法四 製作檢液並分 析,換算濃度後除以添加濃度,再乘以 100 %即為回收率。
偵測極限
1. 儀器偵測極限(IDL)
將高濃度至低濃度之黃麴毒素標準品 以高效液相層析儀分析,所得之不同
黃麴毒素 標準溶液濃度(ppb)
AFB1 1 0.5 0.4 0.35 0.3 0.25 0.1 0.05 AFB2 0.3 0.15 0.12 0.105 0.09 0.075 0.03
AFG1 1 0.5 0.4 0.35 0.3 0.25 0.1 0.05 AFG2 0.3 0.15 0.12 0.105 0.09 0.075 0.03
圖一、黃麴毒素M1之標準曲線
圖二、黃麴毒素B1之標準曲線
圖三、黃麴毒素B2之標準曲線
圖四、黃麴毒素G1之標準曲線
濃度之波峰以積分儀軟體做訊號/雜訊 比(S/N)測試,以 S/N > 3 認定為可 偵測到之波峰,此波峰面積換算成之 濃度即為儀器偵測極限(IDL)。
2. 方法偵測極限(MDL)
於各種檢體中添加黃麴毒素標準溶 液,使其濃度為預估偵測極限之1 5 倍,以檢液製備流程製備檢液並予以 分析(重複分析至少4 次以上),將 所得之層析圖譜進行S/N 比測試,若 S/N > 3 則認為是波峰,即可求得方 法偵測極限之濃度。
高效液相層析之條件 1. AFM1
流速:1.0 mL/min。
注射量:100µL
管柱:Cosmosil 5C18-AR ,5 µm,內
徑4.6 mm 250 mm。
移動相溶液:去離子水、乙月青、甲 醇以68:24:8 (v/v)之比例混勻。
螢光偵測器:激發光譜為365 nm,發 射光譜為435 nm。
2. AFB1、AFB2、AFG1、AFG2
流速:1.0 mL/min
衍生化碘液流速:0.3 mL/min 注射量:50µL
管柱:Cosmosil 5C18-AR ,5 µm,內 徑4.6 mm 250 mm。
移動相溶液:45 %甲醇水溶液。
衍生化碘液:0.05 ﹪碘溶液。
螢光偵測器:激發光譜為360 nm,發 射光譜為440 nm。
計算公式
1. 液狀乳及優酪乳 圖五、黃麴毒素G2之標準曲線
AFM1含量(ppb,ng/mL)= C/X C:檢液之 AFM1濃度(ppb),由標準
曲線求得。
X:最終檢液濃縮倍數 X 液狀乳= 50 mL/2 mL = 25 X 優酪乳 = 25 mL/2 mL = 12.5 2. 起司
AFM1 含量(ppb,ng/g)=(C V)/ M C:檢液之 AFM1濃度(ppb),由標準
曲線求得。
V:最後定容檢液體積
M:最終定容檢液中所含樣品重(g) 3. 其餘檢體
黃麴毒素含量(ppb,ng/g )= (C Tv)/
W
W:最終定容檢液所含樣品重 (含水分 高者,需適度校正)
W 花生= ( 25 g/125 mL ) (20 mL/40 mL ) 10 mL= 1 g
W 其它 = ( 50 g/100 mL ) ( 10 mL/50 mL ) 10 mL= 1 g
Tv:最終定容檢液體積(2mL)。
C:檢液中各別黃麴毒素濃度 ( ppb ),
由標準曲線求得。
結果與討論
一、檢驗方法之確立
本調查對於液狀乳及優酪乳中AFM1,係 依據衛生署署授食字第0939316929 號公告方 法,其他樣品包括乾炒花生、米飯、稀飯、
八 寶 粥、米 漿、碗 稞、肉 粽、細 米 粉、小 米、麥片等係依據中國國家標準 CNS 4090/
N6097 之方法分析 AFB1、AFB2、AFG1、 AFG2,經驗證各回收率皆可達到80%以上。
圖六、含黃麴毒素 M1之羊乳(A)、低脂牛乳 (B)、脫脂牛乳(C)、全脂牛乳(D)之高 效液相層析圖
僅有起司中AFM1國內尚未有公定分析方法,
故依據 Dragacci 等人方法分析,並比較免疫 親和性管柱VICAM 公司之 AlfaM1及R.Bio- pharm 公司之 AFLAPREP,結果顯示兩廠牌 之萃取及淨化效果幾無差異,圖七為含AFM1
起司之高效液相層析圖譜,AFM1標準品之滯 留時間約為8 分鐘,分析儀器使用日本 Hitachi 公司製造之高效液相層析儀,對AFM1之儀器 偵測極限為0.03 ppb,分析起司中 AFM1之方 法檢測極限為0.2 ppb,另添加 AFM1至起司 中達0.2 ppb,起司片及起司粉回收率皆約為 68 %,起司絲回收率則低於 60 %,結果詳見 表一。起司片及起司粉之回收率雖屬可接受 範圍,惟仍可再進行不同種類之起司產品進 行分析,以建立不同種類起司之分析資料。
根據 Dragacci 等人(9)之研究,針對22 種 不同之起司做試驗,結果回收率介於63 110
%,顯示不同起司為基質做添加回收率試 驗,呈現變異較大,推測回收率高低與基質
不同、人為操作、器材間差異甚至是加工起 司內含之食品添加物或其它未知之干擾物質 等因素之影響可能有關,這些影響因素也是 未來需要進一步研究之方向。
圖七、外添加黃麴毒素M1起司之高效液相層析圖
表一、起司黃麴毒素M1回收率試驗結果
起司種類 添加量 (ppb)
回收率a (%)
CV b (%)
起司片 0.2 68.0 5.1 7.5
起司粉 0.2 68.2 6.2 5.2
起司絲 0.2 48.0 5.3 6.2 a:二重複試驗結果
b:CV 即為變異係數(coefficient of variation)
表二、92 93 年各類食品檢出黃麴毒素之件數
類別 抽樣年份 檢體件數 檢出黃麴毒素a 檢出黃麴毒素M1
件數( ﹪) 含量(ppb) 件數( ﹪) 含量(ppb) 主食類
米 飯 92 93
16 8
0 0
0 0
-b
-
-
- 稀 飯 92
93
16 8
0 0
0 0
-
-
-
- 加工食品
乾炒花生 92 8 0 0 - -
米 漿 92 8 2(25) 0.18~0.32 - -
碗 稞 92 8 0 0 - -
肉 粽 92 8 0 0 - -
八寶粥 92 8 0 0 - -
細米粉 93 8 0 0 - -
小 米 93 8 0 0 - -
麥 片 93 8 0 0 - -
起 司 92 8 - - 0 0
全脂牛乳 92 8 - - 5(62.5) 0.013~0.076
全脂奶粉c 93 8 - - 8(100) 0.011~0.044
低脂牛乳 93 8 - - 8(100) 0.010~0.026
脫脂牛乳 93 8 - - 7(87.5) 0.005~0.017
優 酪 乳 92 8 - - 0 0
羊 乳 93 8 - - 8(100) 0.003~0.008
調 味 乳 93 8 - - 0 0
a:黃麴毒素係指 AFB1、B2、G1及G2之總和。
b:"-"表未檢驗。
c: 已配製為液狀乳。
三、總膳食調查樣品之黃麴毒素分析結果 本調查分析樣品數共計 192 件(92 93 年),調查結果詳見表二,92 年於 8 件全脂 牛乳中檢出5 件(62.5 %)含有微量 AFM1, 於8 件 8 件起司及優酪乳中均未檢出 AFM1。 93 年製備之乳品包含低脂乳、脫脂乳、調味 乳、羊乳及全脂奶粉,其中調味乳及羊乳應 是國內少數針對此類乳品做黃麴毒素之分 析,結果於各 8 件全脂奶粉、低脂牛乳、脫 脂牛乳、羊乳中分別檢出8 件(100 %)、8 件(100 %)、 7 件(87.5 %)。羊乳、低脂 牛乳、脫脂牛乳及全脂牛乳樣品中之AFM1高 效液相層析圖譜如圖六(A、B、C 及 D)所 示。AFM1之來源係因動物受到AF 之污染進 而造成生乳含AFM1,高檢出比例則因酪農將 生乳交集乳站混合後由乳品加工廠產製各式 液狀乳,一旦混入污染有AFM1之生乳,即可 造成後續產品含微量AFM1現象,因此為預防 AF 污染牛乳(羊乳)受到 AF 污染。
92~93 年計畫中其餘樣品,如米飯、稀 飯、乾 炒 花 生、米 漿、碗 稞、肉 粽、八 寶 粥、細米粉、小米、麥片均未檢出 AFB1、 AFB2、AFG1、AFG2,但於8 件米漿中則檢出 2 件(25 %)含有 AFB1,分別為0.18 及 0.32 ppb(見表二)。
本調查結果顯示台灣地區之乳品雖常檢 出微量 AFM1,仍可安心使用。其他檢體方 面,僅於2 件米漿中檢出 AFB1,由於米漿之 主要成份為米及花生,檢出AFB1係來自於花 生,因此建議業者以花生做加工食品時應注 意其原料之品質。
本調查係國內首次對米飯、稀飯,八寶 粥,碗稞、肉粽、羊乳、調味乳等加工食品 進行AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1之污
染調查,這些經調理加工的食品,其原料大 多含有食品添加物、油脂或其它物質等,在 分析時是否造成AF 萃取效果之影響,值得進 一步探討。但分析結果顯示AF 在八寶粥、碗 稞、肉粽等樣品之回收率都屬可接受之範 圍,可見本方法亦可適用於上述調理食品。
結 論
由92 及 93 年度之檢驗結果,發現在 176 件樣品中液狀乳及其製品共64 件,檢出 35 件
(54.7 %)含黃麴毒素 M1,其餘樣品除米漿 檢出黃麴毒素外,皆未檢出黃麴毒素。雖液 狀乳及其製品與米漿檢出極微量之黃麴毒 素,但仍然突顯出這類食品較易受到黃麴毒 素之污染。為降低黃麴毒素之污染量,根本 之道應從食品、飼料原料之儲存與管理著 手。本調查之宗旨即為瞭解國人每日飲食中 食物受到有毒物質之污染情形,藉以提供資 料予衛生相關單位,期能做好國人飲食衛生 的把關工作。
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Total Diet Survey of Aflatoxin in Taiwan
GWO-SHYONG TAN, LAN-CHI LIN, YOU-MIN FU, YANG-CHIH SHIH
Division of Food Microbiology
ABSTRACT
In order to understand the contents of aflatoxin in diet in Taiwan, Taiwan Agricultural Chemicals and Toxic Substances Research Institute Council of Agriculture (TACTRI/COA), provided 192 samples and we collected food materials from traditional market, supermarket and mall from 2003 to 2004 for the syudy.
The categories of the 192 samples included (1) core food, such as rice, congee and (2) imported and processed food, such as rice cake, rice dumpling, rice congee, peanut, rice syrup, milk products and ferment milk products, cheese, flavor milk, rice noodle, wheat flakes, low-fat milk, skim-milk, whole fat milk and goat milk. The results showed that the content of B1aflatoxin found in two rice syrup samples were 0.18 and 0.32 ppb, M1aflatoxin content found in five whole fat milk samples ranged from 0.013~0.076 ppb, and ranged from 0.003 to 0.044 ppb in the remaining milk products including eight samples of low-fat milk, seven skim milk, eight whole fat milk powder and 8 goat milk. All samples in this investigation were under safety regulatory limit. The results would be presented to TACTRI/COA for risk assessment.
Key words : Total Diet Survey, aflatoxin, risk assessment, core food, imported and pro- cessed food