臺南地區魚塭綠藻之分子生物鑑定

(1)

臺南地區魚塭綠藻之分子生物鑑定

洪維謙

¹

賴雪端

¹

* 王建平

²

賴霈蓉

¹

楊燕玲

¹

1嘉南藥理科技大學生物科技系

2國立成功大學生命科學系

摘要

本研究目的在於探討台南地區淡水與半鹽水至海水魚塭綠藻之分子生物鑑定。綠藻樣品採集自嘉南藥理科技大學鄰近魚塭、茄萣與四鯤鯓魚塭、七股及四草野生動物保護區等。共分離出10 株淡水魚塭綠藻，及 6 株半鹽水至海水之魚塭綠藻，包括 Chlamydomonas、Chlorella、Desmodesmus、Euglena、

Monoraphidium、Mychonastes、Scenedesmus 等 7 屬。經 18S rDNA 或 ITS rDNA 序列分析結果，以近鄰法 ( NJ)建構親緣演化樹狀圖，比對 16 株魚塭綠藻之 ITS rDNA，皆發現 ITS region rDNA 可做為魚塭綠藻之分子標記。此外，亦發現ITS2 rDNA 序列在綠藻的 Desmodesmus 與 Scenedesmus 兩屬的分類鑑定上，較 ITS region rDNA (ITS1, 5.8S, ITS2)及 18S rDNA 序列，更適合做為分子標記。

關鍵字: 微藻，綠藻，18S rDNA， ITS rDNA

*通訊作者:嘉南藥理科技大學生物科技系 Tel: +886-6-2664911Ext2535

Fax: +886-6-2662135

E-mail:

[email protected]

壹、前言

傳統的分類學中，綠藻主要的特徵是細 胞內含有葉綠素 a 和 b，葉綠體內通常含有 澱粉核，光合作用產物是以澱粉的形式儲存在葉綠體內，大都為淡水種，少部分為海水種（Lee, 1999）。然而許多綠藻的結構特徵很小，或是很難觀察，因此，現今分子生物學的親緣分子標記，被認為相當重要的。常被用來當親緣分子標記的序列片段，包括 COI, rbcL, tufA, UPA, LSU ,ITS 以及 18S rDNA 等（Hall, FuΩikova, LO, Lewis, & Karol, 2010；Siver, Lord, & McCarthy, 1994）。

核醣體核酸的序列因具普遍性、高度保守性、序列的演化速度慢等特性，被認為適

於提供遺傳訊息的鑑定（Kato, Nakajima, Yamashita, Yakura, & Tanifuji, 1990）。核醣體核酸的序列中，18S rDNA 約 1,800 個核苷酸序列，長短適中，被認為較5.8S rDNA(約 160 個核苷酸序列)及 28S rDNA(3400 個核苷酸序列)更適合於分類學上的研究(Appels, Gerlach, Dennis, Swift, & Peacock, 1980；

Beszteri et al., 2001；Pace, Smith, Olsen, &

James, 1989

)

。然而，核醣體的間隔序列 (Ribosomal spacer sequences)中，包括內轉錄間隔區域(internal transcribed spacer；ITS)，

亦被認為適用於鑑定綠藻種間的遺傳變異 (Coleman, & Mai, 1997)。例如 An et al. (1999) -

аϫᐂࢱ!

(2)

研究綠藻門之柵藻科(Scenedesmaceae) 綠 藻，建議以 ITS2 的分子標記，鑑別 Scenedesmus 和 Desmodesmus 兩屬間的差 異。Semary (2011)的研究則使用 ITS2 與 18S rDNA 鑑別 Scenedesmus 和 Desmodesmus 兩 屬的差異。然而，仍有一些文獻討論以 18S rDNA 鑑別 Scenedesmus 和 Desmodesmus 兩 屬的適用性(An, Friedl, & Hegewald, 1999；

Kessler, Schäfer, Hümmer, Kloboucek, & Huss, 1997；Van Hannen, FinkGodhe, & Lurling, 2002

)

。

台南地區的魚塭有一些是淡水魚塭，亦有一些是受潮汐影響的半鹽水至海水的魚塭環境。小型魚塭綠藻應是魚類重要的餌料來源，本研究擬探討台南地區之魚塭綠藻之生物多樣性，及其ITS rDNA 及 18SrDNA 序列之分子生物特性。

貳、材料及方法

一、採樣、分離純化與培養

以1 公升容量大小之採水器，在魚塭岸邊採集浮游性藻類。採樣同時亦記錄採樣點之鹽度、pH、溫度及導電度。採集地包括嘉南藥理科技大學鄰近淡水魚塭與茄萣淡水魚塭，及台南市四鯤鯓、七股、及四草等地區之半鹽水至海水魚塭。

採集之微藻樣品，以平板培養法分離純化後，培養於 30℃恆溫培養箱中、光照 90µmol•m^-2•S^-1，光週期14 小時光照及 10 小時黑暗的f/2 medium 中(Guillard, & Ryther, 1962)。

萃取 DNA 與 PCR 反應

選擇對數期之綠藻細胞，經離心濃縮後，以Plant Genomic DNA Purification Kit 套組 (GeneMark) ，萃取綠藻之 genome DNA。置於-20℃低溫保存備用。PCR 反應使用 Advantage ^○^R HD Polymerase

(Clontech)。全程試劑皆放置於冰上操作。選擇最適當的 PCR 溶液反應條件為: template 200 ng/μl、5X Advantage HD buffer 5μl、

2.5mM dNTP 2μl、primer1 0.2~0.3 μM、

primer2 0.2~0.3 μM 、 Advantage HD polymerase 2.5U，及無菌水加至總體積為 25μl。然後置入 PCR 反應器 (MyCycler^TM Thermal Cycler 580BR 6674, Bio-red)條件分別為: 起始變性溫度 95℃，5 分鐘 1 個循環，

接著模板變性溫度95℃，1 分鐘和模板黏合溫度Tm 55℃，50 秒以及模板擴展溫度 72

℃，1 分鐘共 30 個循環，最後模板延長溫度 72℃ 7 分鐘。

PCR 產物經膠體電泳分析確認其大小及片段後，送至成功大學核酸定序中心 (automated sequencing core laboratory)進行核苷酸序列定序。電泳分析過程:將樣品注入 1%洋菜電泳膠片，並以 BCTM-1000 分子標記為標示，以電壓 100V 進行膠體電泳分析 25 分鐘，接著將膠片與 EtBr 進行染色，隨後脫色後之膠片置於UV-light box 觀察並分析其大小及片段。

二、統計分析

定序所得到之 DNA 序列，與 NCBI 的 GenBank 進行比對後，挑選出相似性高之物種的序列，做為親緣演化樹狀圖的比對物種。各物種間之親緣關係樹狀圖，應用 MEGA 5 軟體，以近鄰法( NJ)、最大相似法規(ML)及最大簡約法(MP)等建構親緣演化樹狀圖。

參、結果及討論

一、臺南地區所分離之魚塭綠藻及其生長的鹽度環境

本研究結果於臺南地區共分離出 16 株魚塭綠藻，包括 10 株淡水魚塭綠藻及 6 株半鹽水至海水之魚塭綠藻，圖 1 為 16 株綠

(3)

藻的採樣位置與地理分佈，包括嘉南藥理科技大學鄰近魚塭、茄萣與四鯤鯓魚塭、七股及四草野生動物保護區等。圖2 顯示 16 株常見魚塭綠藻的形態特徵。其中，10 株為來自嘉南藥理科技大學鄰近淡水魚塭與茄萣淡水魚塭之淡水綠藻，分別為藻株編號 Desmodesmus AELCNU-008( 圖 2a) 、 Scenedesmus AELCNU-009( 圖 2b) 、 Desmodesmus AELCNU- 013( 圖 2c) 、 Chlamydomonas AELCNU-014( 圖 2d) 、 Chlamydomonas AELCNU-015( 圖 2e) 、 Mychonastes AELCNU- 016( 圖 2f) 、 Scenedesmus AENLCNU-017( 圖 2g) 、 AENLCNU-018( 圖 2h) 、 Monoraphidium AENLCNU-019( 圖 2i) 及 Monoraphidium AENLCNU-020(圖 2j)。3 株來自四鯤鯓的半 鹽水魚塭，包括 Chlorella AELCNU-022(圖 3a) 、 Chlorella AELCNU-023( 圖 3b) 及 Chlorella AELCNU-024(圖 3c)。3 株來自四 草與七股之半鹽水至海水魚塭綠包括 Chlorella AELCNU-025( 圖 4a) 、 Chlorella AELCNU-026( 圖 4b) 及 Chlorella AELCNU-010(圖 4c)等。

圖1 採樣位置與綠藻分佈圖

這些微小的魚塭綠藻的大小介於 2µ~70µ 之間，為適合魚類生長的重要餌料。

其中淡水魚塭綠藻中， Chlamydomonas AENLCNU-014( 圖 2d) 、 Mychonastes

AENLCNU-016( 圖 2f) 和 Monoraphidium AENLCNU-020(圖 2j)等，在培養過程中發現皆缺乏對鹽度的耐受性，只能以 0%鹽度培 養，為典型的淡水生物種。而 Desmodesmus AENLCNU-013( 圖 2c) 、 Chlamydomonas AENLCNU-015( 圖 2e) 、 Scene- desmus AENLCNU-017(圖 2g)、AENLCNU-018(圖 2h)與 Monoraphidium AENLCNU-019(圖 2i) 可耐0.1%~1%鹽度之低鹽環境。

半鹽水魚塭綠藻則對於鹽度的耐性有 較明顯的差異。在培養過程中發現，Chlorella AENLCNU-022( 圖 3a) 與 Chlorella AENLCNU-023(圖 3b)等綠藻，對鹽度的耐受範圍為0.1%~2%的鹽度。然而，Chlorella AENLCNU-025( 圖 4a) 與 Chlorella AENLCNU- 026(圖 4b)等，對鹽度的耐受範圍為0.1~3%的鹽度。此外，當測試 4 株半鹽 水微藻，包括 Chlorella AENLCNU-022(圖 3a) 、 Chlorella AENLCNU- 023(圖 3b)、

Chlorella AENLCNU-025(圖 4a)與 Chlorella AENLCNU-026(圖 4b)等，對於 4%海水鹽度之耐受性時，發現當鹽度高於 4%時，微藻無法成長而死亡，顯示半鹽水魚塭綠藻只能承受海水漲退潮時期，淡水與海水混合的半鹽水環境，應無法移至海洋中大量生長。

二、三株柵藻科淡水綠藻之 18S rDNA

柵藻科綠藻是常見的魚塭綠藻，本研究而嘉南藥理科大鄰近魚塭所分離純化的1 株淡水綠藻編號 Desmodesmus

AELCNU-013 ，以

SSU1(5'-TGGTTGATCCTGCCAGTAG-3') 與 SSU2 (5'-TGATCCTTCCGCAGGTTCAC-3') 引子對，所擴增之18S rDNA 片段之 PCR 產物如電泳圖(圖 5)所示，大小約為 1800bp，

實際定序結果所得的核苷酸序列為 1722bp (表 1)。而在茄萣魚塭所分離的 2 株淡水綠

(4)

藻 Desmodesmus AELCNU-008 與 Scenedesmus AELCNU-009 。前者以 3F(5'-CCTGGTTGATCCTGCCAGT-'3) 與 1703R (5'-GAACTTCTCGGCAGACCTGA-'3) 引子對，所擴增之18S rDNA 片段之 PCR 產物如電泳圖(圖 6) ，大小約為 1700bp，實際定序結果所得的核苷酸序列為 1667bp (表 1) ；後者為以 4F(5'-CTGGTTGATC CTGCCAGTAGTCAT-'3) 與 1735R(5'-TACGACTTC

TCCTTCCTCTAGGTG-'3) 引子對，所擴增之18S rDNA 片段之 PCR 產物，如電泳圖(圖 7) ，大小約為 1700bp，實際定序結果所得的核苷酸序列為1688bp (表 1)。

圖 2a-j. 光學顯微鏡下十株淡水綠藻的形態特徵。 (a) Desmodesmus AENLCNU-008 (b) Scenedesmus AENLCNU-009 (c) Desmodesmus AENLCNU-013 (d) Chlamydomonas AENLCN U-014 (e) Chlamydomonas AENLCNU-015 (f) Mychonastes AENLCNU-016 (g) Scenedesmus AENLCNU-017 (h) AENLCNU-018 (i) Monoraphidium AENLCNU-019 (j) Monoraphidium AENLCNU-020。

圖 3a-c. 光學顯微鏡下三株半鹽水綠藻的形態特徵。(a) Chlorella AENLCNU-022 (b) Chlorella AENLCNU-023 (c)Euglena AENLCNU-024。

圖 4a-c. 光學顯微鏡下三株半鹽水至海水綠藻的形態特徵。

(a) Chlorella AENLCNU-25 (b) Chlorella AENLCNU-26 (c) Chlorella AENLCNU-10。

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

(g) (h)

(i) (j)

(a) (b)

(c)

(a) (b)

(c)

(5)

圖6. 淡水綠藻 Desmodesmus AELCNU-008 在 60℃與 62℃的黏合溫度下所獲得之 18S rDNA 的 PCR 擴增產物之電泳圖。

圖7. 淡水綠藻 Desmodesmus AELCNU-009 在 60℃與 62℃的黏合溫度下所獲得之 18S rDNA 的 PCR 擴增產物之電泳圖。

圖8 淡水綠藻 ScenedesmusAELCNU-JDB1 008 的 ITS region 的 PCR 產物電泳圖。

圖9 淡水綠藻 ScenedesmusAELCNU-JDB1 009 的 ITS region 的 PCR 產物電泳圖。

圖10. 八株淡水綠藻的 ITS region 的 PCR 產物電泳圖。

三、八株淡水綠藻之 ITSrDNA

來自茄萣魚塭所分離的 2 株淡水綠藻 Desmodesmus AELCNU-008 與 Scenedesmus

AELCNU-009 。前者以

AAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAG/

AATACA GAGATACGCGTCAGAGA) 引子

圖 5. 淡水綠藻 Desmodesmus AELCNU-013 的 18S rDNA 的 PCR 產物電泳圖。

(6)

對，所擴增之ITS rDNA 片段之 PCR 產物如電泳圖 (圖 8)，實際定序結果所得的核苷酸序列為 514bp( 表 1-2) 。後者以 AATTATTAAAA CCACAACGTGAACC/

ACCTATCCAGTTGAAGCCCTTAAT) 引子對，所擴增之ITS rDNA 片段之 PCR 產物如電泳圖(圖 9)，實際定序結果所得的核苷酸序列為488bp (表 1-2)

。

此外8 株來自嘉南藥理科大鄰近魚塭之淡水綠藻，包括 Desmodesmus AELCNU-013 ， Chlamydomonas AELCNU-014 ， Chlamydomonas AELCNU-015 ， Mychonastes AELCNU-016，Scene- desmus AELCNU-17 ， AELCNU-018 ， Mono- raphidium AELCNU-019 及 Monoraphidium

AELCNU-020 ，皆是以

TF(5'-GAAGTCGTAACAAG GTTTCC-3')與 TR(5'-TCCTGGTTAGTTTCTTTTC C-3') 引子對進行PCR 反應，所擴增之 ITS region 片段之PCR 產物如電泳圖(圖 10)，顯示 8 株淡水綠藻的PCR 產物大小約 650bp~1400bp 之間 (表 2)。以 Scenedesmus AELCNU-017 的 PCR 產物最大，約 1400bp，然而經 NCBI 比對與分析結果顯示:TF 與 TR 引子對所擴增此藻株的片段，在ITS region 的前後，如圖 11 之多重序列比對圖， Scenedesmus AELCNU-017 在被切齊後進行比對前含有較長的18S rDNA(402bp)及 28S rDNA(364bp) 的部分序列。然而 Desmodesmus AELCNU-013 的 ITS region 產物最小，約為 650bp。

三、六株半鹽水至海水綠藻之 ITS rDNA

3 株來自四鯤鯓半鹽水魚塭(Chlorella AELCNU-022、Chlorella AELCNU-023 及 Euglena AELCNU-024)，及 2 株來自四草與 七股區域之半鹽水至海水魚塭綠(Chlorella

AELCNU-025 及 Chlorella AELCNU- 026)等 的ITS DNA 分析，採用與前述淡水微藻所使用的相同時間與溫度，亦以TF 與 TR 引子對進行PCR 反應，所擴增的 PCR 產物，如電泳分析圖( 圖 12) ，片段大小約為 700~800bp，實際定序結果所得的核苷酸序列分別為 806bp, 794bp, 746b, 及 775bp(表 2)。

此外，來自七股的海水魚塭綠藻 Chlorella AELCNU-STR 010 的 ITS region 則 是以 TATCAATCGAACCCACTC TGGTAA/TACCAAGCCATTGCCCTACAA A 引子對，進行 PCR 進行 PCR 反應，所擴增的ITS region 的 PCR 產物，如電泳分析圖 (圖 13)，實際定序結果所得的核苷酸序列 732bp(表 2)。

四、 Desmodesmus 與 Scenedesmus 的親緣關係

為進一步確認 Desmodesmus 與 Scenedesmus 的親緣關係，三株淡水柵藻科 綠藻之 18S rDNA、ITS rDNA 以及 ITS2 rDNA 等序列(表 1-2)，以近鄰法(NJ)、最大相似法(ML)及最大簡約法(MP)等建構親緣演化樹狀圖(bootstrap 為 1000)。結果顯示以 18S rDNA 序列進行上述三種統計分析結

果，皆顯示 Desmodesmus

AELCNU-008(1667bp)被歸類為 Scenedesmus 分支，而 Desmodesmus AELCNU- 013(1722bp)被歸類為 Desmodesmus 分支。然 而，Scenedesmus AELCNU-009(1688bp)則沒 有被歸類在 Scenedesmus 與 Desmodesmus 的 分支中。如依近鄰法(NJ)分析所得之樹狀圖 (圖 14)，顯示 18S rDNA 序列並不易鑑定 Scenedesmus 與 Desmodesmus 兩屬之間的差 異性。

此外，使用ITS rDNA (包括 ITS1, 5.8S, ITS2)序列進行分析，三種統計分析結果皆顯

(7)

示同樣結果。圖15 為依近鄰法(NJ)分析所得之樹狀圖，顯示，ITS rDNA 可明顯區別 Scenedesmus 與 Desmodesmus 兩屬之差 異，且編號 Desmodesmus AELCNU- 008(514bp)被歸類於 Desmodesmus 族群分支 內，並且呈現單一分支。編號 Scenedesmus AELCNU- 009(488bp)被歸類為 Scenedesmus 族群分支內，並且呈現單一分支。編號 Desmodesmus AELCNU- 013(656bp)被歸類 於 Desmodesmus 族群分支內且呈現單一分 支。此結果顯示，ITS region 之 rDNA 序列，

具有鑑別兩屬差異的特性。

進一步僅選擇 ITS2 rDNA 序列進行分析，如前述之三種統計分析，亦皆獲得相似的結果。圖16 為依近鄰法(NJ)分析所繪製之樹狀圖，顯示 Desmodesmus AELCNU-008(247bp)被歸類於 Desmodesmus 族群分支內，與 D. opoliensis (AM410666.1) 最為相似。編號AELCNU-009(152bp)被歸類 為 Scenedesmus 族群分支內，且與 S. obliquus (DQ417568.1)的最為接近，並且呈現單一分 支。而 Desmodesmus AELCNU-013(241bp) 被歸類於 Desmodesmus 族群分支內，且與四

株 D. communis

(AM4100646.2;AY461374.1;AY461369.1;AY 461372.1)藻株之分支最為接近，並且呈現單一分支。此結果所顯示，ITS2 rDNA 序列具有鑑別兩屬差異性之功用，且與 An et al.

(1999)的研究結果相似。綜合以上的結果顯 示，本研究所分離之魚塭綠藻的 Scenedesmus 與 Desmodesmus 的親緣關係中，發現 ITS2 rDNA 序列在兩屬的分類鑑定上，較 ITS region rDNA (ITS1, 5.8S, ITS2)及 18S rDNA 序列，更適合做為分子標記。然而因Genbank 的資料仍嫌不足，故仍不足以比對至種的分類階層。

五、臺南地區淡水、半鹽水至海水魚塭綠藻之親緣關係

本研究之 16 株魚塭綠藻之 ITS region rDNA 如圖 11 之多重序列比對圖所標示之範圍，以近鄰法(NJ)建構之親緣演化樹狀圖(圖 17)，顯示 16 株魚塭綠藻可分為 4 個族群，

第一群為 Desmodesmus AELCNU-008 、 Scenedesmus AELCNU-009 、 Desmodesmus AELCNU-013 及 Scenedesmus AELCNU-017 等之親緣關係較為接近，且此四株藻種為柵藻屬之藻種。其中 Desmodesmus AELCNU-008 與 Desmodesmus AELCNU-013 之相似度較高，判定為 Desmodesmus 屬；而 Scenedesmus AELCNU-009 和 Scenedesmus AELCNU-017 相似度較高，與 Desmodesmus 屬相似度較 低，因此應歸屬於 Scenedesmus 屬。第二群 為 Monoraphidium AELCNU-019 與 Monoraphidium AELCNU-020 之相似度較 高，親緣關係較為接近，且此兩株微藻在外 觀形態亦可鑑定為 Monoraphidium 同屬之藻 種。第三群為 Chlamydomonas AELCNU-014 與 Chlamydomonas AELCNU-015 之相似度 較高，親緣關係較為接近，經 ITS region rDNA 比對後鑑定為 Chlamydomonas 屬之藻 種。第四群為 Chlorella AELCNU-022 、 Chlorella AELCNU-023 、 Chlorella AELCNU-025 及 Chlorella AELCNU-026 之 相似度較高，親緣關係較為接近，且皆可於半鹽水區域內生長，經ITS region rDNA 比 對後鑑定為 Chlorella 屬之藻種。因此，16 株綠藻之 ITS region rDNA 形成 Scenedesmus(柵藻屬)為一區、Monoraphidium (單針藻屬)為一區、Chlamydomonas(衣藻屬) 為一區，以及 Chlorella (小球藻)也分為一 區，亦證明ITS region rDNA 適於做為分子鑑定的指標。同時由圖11 之多重序列比對圖亦顯示十六株綠藻之 ITS2 rDNA 部份之差異較顯著。

(8)

肆、結論

養殖漁業一直是台灣漁民重要的維生產業，魚塭養殖池在臺南地區有淡水、半鹽水至海水的魚塭，目前並未有關於台南地區魚塭綠藻的分子生物鑑定的報導。本研究所分離純化之16 株魚塭綠藻，經 ITS rDNA 分子生物鑑定結果，顯示分屬於 7 個屬 (genus)，包括 Chlamydomonas、Chlorella、

Desmodesmus、Euglena、Monoraphidium、

Mychonastes 及 Scenedesmus 等，可提供魚塭 綠藻的分子生物鑑定的基礎參考資料。

伍、謝辭

本研究感謝國立成功大學附設鯨豚研究中心研究團隊，協助採樣以利於實驗之進行。

(9)

圖11. 本研究之十六株魚塭綠藻之多重序列比對圖。

表一、魚塭綠藻 Scenedesmus 及 Desmodesmus 之 DNA 序列片段大小

rDNA (bp) Species

18S ITS region

ITS2

DesmodesmusAELCNU-008 1667 514 247 ScenedesmusAELCNU-009 1688 488 152 DesmodesmusAELCNU-013 1722 656 241

表二、各魚塭綠藻經定序所得之rDNA 序列片段

Species

18S rDNA partial, ITS

rDNA complete and

28S rDNA partial

ITS rDNA 切割比對

(bp)

Desmodesmus AELCNU-008 514 514

Scenedesmus AELCNU- 009 488 488

Chlorella AELCNU-010 732 403

Desmodesmus AELCNU-013 656 656

Chlamydomonas AELCNU-014

722 669

Chlamydomonas AELCNU-015

938 700

Mychonastes AELCNU-016 906 783 Scenedesmus AELCNU-017 1475 708

? AELCNU-018 1058 638

Monoraphidium AELCNU-019 723 704

Monoraphidium AELCNU-020 730 714

Chlorella AELCNU-022 685 606 Chlorella AELCNU-023 806 687 Euglena AELCNU-024 794 779 Chlorella AELCNU-025 746 676 Chlorella AELCNU-026 775 693

圖12. 五株半鹽水至海水魚塭綠藻的 ITS region 的 PCR 產物電泳圖。

圖 13. 海水魚塭綠藻 Chlorella AELCNU-STR 010 的 ITS region 的 PCR 產物電泳圖。

表三、十六株綠藻之ITS rDNA 片段序列與 NCBI 資料庫最接近之藻株及其序列相似度之百分比%

Species NCBI 資料庫 Desmodesmus

AELCNU-008 genus Desmodesmus (98%) Scenedesmus

AELCNU-009 genus Scenedesmus (97%) Chlorella

AELCNU-010 無 Desmodesmus

AELCNU-013 Desmodesmus communis (JQ922412.1 )(98%) Chlamydomonas

AELCNU-014 genus Gonium &

genus Chlamydomonas (80~91%) Chlamydomonas

AELCNU-015 genus Gonium &

genus Chlamydomonas (81~100%) Mychonastes

AELCNU-016 Mychonastes rotundus (99%) Scenedesmus

AELCNU-017 genus Scenedesmus (86%)

? AELCNU-018 無 Monoraphidium

AELCNU-019 Uncultured Chlorophyta clone ( HQ191425.1) (86%)

(10)

Monoraphidium AELCNU-020

Uncultured Chlorophyta clone (HQ191423.1) (87%) Chlorella

AELCNU-022

無

Chlorella AELCNU-023

無

Euglena AELCNU-024

無

Chlorella AELCNU-025

genus Micractinium &

genus Chlorella (83~88%) Chlorella

AELCNU-026

genus Chlorella (88%)

Scenedesmus_acutus_(AJ249512.1) Scenedesmus_acutus_(AJ249513.1) Scenedesmus_obliquus_(AJ249515.1)

AELCNU-008

Scenedesmus_pectinatus_var._distendus_(AB037093.1) Scenedesmus_acuminatus_(AB037088.1) Scenedesmus_raciborskii_(AB037094.1) Scenedesmus_obtusus_(AB037091.1) Scenedesmus_costatus_(AB037090.1) Scenedesmus_vacuolatus_(X56104.1) Scenedesmus_arcuatus_var._arcuatus_(AY170311.1) Scenedesmus_arcuatus_var._platydiscus_(AY170312.1) AELCNU-013

Desmodesmus_perforatus_(FR865714.1) Desmodesmus_pirkollei_(AF348496.1) Scenedesmus_subspicatus_(AJ249514.1) Desmodesmus_sp._(JF835993.1)

Desmodesmus_sp._(JF835991.1) Desmodesmus_sp._(JF835994.1) Desmodesmus_sp._(JF835992.1) Desmodesmus_sp._(JQ315186.1)

AELCNU-009

100 19

3 5 4 37 24 51 98 90 99 67 93 86 65

68

0.2

圖14. 三株柵藻科綠藻之 18S rDNA 片段序列與 NCBI 資料庫所比對之其他 Scenedesmus sp.與 Desmodesmus sp.之 18S rDNA 片段以近鄰法(NJ)所繪出之親緣演化樹狀圖 (Bootstrap :1000)。

Scenedesmus_obliquus_(DQ417568.1) AELCNU-009 Scenedesmus_sp._(EU729732.1)

Scenedesmus_bajacalifornicus_(AY510468.1) Scenedesmus_deserticola_(AY510472.1)

Scenedesmus_rotundus_(AY170858.2) Scenedesmus_regularis_(AY170857.1) Scenedesmus_arcuatus_var._arcuatus_(AY170854.1) Scenedesmus_arcuatus_var._platydiscus_(AY170855.1)

Scenedesmus_hindakii_(AY170856.1) Scenedesmus_obtusus_(AY170858.2) Desmodesmus_bicellularis_(DQ417558.1) Desmodesmus_armatus_var._subalternans_(DQ417520.1)

Desmodesmus_armatus_var._subalternans_(DQ417546.1) AELCNU-008

Desmodesmus_sp._(JQ315188.1)

Desmodesmus_multivariabilis_var._turskensis_(DQ417525.1) Desmodesmus_arthrodesmiformis_(DQ417536.1) Desmodesmus_pirkollei_(DQ417557.1) AELCNU-013

Desmodesmus_cuneatus_(DQ417567.1) Desmodesmus_asymmetricus_(DQ417577.1) Desmodesmus_itascaensis_(DQ417536.1)

Desmodesmus_ultrasquamatus_(GU192392.1) Desmodesmus_lunatus_(GU192393.1)

Desmodesmus_elegans_(DQ417581.1) Desmodesmus_pseudoserratus_(GU192390.1)

Desmodesmus_serratoides_(GU192384.1) Desmodesmus_serratus_(DQ417560.1) Desmodesmus_perdix_(GU192386.1) Desmodesmus_santosii_(GU192388.1) Desmodesmus_santosii_(DQ417520.1) 82

67

27 43 81 34

34 69 100

50 60 78 94

97 42 70 36 11

56

89

34 35 60

91 68

92 59

24 97

0.02

圖15. 三株柵藻科綠藻之之 ITS region rDNA 片段序列與 NCBI 資料庫所比對之其他 Scenedesmus sp.與 Desmodesmus sp.之

ITS region rDNA 片段，以近鄰法(NJ)所繪出之親緣演化樹狀圖(Bootstrap :1000)。

Desmodesmus_communis_(AY461374.1) Desmodesmus_communis_var._polisicus_(AY461369.1)

Desmodesmus_communis_var._rectangularis_(AY461372.1) AELCNU-13

Desmodesmus_communis_(AM410646.2) Scenedesmus_quadricauda_(AJ400495.1) Desmodesmus_tropicus_(AF421873.1)

Desmodesmus_perforatus_var._iberaensis_(AF421872.1) Desmodesmus_perforatus_(AF421868.1) Desmodesmus_intermedius_(FR865703.1)

Desmodesmus_hystrix_(DQ417551.1) Desmodesmus_pannonicus_(FR865711.1) Desmodesmus_arthrodesmiformis_(DQ417536.1) Desmodesmus_multivariabilis_var._turskensis_(DQ417525.1)

Desmodesmus_multivariabilis_(AY461368.1) Desmodesmus_subspicatus_var._simplex_(AY461361.1) Desmodesmus_pleiomorphus_(AY819731.1) Desmodesmus_pleiomorphus_var._kantonensis_(AY461364.1)

AELCNU-008

Desmodesmus_opoliensis_(AM410666.1) Desmodesmus_armatus_var._subalternans_(DQ417546.1) Desmodesmus_armatus_(AM410663.1)

Desmodesmus_serratus_(GU192383.1) Desmodesmus_santosii_(DQ417524.1)

Desmodesmus_perdix_(GU192387.1) Desmodesmus_pseudoserratus_(GU192389.1)

Desmodesmus_elegans_(DQ417581.1) Desmodesmus_itascaensis_(DQ417539.1)

Desmodesmus_costatogranulatus_(DQ417574.1) Scenedesmus_rotundus_(HQ246446.1)

Scenedesmus_arcuatus_var._platydiscus_(AY170855.1) Scenedesmus_deserticola_(AY510473.1) Scenedesmus_acuminatus_(AJ249511.1)

Scenedesmus_bajacalifornicus_(AY510468.1) Scenedesmus_acutus_(AJ249508.1)

AENLCNU-009 Scenedesmus_obliquus_(DQ417568.1)

34 38 58 61 67

69 72 49 58 99

79

85 92

89 80 99

99 87

63

58 50

44 90 38

72

98 71

56 70

52 54

79 67 54

0.05

圖16. 三株柵藻科綠藻之之 ITS2 rDNA 片段序列與 NCBI 資料庫比對，以近鄰法(NJ) 所繪出之親緣演化樹狀圖 (Bootstrap :1000)。

Desmodesmus AELCNUJDB1-008(FW) Desmodesmus AELCNU-013(FW) Scenedesmus AELCNUJDB1-009(FW) Scenedesmus AELCNU CENP-017(FW)

Monoraphidium AELCNU CENP-019(FW) Monoraphidium AELCNU CENP -020(FW) ?AELCNU CENP-018(FW)

Chlamydomonas AELCNU-014(FW) Chlamydomonas AELCNU-015(FW) Euglena AELCNU SQSP-024(BW) Chlorella AELCNU SQSP-022(BW)

Chlorella AELCNU SQSP-023(BW) Chlorella AELCNU CTUP-025(BW) Chlorella AELCNUDJCP-026(BW) Mychonastes AELCNU-016(FW)

Chlorella AELCNU-CK010(BW)

100

98

87

98 85 98

84 75 55

68 96

72 59

0.05

圖17. 本研究之十六株淡水與半鹽水綠藻之 ITS region rDNA 片段，以近鄰法(NJ)所繪出之親緣演化樹狀圖。[(Bootstrap :1000); (FW: fresh water, BW:

brackish water, MW: marine water.)]

(11)

陸、參考文獻

An, S. S., Friedl, T., & Hegewald, E.（1999）.

Phylogenetic relationships of Scenedesmus and Scenedesmus-like coccoid green algae as inferred from its-2 rdna sequence comparisons 。 Plant Biology, 1（4）, 418-428。

Appels, R., Gerlach, W. L., Dennis, E. S., Swift, H., & Peacock, W. J.（1980）.

Molecular and chromosomal organization of DNA sequences coding for the ribosomal rnas in cereals. Chromosoma, 78（3）, 293-311.

Beszteri, B., Acs, E., Makk, J., Kovacs, G., Marialigeti, K., & Kiss, K. T.（2001）.

Phylogeny of six naviculoid diatoms based on 18S rdna sequences. Int J Syst Evol Microbiol, 51（4）, 1581-1586.

Coleman, A., & Mai, J.（1997）. Ribosomal DNA and its-2 sequence comparisons as a tool for predicting genetic relatedness. J.

Mol. Evol., 45（2）, 168-177.

Guillard, R. R. L., & Ryther, J. H.（1962）.

Studies of marine planktonic daitoms: I.

Cyclotella nana husted, and Detonula confervacea (cleve) gran. Can. J.

Microbiol., 8（2）, 229-239.

Hall, J. D., FuΩikova, K., LO, C., Lewis, L. A.,

& Karol, K. G.（2010）. An assessment of proposed DNA barcodes in freshwater green algae. Cryptogamie, 31, 529-555.

Hejazi, M. A., Barzegari, A., Gharajeh, N. H.,

& Hejazi, M. S. (2010）. Introduction of a novel 18S rdna gene arrangement along with distinct its region in the saline water microalga Dunaliella. Saline Systems, 6, 4.

Kato, A., Nakajima, T., Yamashita, J., Yakura, K., & Tanifuji, S.（1990）. The structure of the large spacer region of the rdna in vicia faba and pisum sativum. Plant Mol Biol, 14（6）, 983-993.

Kessler, E., Schäfer, M., Hümmer, C., Kloboucek, A., & Huss, V. （ 1997 ） . Physiological, biochemical, and molecular characters for the taxonomy of three subgenera of Scenedesmus (chlorococcales, chlorophyta). Bot. Acta, 110, 244-250.

Lee, R. E.（1999）. Phycology（3rd ed.）.

Cambridge England ; New York ： Cambridge University Press.

Pace, N. R., Smith, D. K., Olsen, G. J., &

James, B. D. （ 1989 ） . Phylogenetic comparative analysis and the secondary structure of ribonuclease p rna--a review.

Gene, 82（1）, 65-75.

Semary, N. A. E.（2011）. The polyphasic description of a Desmodesmus spp.

Isolate with the potential of bioactive compounds production. Biotechnol.

Agron. Soc. Environ., 15, 231-238.

Siver, P. A., Lord, W. D., & McCarthy, D. J.

（1994）. Forensic limnology: The use of freshwater algal community ecology to link suspects to an aquatic crime scene in southern new england. Joumal of Forensic Science, 3, 847-853.

Van Hannen, E., FinkGodhe, P., & Lurling, M.

（2002）. A revised secondary structure model for the internal transcribed spacer 2 of the green algae Scenedesmus and Desmodesmus and its implication for the phylogeny of these algae. European Journal of Phycology, 37（2）, 203-208.

(12)

臺南地區魚塭綠藻之分子生物鑑定