中華民國第 51 屆中小學科學展覽會 作品說明書
科別：生物科 組別：高中組
作品名稱：Toxic Out
─枯草桿菌對農藥的分解
關鍵詞：農藥、枯草桿菌、微生物製劑
編號：
摘要
枯草桿菌(Bacillus Subtilis)，因其對許多植物病菌有拮抗作用，近年來常被用來製成微生 物製劑進行植物病害與生物防治而聞名，但它仍有一樣令我們感興趣的功用─就是加速農藥 分解。
本實驗的目的是在於探討枯草桿菌為生物製劑施用於植物後，其對於農藥殘留之影響。
於前準備試驗中，檢測傳統市場、超市與家中的蔬菜，發現除了自家農田所種植的蔬菜之外，
均有農藥殘留，顯示目前農摘種蔬果農藥使用氾濫，已嚴重影響人民食的安全。農藥於自然 界中即可自然分解，微生物體內已知具有多項酵素能分解農藥，試驗嘗試分離土壤及納豆普 遍存在之枯草桿菌，發現其能與植物共生存，顯示其與農藥的分解或許有關聯性。再於農藥 殘留分解試試驗中，我們使用種植四週之茼蒿，噴灑陶斯松、貝芬替、益達胺、亞托敏以及 因得克等農藥，每三天分別處理微生物製劑 TKS1-1 及 WG6-14，對照組則噴水以同方法處理。
試驗中發現五種農藥均能被有效分解。顯示微生物處理能有效加速農藥衰退加速，未來若能 於農田間普及使用可縮短農藥使用後的安全採收期。
壹、研究動機
茼蒿農藥檢驗 消基會：高達5成有農藥殘留
摘錄自2010年12月28日中時電子報台北報導
寒冷的冬天吃火鍋，茼蒿是不可缺少的搶手貨，為了替消費者把關，消費者文教基金會在日 前進行茼蒿菜農藥殘留檢驗，28日公布檢驗結果，在採樣20件茼蒿菜樣品調查中發現，其 中更有3件樣品被檢出殘留不止一種農藥。
據消基會表示，這3件樣品分別為「景美市場外攤販」、「熊威超市」及「環南市場甲棟生群 商行」；而「熊威超市」及「環南市場甲棟生群商行」更是同時檢出含有三種農藥。
茼蒿是大家在冬天吃火鍋時的好夥伴，但人們所不知道的是，當我們想親自燉煮火鍋或 者到火鍋店享受美味的同時，不知不覺將農藥吃進肚子裡了，或許你會覺得只是微小的量，
不足以影響人的健康，但那些致命的毒素卻一點一滴的囤積在體內，像是不定時炸彈一般，
趁著你最沒有防備的時候引爆。
隨著台灣農業的迅速發展，大家對農產品品質的要求以及安全性日趨迫切，農藥的重要 性也與日俱增。但因大家太強調其殺蟲和殺菌的效果而在使用時未加以控制用量，也有一些 農民在噴灑農藥後因天氣因素或者市場需求而太早採收，造成大量農藥殘留的蔬果流入市 面。難道，農藥的發明真的是寂靜的春天之元兇嗎？這挑起了我們的興趣，決定試試以枯草 桿菌做成的微生物製劑是否能夠有效分解農藥，縮短安全採收期，省下等待農藥消退的時間，
農夫們採得開心，人們吃得放心。
貳、研究目的
一、檢測超市、傳統市場和家中農田的蔬果是否有農藥殘留，並探討殘留農藥的種類及多寡。
二、認識枯草桿菌的特性與型態。
三、檢測家中土壤以及市售納豆中是否有枯草桿菌的存在。
四、以親自種植的茼蒿為樣本，檢測枯草桿菌在安全採收期中對農藥的分解效果。
參、實驗材料、研究設備及器材
一、供試菌株以及植物樣本
（一）枯草桿菌(Bacillus Subtilis)WG6-14
（二）枯草桿菌(Bacillus Subtilis)TKS1-1
（三）茼蒿
（四）家中土壤
（五）市售納豆（楓康超市以及松青超市）
（六）家中蔬果（傳統市場和家中農田）
二、實驗用培養基
馬鈴薯蔗糖培養基平板製備（PSA）
此培養基用於養枯草桿菌以及土壤菌的鑑定
1.將馬鈴薯秤重 200g(約 2 粒小馬鈴薯)削皮並切片至適當厚度，煮沸至馬 鈴薯軟化
2.取出汁液，以紗布對折過濾約一、二次，過濾大顆粒殘渣 3.秤重 20g 蔗糖
4.分別量秤 7.5g 洋菜粉分裝置 2 個血清瓶(不影響酸鹼值，故可以直接倒入) 5.將溶液加蒸餾水至大燒杯中大約 1L，加入蔗糖並攪拌均勻
6.放入磁石並擺置酸鹼校正儀下，固定 pH 值至 7.0(若溶液過酸，加入 NaOH；
若溶液過鹼，則加入 HCl)
7.倒入大量筒中加蒸餾水定量至 1L，分別倒入兩個 500 ml 的血清瓶中 8.利用滅菌釜進行高溫滅菌完，倒入培養皿中，放待其凝固即可
四、實驗設備
（一）串聯式氣體層析質譜儀（GC/MS/MS Agilent 7890A / 7000A）
（二）液相層析串聯質譜儀（API4000）
五、實驗器材
無菌操作箱、恆溫培養箱（30℃）、水浴槽、pH 儀、震盪器、電子天平、本生燈、量筒、秤 量紙、血清瓶、移植環、微波爐、滅菌釜、微量吸管、試管、微量吸管頭、光學顯微鏡、滴 管、冰箱（－20℃）、果汁機、共栓量筒、離心機、分液漏斗震盪機、注射針筒、離心管、燒 杯等。
肆、 研究方法
一、檢測超市、傳統市場和家中農田的蔬果是否有農藥殘留，並探討殘留農藥的 種類及多寡
(一)檢測流程
樣品：波菜、青江菜、小白菜、葡萄、高麗菜、青蔥等
將六種樣品測重 10 g
以球型吸管加入 10 mL 乙腈
倒入測劑（調整 pH 值），並上下搖動一分鐘使其均勻混合
放入離心機中離心〈轉速 3000rps〉
以吸管吸 6 mL 上清液，加入事前已先準備好的離心管中（內含另 一測劑），上下搖動一分鐘使其混合均勻，並再次離心
吸取離心完後的上清液 2mL 至圓底燒瓶中
吸取離心完後的上 清液 2mL 至針筒中
減壓濃縮，並用丙酮溶解附在瓶身的農 藥，以 N2吹乾，留下農藥固體，再加入 2mL 正己烷和丙酮（1：1），用超音波震 盪均勻混合
放入樣品瓶中，即可放入液相與氣相質譜儀中檢測
1.以果汁機打成泥，混合均勻，方便待會精確的測重。
2.樣品測重 10 g 順序由右至左分別是：
波菜(傳統市場)、青江菜(傳統市場)、小白菜(傳統市場)、葡萄(家中農田)、
高麗菜(家中農田)、青蔥(傳統市場) 。
3. 以球型吸管加入 10mL 乙腈。
4. 倒入測劑，並上下搖動一分鐘使其均勻混合：吸附蛋白質及油質 5. 放入離心機中離心：以分離出有機溶劑。
6. 以吸管吸 6mL 上清液，加入事前已先準備好的管子中(內含另一萃取
試劑)，上下搖動一分鐘使其混合均勻，並再次離心：吸附極性較強之物質。
7. 吸取離心完後的上清液 2mL 至圓底燒瓶中。
8-1. 吸取離心完後的上清液 2mL 至針筒中。
8-2 減壓濃縮，並用丙酮溶解附在瓶身的農藥，以 N2吹乾，留下農藥固體，
再加入 2mL 正己烷和丙酮(1：1)，用超音波震盪均勻混合。
9.放入樣品瓶中，即可放入質譜儀中檢測。
二、認識枯草桿菌(TKS1-1 以及 WG6-14)的特性與型態 (一)革蘭氏染色法
在載玻片上滴一滴水，將菌泥均勻塗抹於上
火烤一分鐘固定
加入初染劑：結晶紫 Crystal violet 靜置一分鐘
以自來水沖掉染劑後風乾
媒染劑：碘液 I－KI 靜置三分鐘
利用脫色劑 95％酒精沖洗 到無結晶紫流出
複染劑：番紅 Safranin O 靜置一分鐘
水洗後蓋上蓋玻片
鏡檢(1000X)
(二)內生孢子染色法
在玻片上加一滴水，將細菌均勻塗抹在其上
火烤一分鐘固定
加入初染劑：孔雀綠 malachite green
至於水蒸氣上加熱十分鐘
以沖水自然風乾
靜置 30~60 秒
加入複染劑：番紅 safranin O
水洗，風乾後蓋上玻片
鏡檢(1000X)
(三)周生鞭毛染色法
以移植環取培養基上懸浮水溶 液，點於水滴上
將玻片傾斜以便水滴滲入
靜置十分鐘
將染劑滴於玻片邊緣，便其 自然滲色
注意：勿滴太多 使鞭毛斷裂
靜置十分鐘
鏡檢(1000X)
注意：點太大力 會使鞭毛斷裂 撥片上滴水蓋上蓋玻
片，於邊緣低上少許水 靜置十分鐘，等待枯草桿
菌張開鞭毛游出
以滴管取蒸餾水滴於培養基邊緣
三、檢測家中土壤以及市售納豆中是否有枯草桿菌的存在。
(一)土壤與納豆序列稀釋
土壤一、納豆一
將土壤與納豆加入無菌水，並震盪使其混合均勻
用pipet吸取第一管的混合液100μL，加入第二管90μL無菌水中（10%稀釋）
，以此類推到第五管
放入100℃沸水中滾煮五分鐘
在無菌操作台上開始塗布畫菌，每管塗兩皿
結果一 結果二
土壤二、納豆二
四、以親自種植的茼蒿為樣本，檢測枯草桿菌對農藥的分解是否真的能使安全採收期縮短。
(一)茼蒿種植方法
第二區 灑上混合農藥 貝芬替、益達 胺、陶斯松、因 得克、亞托敏〉
第三區 灑上混合農藥
〈貝芬替、益達 胺、陶斯松、因 得克、亞托敏〉
對照組
無添加農藥
不添加微生物 製劑
一星期噴灑 2 次﹝每隔三 天﹞微生物製
劑 TKS1－1
一星期噴灑 2 次﹝每隔三 天﹞微生物製 劑 WGS6－14
不添加微生物 製劑
〈貝芬替、益達 胺、陶斯松、因 得克、亞托敏〉
第一區 灑上混合農藥
每隔三天採樣一次，為期一個月，共 10 次 生長四週
播種
(二)播種
(三)農藥的準備
此次實驗的混合農藥共由四種常用農藥組成：
農藥名稱 稀釋倍率 殘留農藥安全容許量 作用對象 亞托敏 Azoxystrobin 2000 倍 1.0 殺菌劑 貝芬替 Carbendazim 2000 倍 1.0 殺菌劑 陶斯松 Chlorpyrifos 3000 倍 1.0 殺蟲劑 益達胺 Imidacloprid 8000 倍 1.0 殺蟲劑 因得克 Indoxacarb 2000 倍 2.0 殺蟲劑
(四)微生物製劑的準備
1.此次實驗的微生物製劑共有兩種：
(1)枯草桿菌(Bacillus Subtilis)TKS1-1 (2)枯草桿菌(Bacillus Subtilis)WG6-14
2.微生物製劑的製備：取自中興大學植物病理系實驗室 3.實際噴灑之稀釋倍率：枯草桿菌：水＝1：100
(五)種植區域分配
一 二 三 四
1.第一區：此區作為植物自然分解農藥之標準。灑上混合農藥，但不噴灑 微生物製劑，一次採樣兩株，共採十次。
2.第二區：此區作為微生物製劑 TKS1-1 分解農藥之標準。灑上混合農藥，並在採樣期間，
三天噴灑一次微生物製劑 TKS1-1，一次採樣三盆(三株)，共採十次。
3.第三區：此區作為微生物製劑 WG6-14 分解農藥之標準。灑上混合農藥，並在採樣期間，
三天噴灑一次微生物製劑 WG6-14，一次採樣三盆(三株)，共採十次。
4.第四區(對照組)：不灑混合農藥，也不添加微生物製劑，僅澆水維持生命。
(六)植株採樣以及檢測方法
第一區採收的茼蒿 第二區採收的茼蒿 第三區採收的茼蒿
（葉片變脆，使研磨效率提升）
研磨成粉狀
取上清液 1 mL，加至小玻璃瓶中
在另一小玻璃瓶中，取樣品一中液體 0.1mL，加上 0.9 mL 乙腈
放入液相層析串聯式質譜儀，等待檢測
以吸管吸 6 mL 上清液，加入事前已先準備好的離心管中（內含另 一萃取試劑），上下搖動一分鐘使其混合均勻，並再次離心
放入離心機中離心 以球型吸管加入 10 mL 乙腈
倒入萃取試劑（吸附蛋白質及油質），並上下搖動一分鐘使其均勻 裝入樣品罐中，每區各有十罐，對照組一罐，十次採樣共有 31 罐
加入液態氮 對照組
2.檢測流程
(1)將樣品測重 10 g
(2)以球型吸管加入 10 mL 乙腈，上下搖晃確保其混合均勻：將樣本上的農藥溶於乙腈中 (3)倒入萃取試劑，使用分液漏斗震盪機器上下搖動一分鐘使其均勻混合：萃取試劑
菜渣＋農藥＋乙腈
萃取試劑
(4)放入離心機中離心
(5)以球型吸管吸取 6 mL 上清液，加入事前準備好的離心管中（內含另一萃取試劑），上下 搖動一分鐘使其混合均勻，並再次離心：將農藥雜質吸附介質與檢液分離
農藥＋乙腈〈上清液〉
乙腈＋農藥 植物殘體
水層
未反應試劑
吸附雜質沉澱物
(6)取上清液 1 mL，加至小玻璃瓶中：此樣品濃度過高，需稀釋
1 mL 步驟五的上清液
〈乙腈＋農藥〉
(7)在另一小玻璃瓶中，取樣品一中液體 0.1mL，加上 0.9 mL 乙腈：將樣品 稀釋，此樣品將放入液相層析串聯式質譜儀
0.1mL 樣品一
＋ 0.9 mL 乙腈
伍、研究結果
一、檢測超市、傳統市場和家中農田的蔬果是否有農藥殘留，並探討以何種農藥為多。
我們三人各自從家中或市場帶來蔬果做為檢測樣本，依照歐盟檢測方法〈QuEChERS〉，
檢測大眾平常購買的蔬果中是否殘留過量農藥。
表一、六種蔬果農藥檢測結果
(註：括號內表示該植物的殘留農藥安全容許量，且表中 LC 表液相質譜儀檢測結果、GC 表氣 相質譜儀檢測結果)
表二、六種蔬果樣本農藥殘留檢測種類與安全性
樣品名稱 是否殘留農藥 殘留農藥種類 是否符合安全
小白菜 ＋ 亞滅培、賽滅寧、達滅芬、賓克隆、佈飛松 ＋ 青蔥 ＋ 貝芬替、剋安勃、賽洛寧、益達胺、依普同 ＋
波菜 ＋ 甲基巴拉松、賓克隆 ＋
葡萄 ＋ 達滅芬、克收欣 ＋
青江菜 ＋ 甲基巴拉松、佈飛松 ＋
高麗菜 － 無農藥殘留 ＋
從表一和表二得知，家中農田種的高麗菜，因以自家有機方式栽培，故無農藥檢出。其 中，從傳統市場購入的小白菜及蔥的農藥殘留種類最多。雖然有五種蔬果被檢測出有農藥殘 留，但檢測出的農藥殘留量均在安全容許量的標準之內。
二、認識枯草桿菌的特性與型態
枯草桿菌是一種革蘭氏陽性且好氧的桿菌，細胞主要的特徵是具有周生鞭毛，在逆境中 會產生內生孢子，使我們得以利用這些特性找到枯草桿菌，方法共有三種：革蘭氏染色、周 生鞭毛染色及內生孢子染色。我們分別帶來家中的土壤以及市售納豆，利用其上述特性，檢 測在我們日常生活是存有枯草桿菌。
(一)選用 TKS1-1 以及 WG6-14 兩種不同類型的枯草桿菌，了解其特性
圖一、PSA 培養基中畫菌圖(TKS1-1) 圖二、PSA 培養基中畫菌圖(WG6-14)
枯草桿菌 TKS1-1 以及 WG6-14，兩者在培養皿中生長的外觀皆為荷包蛋狀，質地為黏稠狀，
富有特殊氣味，唯一有不同之處為顏色，TKS1-1 偏白色，而 WG6-14 則是偏黃色。由圖一與 圖二看來，皆在畫菌的第三區開始出現單一菌落。
內生孢子
枯草桿菌細胞
圖五、內生孢子染色圖(TKS1-1)
使枯草桿菌產生內生孢子，須在培養皿中生長大約五天〈等待期氧氣耗完〉，在惡劣的情況下 使可形成內生孢子。從圖五中可發現，染色成功的細胞體呈紅色〈番紅染色〉，內生孢子則為 墨綠色〈孔雀綠染色〉。
三、檢測家中土壤以及市售納豆中是否有枯草桿菌的存在。
(一)我們從家中帶來兩種土壤，分別是枇杷樹以及玉龍草旁的土壤，將土壤序列稀釋，並塗 布畫菌培養，之後，加以革蘭氏染色，檢測其是否為枯草桿菌。
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圖六、枇杷樹旁的土壤 圖七、玉龍草旁的土壤
由圖六可知，革蘭氏染色結果是藍色，為革蘭氏陽性，又此菌經過 100℃的水沸騰過後仍生 存下來，型態為桿狀，故推測其為枯草桿菌。由圖七可知，革蘭氏染色結果為紅色，為革蘭 氏陰性，不符合枯草桿菌的型態，故推測其不為枯草桿菌。
(二)檢測了市售納豆中是否有枯草桿菌，將其序列稀釋，並塗布培養後，加以內生孢子染色，
檢測其是否為枯草桿菌。
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圖八、市售納豆中菌的內生孢子染色圖
由圖八可得知，納豆中的菌是可以在 100℃沸水煮過之後，產生內生孢子而存活，觀察其外 型為桿狀，故推測其為枯草桿菌。
四、以茼蒿為樣本，分別以檢測枯草桿菌對農藥的分解是否真的能使安全採收期縮短。
(一)種植區域分配說明
1.加水處理組：第一天噴灑混合農藥後，正常澆水處理。
2.TKS1-1：第一天噴灑混合農藥後，並與採樣同一時間，噴灑微生物製劑 TKS1-1, 持續一個月。
3.WG6-14：第一天噴灑混合農藥後，並與採樣同一時間，噴灑微生物製劑 WG6-14，
持續一個月。
4.對照組：此區茼蒿無噴灑混合農藥，故農藥殘留量為零，在圖中不顯示。
(二)檢測三種栽種處理的茼蒿樣品中農藥亞托敏的殘留量
從圖九可得，農藥亞托敏到了一般安全採收期的天數，以添加 WG6-14 組衰退的最為迅速，
推測枯草桿菌 WG6-14 能降低農藥殘留量。
(三)檢測三種栽種處理的茼蒿樣品中農藥貝芬替的殘留量
圖十、樣品中農藥貝芬替的殘留量〈單位：ppm〉
從圖十可得，農藥貝芬替到了一般安全採收期的天數，以添加 WG6-14 組衰退的最為迅速，
推測枯草桿菌 WG6-14 能降低農藥殘留量。
(四)檢測三種栽種處理的茼蒿樣品中農藥陶斯松的殘留量
圖十一、樣品中農藥陶斯松的殘留量〈單位：ppm〉
從圖十一可得，農藥陶斯松到了一般安全採收期的天數，以添加 WG6-14 組衰退的最為迅速，
推測枯草桿菌 WG6-14 能降低農藥殘留量。
(五)檢測三種栽種處理的茼蒿樣品中農藥益達胺的殘留量
圖十二、樣品中農藥益達胺的殘留量〈單位：ppm〉
從圖十二可得，農藥益達胺到了一般安全採收期的天數，以添加 WG6-14 組衰退的最為迅速，
推測枯草桿菌 WG6-14 能降低農藥殘留量。
(六)檢測三種栽種處理的茼蒿樣品中農藥因得克的殘留量
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陸、討論
一、檢測家中土壤中是否有枯草桿菌時，需將土壤樣本煮至 100℃，使土壤中能夠抵禦惡劣 環境的菌存活，產生內生孢子，但在土壤中能產生內生孢子的菌不只枯草桿菌，所以仍 須經 DNA 定序才能確認即為枯草桿菌。
二、在進行種植一個月的茼蒿為試驗材料之前，我們也選用了其他材料，如小白菜及青江菜 做為實驗的樣本，但因為採樣時間間隔太短﹝每天採樣一次﹞，且採樣次數不足，導致 實驗誤差。有了此經驗，使我們在栽種茼蒿時，能順利取樣。
三、此實驗我們的種植茼蒿的地點是溫室，若將其栽種在一般室外環境，則可以進一步比較 微生物製劑的應用效果。
柒、結論
一、實驗結果得知，市售蔬果農藥殘留量雖皆符合安全容許量標準，但若食入的農藥為脂溶 性物質，或是農藥殘留累積量太多，若人體生理機能無法排出，恐對人體造成威脅。
二、家中土壤有枯草桿菌的存在，可以幫助植物抵禦一些植物疾病，若能將其作為肥料定期 噴灑，將能使土地更肥沃，使植物更強壯。
三、以栽種茼蒿為樣本，結果發現微生物製劑能在一般植物的安全採收期，也就是第十天到 第十一天之間，有效使常用農藥加速衰退，且枯草桿菌樣品 WG6-14 優於 TKS1-1。
四、微生物製劑能幫助植物生長，且其菌種與市售納豆的雷同，故無須擔心食用後是否對人 體有害。以枯草桿菌製成的微生物製劑，取材容易且價格便宜，製作方式也不需要複雜 的器材，以噴灑方式更是簡單容易，故此種微生物製劑值得推廣。
玖、參考資料及其他
一、《漢聲雜誌 18》 『免於吃的恐懼專集 2 農藥篇』。台北市。漢聲。
二、近期公告之新農藥檢測方法(無日期)。衛生署。民 100 年 2 月 25 日取自：
://www.tactri.gov.tw/htdocs/regis/method.asp
三、功能性微生物製劑在有機作物栽培病害管理上之應用。衛生署。民 100 年 2 月 25 日取自：
http://tdares.coa.gov.tw/htmlarea_file/web_articles/tdares/5606/96-15.pdf 四、植物病害的殺手─枯草桿菌。民 100 年 2 月 25 日取自：
http://203.145.193.110/NSC_INDEX/Journal/EJ0001/9407/9407-04.pdf 五、生物農藥枯草桿菌在植物病害防治上之應用。民 100 年 2 月 25 日取自：
http://tdares.coa.gov.tw/view.php?catid=1755
六、CAMPBELL .REECE 編譯,鐘楊聰,葉開溫,催文慧,徐歷鵬, 生物學, (2005),偉明
