保護作用人工培養的北冬蟲夏草子實體對 mitomycin C 誘導基因毒性之

(1)

人工培養的北冬蟲夏草子實體對 mitomycin C 誘導基因毒性之保護作用

宋文君

¹

林恆弘

²

施美份

²

黃秀琴

¹

劉宗榮

³

陳秋蘭

²

*

1嘉南藥理科技大學藥物科技研究所

2嘉南藥理科技大學藥學系

3國立陽明大學環境衛生研究所

摘要

中華冬蟲夏草〈中華蟲草〉是一種中國傳統滋補的昂貴中草藥材，因此市面上出現許多偽品，故人們開始尋找與中華蟲草具有相同活性的替代品。目前市面上常用北冬蟲夏草〈北蟲草〉作為中華蟲草的替代品。而中華蟲草的主要成分及相關的藥理活性已被許多科學家證實，但是有關北蟲草的研究卻不多，所以本研究之目的在評估人工培養的北蟲草子實體對 mitomycin C 所誘導的基因毒性是否具有保護的作用。微核試驗是評估基因毒性的方法，以計數 1000 個網狀細胞中出現多少具有微核的網狀細胞來加以評估，而 mitomycin C〈MMC〉是一種具有基因毒性的抗腫瘤藥物。在此實驗中，我們先分別以胃管餵食 ICR 小鼠 125、250、500 或 1000mg/kg 的人工培養北蟲草子實體懸浮液連續一週後，

在第七天給予腹腔注射 0.5 或 1mg/kg 的 MMC 以誘導基因毒性，並在腹腔注射 MMC 後的第 24、48 及第 72 小時分別進行眼窩週邊血採樣來計數微核的數量。本研究結果發現預先餵食 1000mg/kg 人工培養北蟲草子實體的懸浮液連續十天後，對 MMC 在第 24 小時所誘導的基因毒性具有保護作用；而 500mg/kg 人工培養北蟲草子實體的懸浮液則在 MMC 注射後的第 72 小時才有明顯減少的趨勢。綜合以上結果，本研究認為人工培養的北冬蟲夏草子實體對 MMC 所誘導的基因毒性具有保護的作用。

關鍵詞：北冬蟲夏草、基因毒性、微核

*通訊作者:嘉南藥理科技大學藥學系 Tel: +886-6-2664911*2222

Fax: +886-6-2667318

E-mail: [email protected]

壹、前言

在現今的台灣社會，由於社會經濟發展快速，

人們的生活不僅是壓力增加，也要面對各種環境污染的危險，所以人們大多訴求服用一些維他命或是保健食品以求身體健康。所謂：「藥補不如食補」，

故我們的國人一向喜愛服用天然中草藥的保健食品，因此保健食品的相關的資訊及需求也就逐漸增加。

中華冬蟲夏草〈Cordyceps sinensis〉是大家耳

熟能詳的滋補中藥，也能當作保健食品。然而，天然野生的中華蟲草之生長條件十分嚴苛，相對來說它的產量也是十分稀少，故真正天然野生的冬蟲夏草其價格可以說是相當的昂貴，因此現今的市面上有許多的假貨充斥，這些假貨可能除了毫無療效之外，甚至也會危害身體〈田明 1998, 王煥華等人 1998, Hsu et al. 2002〉。所以現今講求醫療保健的時代，人們除了努力尋找天然野生冬蟲夏草的替代品

V O L . 3 7 , P P . 2 6 - 3 1 , 2 0 1 1

-

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外，另一方面則是往人工大量培養冬蟲夏草的方面進行，冀希能替代有療效的中華蟲草。

北冬蟲夏草〈Cordyceps militaris〉是常見的中 華蟲草替代品，但目前關於北蟲草的科學研究文獻並不是很多。已知北蟲草可有效延長小鼠游泳的時間〈Jung et al. 2004〉；促進胰島素分泌、改善胰島素耐受性〈Choi et al. 2004〉及降血糖的效果〈Zhang et al. 2006〉；有抗發炎、抗血管增生及減少疼痛的活性〈Won and Park 2005〉；誘導細胞凋亡〈Lee et al. 2006〉；增強免疫力〈Kim et al. 2006〉；抗氧化

〈Yu et al. 2006〉；以及改善公豬精子的質與量之作用〈Lin et al. 2007〉。將北蟲草與中華蟲草的主要的成分經分析比較後並無明顯差異〈Huang et al.

2003〉，因此，人工培養的北蟲草是很有開發的前景〈吳畏等人 2000〉。

本研究即是以人工培養的北蟲草子實體為實驗題材，在之前的研究中已證實此北蟲草不具有急毒性及基因毒性〈陳秋蘭等人 2008〉，因此本研究之目的在評估人工培養的北蟲草子實體對 mitomycin C〈MMC〉所誘導的基因毒性是否具有化學保護的作用。

貳、材料及方法

一、北蟲草子實體的培養及懸浮液之製備

北冬蟲夏草菌種由富享生物科技公司從食品工業研究所購買，將購買得的菌種先擴大培養於液體培養基中。另外準備玻璃廣口瓶，內加入三分之一高度之熟米飯於各瓶罐中，再加入液體培養基之菌種，於日光燈下 25℃培養 45 天，即可得成熟橙紅色子實體，將子實體部份取出，分析其內所含的蟲草素〈cordycepin；3’-deoxy-adenosine〉、蟲草多醣體〈cordycepic polysaccharide〉及蟲草酸

〈cordycepic acid；mannitol〉等含量後〈游慧美等人 2005；Chuang et al. 2005〉，挑選出活性成分含量最多的菌株再加以大量培養。將優質培養後的子實體磨碎成粉末後，均勻懸浮在 0.1% 的甲基纖維素〈methylcellulose〉中，以胃管餵食實驗老鼠。

二、微核分析

將雄性 ICR 小鼠各分成實驗組、對照組及正對照組，每組 5 隻。適應一星期後，每隻記錄其實驗前體重，在每天上午預先以胃管餵食小鼠 0.1%

甲基纖維素水溶液〈對照組及正對照組〉、不同劑量人工培養的北蟲草子實體懸浮液〈實驗組〉連續七天後，再於第七天下午以腹腔注射 0.5 mg/kg 或 1 mg/kg 的 MMC 以誘導微核的產生；對照組則是在腹腔注射生理食鹽水，以比照實驗組及正對照組之處理。此時仍於每天早上繼續餵食 0.1%甲基纖維素水溶液或北蟲草懸浮液至第十天。給予 MMC 後，分別於第 24、48 小時及第 72 小時以毛細管採取眼窩血，滴入預處理好 1 mg/ml acridine orange 的載玻片中，蓋上蓋玻片後放置於螢光顯微鏡中，

記數 1000 個網狀細胞〈reticulocyte〉中有多少細胞具有微核〈micronucleus〉，以微核數目的多寡來評估基因毒性的程度〈Hayashi et al. 1992〉。

三、統計方法

實驗所得之數據均使用單維變異數分析法

〈one-way ANOVA〉來評估同一個時間點各組別間的差異性。當 P 值小於 0.05 時，則表示實驗數據具有統計上顯著的差異性。

参、結果及討論

Mitomycin C〈MMC〉是一種從 Streptomyces caespitosus 分離純化出來的抗生素，但其殺菌的效果較弱，反之卻具有細胞的毒殺作用，在臨床上當作一種抗癌藥物。MMC 在體內會經由酵素代謝成為有活性的中間代謝物及自由基，活性的中間代謝物對 DNA 進行烷化作用〈alkylation〉，與 DNA 形成交叉連結〈cross-link〉，在 DNA 進行修補的過程中造成 DNA 的斷裂；自由基也會損傷 DNA，且抑制 DNA 的複製與細胞的分裂，因此可以毒殺癌細胞。但由於其細胞毒殺作用不具專一性，除了癌細胞外，也會毒殺正常細胞〈Katzung 2007；Korkina et al. 2000〉。在本研究中則以 MMC 來誘導微核，

以評估北蟲草是否對基因毒性具有保護之作用。

(3)

微核〈micronucleus〉是一小段染色體片斷丟失，殘留在細胞質所形成的。主要是由於斷裂的染色體片段，在細胞分裂之際，未能附著於紡綞絲分向兩極，因此在子細胞形成時，部分核質 DNA 未被包含於正常之細胞核內，而游離於細胞質中形成微核。Hayashi 等人利用 acridine orange 螢光染劑可以將 DNA 和 RNA 分別染成黃綠色螢光和紅色螢光，藉由兩種螢光顏色的差異，可以清楚分辨含有微核〈一種 DNA〉的網狀細胞〈一種未成熟的紅血球細胞〉及只含有 RNA 的網狀細胞，此種螢光染色法的發現大大地提高微核試驗的靈敏度

〈Hayashi et al. 1983〉。因此，微核試驗被認為是一種評估化合物是否導致染色體損傷或丟失等基因毒性的可信方法。

在本研究中，我們先測試 MMC 是否在 ICR 小鼠中能誘導微核產生。將雄性 ICR 小鼠 15 隻分為 3 組，每組 5 隻，實驗組分別在腹腔注射 0.5mg/kg 或 1mg/kg 的 MMC 以誘導微核，對照組則是在腹腔注射同體積的生理食鹽水。實驗結果如圖 1 所示，MMC 確實能誘導微核的產生，且呈現劑量相關性〈*：p <0.05，與對照組比較表示具有統計上的差異〉。而 MMC 所誘導的微核在第 48 小時數量最多，但在第 72 小時後又降到和第 24 小時差不多，此趨勢可能與 DNA 的修補有關。

24 48 72 Time ( hours)

Micronucleus numbers / 1000 reticulocytes

0 20 40 60

80 Control (saline) 0.5 mg/kg MMC 1 mg/kg MMC

*

* *

*

* *

圖 1 Mitomycin C 在雄性 ICR 小鼠所誘導的微核數變化

將雄性 ICR 小鼠 30 隻分為 6 組，每組 5 隻，

對照組及正向對照組均是餵食 0.1%的甲基纖維

素，實驗組則分別餵食 125mg/kg、250mg/kg、

500mg/kg 或 1000mg/kg 不同劑量人工培養的北蟲草子實體懸浮液，連續每天早上餵食 7 天後，在第七天下午，除了對照組是腹腔注射同體積的生理食鹽水外，其餘組別的實驗小鼠均在腹腔注射 1mg/kg 的 MMC 以誘導微核，此時仍於每天早上繼續餵食北蟲草懸浮液。並在注射 MMC 後的第 24、48 及 72 小時，分別以毛細管採取眼窩週邊血作微核計數，以評估不同劑量人工培養的北蟲草子實體對 MMC 所誘導之微核是否具有保護作用。

結果如圖 2 所示，同樣地，1mg/kg 的 MMC 可以誘導微核增加〈#：p <0.05，與對照組比較表示具有統計上的差異〉。而人工培養的北蟲草子實體在 1000mg/kg 連續餵食 10 天後，可減少 1mg/kg 的 MMC 在第 24 小時所誘導的微核數量〈*：p

<0.05，與 MMC 組比較表示具有統計上的差異〉。另外，125~1000mg/kg 人工培養的北蟲草子實體連續餵食 10 天後，也可降低 1mg/kg 的 MMC 在 72 小時所誘導的微核數〈p<0.05〉。但人工培養的北蟲草子實體對 1mg/kg 的 MMC 在第 48 小時所誘導最高量微核雖有稍微降低，但卻不具統計上差異。因此，在後續實驗則維持同樣劑量預處理 7 天，但將 MMC 的劑量減半至 0.5mg/kg，以評估人工培養的北蟲草在此劑量下是否對基因毒性具有更明顯的保護作用。

圖 2 人工培養的北蟲草子實體對 1mg/kg 的 mitomycin C 所誘導微核之保護作用

24 48 72 Time (hours)

Micronucleus numbers /1000 reticulocytes

0 20 40 60 80 100

0.1% Methylcellulose + saline 0.1% Methylcellulose + 1mg/kg MMC 125 mg/kg CM + 1mg/kg MMC 250 mg/kg CM + 1mg/kg MMC 500 mg/kg CM + 1mg/kg MMC 1000 mg/kg CM + 1mg/kg MMC

* ^#* * * *

#

(4)

將雄性 ICR 小鼠 25 隻分為 5 組，每組 5 隻，

正向對照組先餵食 0.1%的甲基纖維素，不同劑量的實驗組則分別餵食 125mg/kg~1000mg/kg 人工培養的北蟲草子實體懸浮液，連續每天早上餵食 7 天後，在第 7 天下午，則在所有實驗小鼠的腹腔注射 0.5mg/kg 的 MMC 以誘導微核。在注射 MMC 後的第 24、48 及第 72 小時，分別以毛細管採取眼窩週邊血以作微核計數。從圖 3 的結果可知，在第 24 小時，同樣地，只有 1000mg/kg 人工培養的北蟲草才可預防 0.5mg/kg 的 MMC 所誘導的微核。

但在第 48 小時，125~1000mg/kg 人工培養的北蟲草均可抑制 0.5mg/kg 的 MMC 所誘導的微核。而在 72 小時，只有 500mg/kg 及 1000mg/kg 人工培養的北蟲草才能降低 0.5mg/kg 的 MMC 所誘導的微核〈*：p <0.05，與 MMC 組比較表示具有統計上的差異〉。

圖 3

人工培養的北蟲草子實體對 0.5mg/kg 的 mitomycin C 所誘導微核之保護作用

已知 MMC 是因代謝成活性中間代謝產物及自由基而造成 DNA 損傷，進而誘導微核的產生

〈Korkina et al. 2000〉。而北蟲草已被證實具有抗氧化的作用，且此抗氧化能力不是來自蟲草素及腺苷(adenosine)，而是來自多醣體〈Yu et al. 2006〉。

因此本研究結果證實人工培養的北蟲草子實體可減少 MMC 所誘導的基因毒性作用，此保護作用可能就是因為北蟲草中所含多醣體之抗氧化能力，減少 MMC 代謝所產生的自由基對 DNA 造成的損

傷，進而降低微核數目。

此外，北蟲草也具有增強免疫力的作用〈Kim et al. 2006〉，是否因此而增加斷裂損傷的染色體被修補，或是因增加脾臟活性，使含有微核的網狀細胞被脾臟中的吞噬細胞吞噬破壞，因而降低微核數目，則有待更進一步的研究。

肆、謝辭

本研究得以完成，非常感謝富享生物科技所提供的北蟲草子實體。另外，非常感謝陽明大學環境衛生研究所的劉宗榮教授提供動物飼養及螢光顯微鏡等儀器設備的協助。

伍、參考文獻

王煥華、倪惠珠、儲農〈1998〉‧中國藥話集: 漫 談中國名醫名藥趣事〈四〉，初版，臺北市，旺文社，40-45 頁。

田明〈1998〉‧冬蟲夏草人人愛，初版，臺北市，

耶魯國際文化事業有限公司，33-35, 51-52 頁。

吳畏、高新華、崔星明、錢國琛、陳佛〈2000〉‧

北冬蟲夏草〈Cordyceps militaris〉的研究應用概 況〈綜述〉，上海農業學報，16: 99-104.

陳秋蘭、宋文君、黃秀琴、林恆宏、劉宗榮〈2008〉‧ 人工培養的北蟲草子實體之急毒性及基因毒性評估‧嘉南學報，34，35-43。

游慧美、唐自強、陳秋蘭、王四切、凌雲琪、林恆弘、黃秀琴〈2005〉‧北冬蟲夏草子實體多醣體之含量測定，2005 中國藥學年會暨學術研討會，台南，113 頁。

Choi, S.B., Park, C.H., Choi, M.K., Jun, D.W., Park, S. (2004). Improvement of insulin resistance and insulin secretion by water extracts of Cordyceps militaris, Phellinus linteus, and Paceilomyces tenuipes in 90% pancreatecomized rats. Biosci., Biotechnol. Biochem., 68: 2257-2264.

Chuang, C.H., Yu, H.M., Huang, S.C., Wang, T.C., Chen, C.L., Ling, K., Tang, T.C. (2005).

Determination of mannitol in Cordyceps militaris by capillary electrophoresis with electrochemical

24 48 72 Time (hours)

Micronucleus numbers/1000 reticulocytes

0 10 20 30 40 50

60 0.5mg/kg MMC

125mg/kg CM+0.5mg/kg MMC 250mg/kg CM+0.5mg/kg MMC 500mg/kg CM+0.5mg/kg MMC 1000mg/kg CM+0.5mg/kg MMC

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detection. The 20^th Symposium on Natural products, Taipei, pp. 131.

Hayashi, M., Sofuni, T., Ishidate, M. Jr. (1983). An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test. Mutat. Res., 120:

241-247.

Hayashi, M. Kjodama, Y. Awogi, T. Suzuki, T. Asita, AO.(1992). Sofuni, T. The micronucleus assay using peripheral blood reticulocytes from mitomycin C- and cyclophosphamide-treated rats.

Mutat. Res., 278: 209-213.

Hsu, T.H., Shiao, L.H., Hsieh, C., Chang, D.M.

(2002). A comparison of the chemical composition and bioactive ingredients of the Chinese medical mushroom DongChongXiaCao, its counterfeit and mimic, and fermented mycelium of Cordyceps sinensis. Food Chemistry, 78: 463-469.

Huang, L.F., Liang, Y.Z., Guo, F.Q., Zhou, Z.F., Cheng, B.M. (2003). Simultaneous separation and determination of active components in Cordyceps sinensis and Cordyceps militaris by LC/ESI-MS. J.

Pharm. Biomed. Anal., 33: 1155-1162.

Jung, K., Kim, I.H., Han, D. (2004). Effect of medicinal plant extracts on forced swimming capacity in mice. J. Ethnopharmacol., 93: 75-81.

Katzung, B.G. (2007). Basic and clinical pharmacology. 10^th edition, McGraw Hill Inc., pp.

894-895.

Kim, G. Y., Ko, W.S., Lee, J.Y., Lee, J.O., Ryu, C.H., Choi, B.T., Park, Y.M., Jeong, Y.K., Lee, K.J., Choi, K.S., Heo, M.S., Choi, Y.H. (2006). Water extract of Cordyceps militaris enhances maturation of murine bone marrow-derived dendritic cells in vitro. Biol. Pharm. Bull., 29:354-360.

Korkina, L.G, Deeva, I.B., Biase, A.D., Iaccarino, M., Oral, R., Warnau, M., Pagano, G. (2000).

Redox-dependent toxicity of diepoxybutane and mitomycin C in sea urchin embryogenesis.

Carcinogenesis, 21: 213-220.

Lee, H., Kim, Y. J., Kim, H.W., Lee, D.H., Sung, M.K., Park, T. (2006). Induction of apoptosis by Cordyceps militaris through activation of caspase-3 in leukemia HL-60 cells. Biol. Pharm.

Bull., 29: 670-674.

Lin, W.H., Tsai, M.T., Chen, Y.S., Hou, R.C., Hung, H.F., Li, C.H., Wang, H.K., Lai, M.N., Jeng, K.C.

(2007). Improvement of sperm production in subfertile boars by Cordyceps militaris supplement.

Am. J. Clin. Med., 35: 631-641.

Won, S.Y. and Park, E.H.(2005). Anti- inflammatory and related pharmacological activities of cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris. J. Ethnopharmacol., 96:

555-561.

Yu, H.M., Wang, B.S., Huang, S.C., Duh, P.D. (2006).

Comparison of protective effects between cultured Cordyceps militaris and natural Cordyceps sinensis against oxidative damage. J. Agric. Food. Chem., 54: 3132-3138.

Zhang, G., Huang, Y., Bian, Y., Wong, J.H., Ng, T.B., Wang, H.(2006). Hypoglycemic activity of the fungi Cordycepin militaris, Cordyceps sinensis, Tricholoma,mongolicum, and Omphalia lapidescens in streptozotocin-induced diabetic rats.

Appl. Microbiol. Biotechnol., 72: 1152-1156.

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The protective effect of cultured fruiting body of Cordyceps militaris in mitomycin C-induced genotoxicity

Wen Chung Sung

¹

Hung Hong Lin

²

Mei Fein Shih

²

Shiow Chyn Huang

¹

Tsung Yun Liu

³

Chiu Lan Chen

^2*

1Graduate Institute of Pharmaceutical Science,

2Department of Pharmacy,

Chia-Nan University of Pharmacy and Science, Tainan, Taiwan 71701, R.O.C.

3Institute of Environmental and Occupational Health Sciences,

National Yang Ming University

Abstract

Cordyceps sinensis (CS) is an expensive tonic Chinese herbal medicine. Therefore, people look for a similar pharmacological effects substitute of CS when many counterfeits and mimics of CS always found in markets, while Cordyceps militaris (CM) is a popularly using and cheaper natural of CS. The purpose of this study was evaluated the protective effect of cultured fruiting body of CM in mitomycin C-induced genotoxicity.

The micronucleus test is an evaluated genotoxicity method by counting how many reticulocytes contained micronuclei (MN) in 1000 reticulocytes. And mitomycin C is a famous anti-tumor cytotoxic drug. In this study, we had designed to pre-treat ICR mice with 125, 250, 500 and 1000 mg/kg cultured fruiting body of CM (o.p.) for seven days, then given 0.5 mg/kg or 1 mg/kg MMC by intraperitoneal (i.p.) at the 7th day, then collected orbital peripheral blood of mice to count the number of MN after mitomycin C treatment at 24, 48 and 72 hours. We found that cultured fruiting body of CM decreased the frequency of MN after mitomycin C treatment at 24 hours (1000 mg/kg CM) and 72 hours (500, 1000 mg/kg) (p<0.05). In this study, our results suggest that cultured fruiting body of CM may contribute to the prevention of mitomycin C-induced genotoxicity.

Key words: Cordyceps militaris; genotoxicity; micronucleus

*Correspondence:

Department of Pharmacy, Chia-Nan University of Pharmacy and Science, Tainan, Taiwan 71710, R.O.C.

Tel: +886-6-2664911*2222 Fax: +886-6-2667318