行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
酵母菌細胞表面蛋白之表現及其在生質酒精生產上之應用 (第 2 年)
研究成果報告(完整版)
計 畫 類 別 ： 個別型
計 畫 編 號 ： NSC 96-2221-E-011-076-MY2
執 行 期 間 ： 97 年 08 月 01 日至 98 年 07 月 31 日 執 行 單 位 ： 國立臺灣科技大學化學工程系
計 畫 主 持 人 ： 李振綱
報 告 附 件 ： 出席國際會議研究心得報告及發表論文
處 理 方 式 ： 本計畫可公開查詢
中 華 民 國 98 年 12 月 10 日
目錄
壹、報告內容 ---1
前言---1
研究目的---1
文獻探討---3
研究方法---4
結果與討論---10
貳、參考文獻 ---16
參、計畫成果自評---17
報告內容
一、前言
纖維素存在於地球上的許多生物中，諸如藻類、蕨類、草本以及木本植物等 的細胞壁中都含有纖維素，是蘊藏極為豐富的天然資源，也是自然界中最為充裕 的碳水化合物，因此在碳的代謝循環中，纖維素扮演了一個關鍵性的角色，如將 其分解後的醣類予以轉化成生質能乙醇等具附加價值的有機物，更可提高纖維素 在生物能源再利用上的地位。而自然界中纖維素含量最多的為草本及木本植物中 的木質纖維素(lignocellulose)，其主要是由纖維素(cellulose)、半纖維素
(hemicelluloses)與木質素(lignin)所組合而成的，此木質纖維素可利用酸、鹼、及 酵素處理的方式將其水解成可發酵的糖，再利用微生物發酵產生乙醇
(bioethanol)。而酵母菌Saccharomyces cerevisiae是一般最常使用的微生物，因為 其乙醇產量高且乙醇耐受度高，此外，Saccharomyces cerevisiae對於木質纖維素 酸解後產生之副產物有相當大的容忍度，不易被抑制，因此本計畫將應用S.
cerevisiae酵母菌於纖維素之發酵生產乙醇。
二、研究目的
纖維素雖可用酸解而得可經S. cerevisiae酵母菌發酵成乙醇之葡萄糖，但此法 葡萄糖收率較低，此外也會產生抑制微生物生長之副產物，而利用纖維素水解酵 素水解不僅反應條件溫和且葡萄糖收率高，但纖維素水解酵素成本高是一大缺 點。在纖維素水解成葡萄糖的過程當中，纖維雙糖(cellobiose)的水解為其速率決 定步驟(Van Rooyen et al., 2005)。因為纖維雙糖的累積，會造成回饋抑制效應，
導致內切型和外切型纖維素水解酵素產生產物抑制的現象，使得水解速率減緩 (Hari Krishna et al., 2001; Tu et al., 2006)，所以β-葡萄糖苷酵素(β-glucosidase)為 纖維素水解過程中最重要之酵素之一。
微生物细胞表面工程是近年來逐漸發展的技術，它利用细胞表面表現技術使 外源蛋白固定化於细胞表面，進而生產微生物细胞表面蛋白。微生物细胞表面工
程可用於细胞催化反應、细胞吸附劑、活疫苗、生物感測器等之開發。本計畫則 是探討利用酵母菌表面表現技術，將Bacillus之纖維素雙糖分解酵素(cellubiase)，
或稱β-葡萄糖苷酵素(β-glucosidase)表現於酵母菌細胞壁表面，期望此酵母菌能 在同步糖化發酵時，提升其利用纖維素發酵生產酒精之效率。
主要研究項目有:
(1)建構之β-葡萄糖苷酵素(β-glucosidase)表現載體pYDAGA2-Bgl與
pYD315-Bgl，以電轉殖方式分別將質體送入Saccharomyces cerevisiae宿主細胞 中。
(2)由於在載體pYDAGA2-Bgl 及pYD315-Bgl中Bgl 基因是以GAL1為啟動子控 制，GAL1為一個誘導型啟動子(inducible promoter)，需要利用半乳糖(galactose) 進行誘導，才會將β-glucosidase 表現出來，因此探討誘導條件對表面表現之 影響及表面β-glucosidase之活性。
(3)以含有β-葡萄糖苷酵素(β-glucosidase)表現載體pYDAGA2-Bgl與pYD315-Bgl 的Saccharomyces cerevisiae，進行纖維雙糖酒精發酵。
(4)以含有β-葡萄糖苷酵素(β-glucosidase)表現載體pYDAGA2-Bgl的 Saccharomyces cerevisiae，進行纖維素的同步糖化酒精發酵。
三、文獻探討
真核細胞酵母菌(yeast)中也發展出一套細胞表面表現系統。其細胞表面表現 就優於細菌的系統，因為許多酵母菌，對人類而言，為GRAS(generally recognized as safe)的微生物，利用其製造出的產品可以用於食物或藥物；其蛋白質分泌 (protein secretion)過程，以及轉譯後修飾作(post-translational modification)也都與 高等真核生物相似，非常適合表現真核細胞中複雜的蛋白質，例如：抗體片段 (antibody fragments)、細胞素(cytokines)及接受器外表區域(receptor
ectodomains)；此外，酵母菌具有厚且穩固的細胞壁(cell wall)，能夠使的表現於 細胞表面的蛋白質維持穩定。到目前為止，酵母菌表面表現系統(yeast surface
display system)著重於Saccharomyces cerevisiae的品種，因為對其表現系統、細胞 壁結構及細胞壁蛋白質組成有很透徹的研究。
酵母菌表面蛋白表現系統中之一為使用glycosylphosphatidylinositol (GPI)—anchored proteins帶出目標蛋白，yeast-surface receptor-agglutinin即為 GPI--anchored protein，S.cerevisiae的α-agglutinin 是高糖基化的細胞壁鑲嵌蛋白 (highly glycosylated cell wall-anchored protein)，其表現於交配型(α-mating type) 酵母菌表面上，在交配激素(mating pheromone)-α-factor的誘導下會有很高的表 現；α-agglutinin是由AGα1基因所轉譯出來的，由650個胺基酸組成的單一 polypeptide，其N端具有分泌訊息(secretion signal)，C端接上GPI。重組目標蛋白 是利用其具分泌訊息及鑲嵌於細胞表面的部分，讓重組蛋白表現於細胞表面。
除了上述GPI--anchored proteins方式進行酵母菌細胞表面蛋白質表現外，另 一種機制主要是利用yeast-surface receptor a-agglutinin，在a-agglutinin系統中主要 是由Aga1與Aga2 構成，當中Aga1主要是鍵結表現在酵母菌細胞表面上的蛋白 質，而Aga2則具有訊息胜肽及主要蛋白的分子，此Aga2會透過雙硫鍵的支撐與 Aga1鍵結，進而達到細胞表面蛋白固定化的目標。
另外一種表面表現機制則是利用Flo1p-anchor system，酵母菌表面之凝聚蛋 白帶出目標蛋白質(Matsumoto et al., 2002)。日本神戶大學Kondo教授所領導的研 究群已研究在酵母菌表面表現澱粉及纖維素水解酵素多年(Fujita et al., 2004;
Fujita et al., 2002; Ito et al., 2004; Shigechi et al., 2004)，直接使用此種改良之酵母 菌進行同步糖化發酵(SSF)生產酒精，可不需要額外添加水解酵素即可同步糖化 發酵。然而，目前所收集之文獻尚無β-glucosidase在酵母菌表面表現之報導。
四、研究方法
分別建構可在S.cerevisiae表面及胞內表現之質體pYDAGA2及pYD315。
1. 建構可在S.cerevisiae胞內表現之質體pYD315
首先，pYD315質體建構是以質體pYES2當作模板，再以設計好的正向引子
及逆向引子進行聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction;PCR)，將所需之 PGAL1-CYC1 TT片段放大增幅，並利用 PCR Purification kit將PCR產物加以純 化，然後將質體pRS315及PGAL1-CYC1TT DNA片段，以限制酶Sal I及Sac II進行 限制酶切割反應，再依序以Gel extraction kit純化出限制酶反應後之
PGAL1-CYC1TT片段及質體pRS315，並將PGAL1-CYC1TT 片段與質體pRS315 以3:1的比例進行接合反應(ligation)，再轉殖入E. coli TOP10中進行PCR快速篩 選，所建構之質體則命名為pYD315，其建構流程如圖一所示。
圖一 質體 pYD315 之建構流程 2. 建構可在S. cerevisiae表面表現之質體pYDAGA2
首先依據Aga2之基因序列(圖二)，設計好16組引子(primer)(圖三)，利用 overlap-extension PCR之方式先做出所要之Aga2基因片段，並以其作為模板，進 行PCR反應，將所需片段Aga2 基因片段放大增幅，並利用PCR Purification kit將 PCR產物加以純化，然後將質體pYD315及Aga2 基因片段，以限制酶 Hind III進 行限制酶切割反應，再依序以Gel extraction kit純化出限制酶反應後之Aga2基因 片段及質體pYD315，並將Aga2基因與質體pYD315以3:1的比例進行接合反應
Aga2-1 : ccgaagcttatgcagttacttcgctgtttttcaatatttt Aga2-2 : ctgttattgcttcagttttagcacaggaactgacaactat Aga2-3 : atgcgagcaaatcccctcaccaactttagaatcgacgccg Aga2-4 : tactctttgtcaacgactactattttggccaacgggaagg Aga2-5 : caatgcaaggagtttttgaatattacaaatcagtaacgtt Aga2-6 : tgtcagtaattgcggttctcacccctcaacaactagcaaa Aga2-7 : ggcagccccataaacacacagtatgtttttcatgctagtg Aga2-8 : gtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctaagcttcgg Aga2-9 : ccgaagcttagaaccaccaccaccagaaccacc
Aga2-10 : accaccagaaccaccaccaccactagcatgaaaaacatac Aga2-11 : tgtgtgtttatggggctgcctttgctagttgttgaggggt Aga2-12 : gagaaccgcaattactgacaaacgttactgatttgtaata Aga2-13 : ttcaaaaactccttgcattgccttcccgttggccaaaata Aga2-14 : gtagtcgttgacaaagagtacggcgtcgattctaaagttg Aga2-15 : gtgaggggatttgctcgcatatagttgtcagttcctgtgc Aga2-16 : taaaactgaagcaataacagaaaatattgaaaaacagcga
圖二 Aga2的基因序列 圖三 16組引子的序列 (Cappellaro et al., 1991)
Amp
PT7 ARSH4 Cen6
PMB1
PGAL1 CYCTT Leu
pYD315
PT7 ARSH4 Cen6
Amp
PMB1
PGAL1 CYCTT Leu
aga2 pYDAGA2
Hind III
PCR1 PCR2 Aga2
By overlap-extension PCR
Amp
PT7 ARSH4 Cen6
PMB1
PGAL1 CYCTT Leu
pYD315
PT7 ARSH4 Cen6
Amp
PMB1
PGAL1 CYCTT Leu
aga2 pYDAGA2
Hind III
PCR1 PCR2 Aga2
By overlap-extension PCR
PT7 ARSH4 Cen6
PMB1
PGAL1 CYCTT Leu
pYD315
PT7 ARSH4 Cen6
Amp
PMB1
PGAL1 CYCTT Leu
aga2 pYDAGA2
Hind III
PCR1 PCR2 Aga2
By overlap-extension PCR
圖四 質體pYDAGA2之建構流程
(ligation)，再轉殖入E. coli TOP10中進行PCR快速篩選，所建構之質體則命名為 pYDAGA2，其建構流程如圖四所示。
3.建構表面及胞內表現β-glucosidase酵素之質體pYDAGA2-Bgl及pYD315-Bgl 首先依Bacillus circulans subsp. alkalophilus之β-glucosidase基因序列設計引 子，進行PCR，將所需β-glucosidase基因片段放大增幅，並利用 PCR Purification kit將PCR產物加以純化，再將質體pYD315、pYDAGA2及β-glucosidase基因片 段，以限制酶 Hind III和EcoR I進行限制酶切割反應，再依序以Gel extraction kit 純化出限制酶反應後之β-glucosidase基因片段及質體pYD315、pYDAGA2 ，並 將β-glucosidase基因與質體pYD315、pYDAGA2分別以3:1的比例進行接合反應 後，再轉殖入E. coli TOP10中後，進行PCR快速篩選，所建構之質體則分別命名 為pYDAGA2-Bgl和pYD315-Bgl，其建構流程如圖五所示。
(control)
PT7 ARSH4 Cen6 Amp
PMB1
PGAL1 CYCTT Leu
Bgl pYD315-Bgl
PT7 ARSH4 Cen6 Amp
PMB1
PGAL1 CYCTT Leu
aga2 pYDAGA2
Bacillus circulans subsp. Alkalophilus PCR
β-glucosidase
PT7 ARSH4 Cen6 Amp
PMB1
PGAL1 Bgl CYCTT Leu
aga2
pYDAGA2-Bgl
HindIII and EcoR1
(control)
PT7 ARSH4 Cen6 Amp
PMB1
PGAL1 CYCTT Leu
Bgl pYD315-Bgl
PT7 ARSH4 Cen6 Amp
PMB1
PGAL1 CYCTT Leu
Bgl pYD315-Bgl
PT7 ARSH4 Cen6 Amp
PMB1
PGAL1 CYCTT Leu
aga2 pYDAGA2
Bacillus circulans subsp. Alkalophilus PCR
β-glucosidase
PT7 ARSH4 Cen6 Amp
PMB1
PGAL1 Bgl CYCTT Leu
aga2
pYDAGA2-Bgl
HindIII and EcoR1
PT7 ARSH4 Cen6 Amp
PMB1
PGAL1 CYCTT Leu
aga2 pYDAGA2
PT7 ARSH4 Cen6 Amp
PMB1
PGAL1 CYCTT Leu
aga2 pYDAGA2
Bacillus circulans subsp. Alkalophilus PCR
β-glucosidase
Bacillus circulans subsp. Alkalophilus PCR
β-glucosidase
PT7 ARSH4 Cen6 Amp
PMB1
PGAL1 Bgl CYCTT Leu
aga2
pYDAGA2-Bgl
PT7 ARSH4 Cen6 Amp
PMB1
PGAL1 Bgl CYCTT Leu
aga2
pYDAGA2-Bgl
HindIII and EcoR1
圖五 質體pYDAGA2-Bgl及pYD315-Bgl之建構流程
4. 酵母菌S. cerevisiae表面及胞內表現β-glucosidase酵素
將質體pYDAGA2-Bgl和pYD315-Bgl分別電轉入Saccharomyces
cerevisiae(Aga1)之宿主細胞中，進行β-glucosidase酵素的表面與胞內表現，如 圖六所示。
圖六 Saccharomyces cerevisiae(Aga1)表面與胞內表現β-glucosidase示意圖 由於宿主細胞S. cerevisiae(Aga1)中缺乏Leucine 和Tryptophan兩個胺基酸，
然而在建構的質體pYDAGA2-Bgl和pYD315-Bgl中含有Leucine基因，因此電轉殖 後S. cerevisiae(Aga1)中只缺乏Tryptophan此胺基酸，所以將轉型後的細胞塗佈在 含有Tryptophan的MD固態培養基上，進行胺基酸的篩選。從MD固態培養基(含 Tryptophan)上挑一顆菌，以YPD 液態培養基於30℃下培養至對數生長期(log phase)，將YPD液態培養基置換成YPG液態培養基於20℃下進行48hr的誘導，誘 導完後，進行Bgl酵素活性測試及酵母菌表面表現工程(yeast surface display)的驗 證，最後應用於生質酒精的生產。
S. cerevisiae表面及胞內表現的β-glucosidase酵素
(1)分別勾取單一菌株SC-pYDAGA2-Bgl與SC-pYD315-Bgl於4ml YPD 液態培 養基在試管內，以200rpm、30℃，培養12-16小時。
(2)放大到搖瓶中，用20ml YPD液態培養基於200rpm、30℃條件下培養至對數 生長期(log phase)。
(3) 離心後將上清液去除，以YP medium清洗菌體數次後，以50ml之YPG液態
培養基於20℃，200rpm 下，進行48hr的誘導。
(4) 收菌，離心後除去上清液，進行酵母菌表面表現的驗證及應用。
β-glucosidase活性測試(呈色法)
p-Nitrophenylβ-D-glucopyranoside (p-NPG)
+ β-glucose
pH : 6.8 – 8.6 (colorless) (yellow)
NO2
OH p-nitrophenol
β-glucosidase
p-Nitrophenylβ-D-glucopyranoside (p-NPG)
+ β-glucose
pH : 6.8 – 8.6 (colorless) (yellow)
NO2
OH NO2
OH p-nitrophenol
β-glucosidase
(1) 利用50mM ,pH=5的醋酸緩衝溶液配置成4mM p-NPG的基質溶液。
(2) 添加適當量的β-glucosidase樣品於基質溶液中,在50℃下，反應30分鐘。
(3) 30分鐘後,加入1ml,0.5M的冰冷Na2CO3溶液,使其反應中止，且提高pH值使 反應溶液呈黃色,在波長405nm下測試其吸光值。
纖維雙糖(cellobiose)發酵生產酒精
(1) 配製YPC液態培養基(5-10% cellobiose) 。
(2) 將宿主細胞、含質體的宿主細胞於YPG 液態培養基誘導後將上清液移除。
(3) 利用YP液態培養基將菌體清洗數次，利用10ml YPC 液態培養基將其懸浮 起來，進行酒精的生產。
纖維素同步糖化發酵(SSF)之流程
(1) 利用磷酸前處理過後之2g纖維布料，添加1 g Yeast Extract、2 g Peptone配 製成100ml之液態培養基。
(2) 利用轉型菌株SC-pYDAGA2-Bgl誘導48hr後之菌體，並額外添加來自
Trichoderma之商業型纖維水解酵素，以及上述液態培養基10ml於30℃下進
行酒精之生產。
五、結果與討論
將建構好之表現質體pYDAGA2-Bgl (可在菌體表面表現Bgl)及pYD315-Bgl (Bgl表現在菌體胞內)分別以電轉殖法轉入宿主S.cerevisiae(Aga1)中，由於宿主細 胞S. cerevisiae(Aga1)為Leucine 和Tryptophan之營養需求株，因此轉形細胞經MD plate篩選後，再以PCR 方式確定所得之轉形株中帶有Bgl基因，如圖一所示在此 兩種轉形株中解可偵測到大小約為1350 bp之Bgl基因。
2
1 3 4 5 6 7
M M 8 9 10
1500
1000
1350bp 2
1 3 4 5 6 7
M M 8 9 10
1500
1000
1350bp
圖七 S. cerevisiae轉形株中β-glucosidase(Bgl) gene之PCR篩選DNA電泳圖。
Lane1,2,3為質體pYD315-Bgl；Lane4,5,6,7,8,9,10為質體pYDAGA2-Bgl之轉形 株。
為了確認pYDAGA2-Bgl轉形株經誘導表現後，能將β-葡萄糖苷酵素表現在 細胞表面，分別和宿主細胞及pYD315-Bgl之轉形株，利用β-葡萄糖苷酵素會將 基質p-NPG水解成黃色之p-nitrophenol，在波長405nm下測吸收值之變化，此吸收 值和β-葡萄糖苷酵素活性成正比，在誘導期間與誘導後取相同的菌量進行測 試，結果如圖八、九所示，pYDAGA2-Bgl轉形株誘導後有最高之吸收值，
pYD315-Bgl轉形株亦呈現些許之吸收值，而宿主細胞本身則不會造成吸收值之
在β-葡萄糖苷酵素表現的定量方面，分別取宿主細胞及pYDAGA2-Bgl和 pYD315-Bgl之轉形株經24小時誘導後，取定量的菌體進行胞內與表面的β-葡萄 糖苷酵素活性分析，結果如表一所示，結果顯示pYDAGA2-Bgl轉形株有最高的 細胞表面活性7.71 U/g DWC，pYD315-Bgl之轉形株有最高之胞內活性32.79 U/g DWC。而培養液與宿主細胞只呈現些許之吸收值。結果顯示pYDAGA2-Bgl和 pYD315-Bgl之轉形株分別能將β-葡萄糖苷酵素表現於細胞的表面與胞內。
纖維雙糖(cellobiose)由二分子葡萄糖以β- ( 1→ 4 ) 鍵結方式而結合，為纖 維素經由內切型纖維素水解酵素 (Endo-1,4-β-D-glucanase ,EG)及外切型纖維素
T im e a fter in d u ction (h r)
20 25 30 35 40 45 50
OD 405
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
Host SC-pYD315-Bgl SC-pYDAGA2-Bgl
T im e a fter in d u ction (h r)
20 25 30 35 40 45 50
OD 405
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
Host SC-pYD315-Bgl SC-pYDAGA2-Bgl Host SC-pYD315-Bgl SC-pYDAGA2-Bgl Host SC-pYD315-Bgl SC-pYDAGA2-Bgl
圖八 誘導期間完整菌體細胞之β-葡萄糖苷酵素活性表現情形(實心:為誘導；空 心:誘導)
Time (min)
0 10 20 30 40 50 60 70
OD 405
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Host SC-pYD315-Bgl SC-pYDAGA2-Bgl Substrate
Time (min)
0 10 20 30 40 50 60 70
OD 405
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Host SC-pYD315-Bgl SC-pYDAGA2-Bgl Host SC-pYD315-Bgl SC-pYDAGA2-Bgl Substrate
圖九 誘導 48h 後之定量菌體細胞與基質 p-NPG 之反應曲線(實心:為誘導；空心:
誘導)
表一 宿主細胞及pYDAGA2-Bgl和pYD315-Bgl之轉形株誘導48h後之β-葡萄糖 苷酵素活性(U/g dry cell)
Host pYDAGA2-Bgl pYD315-Bgl
medium broth 0.08 0.07 0.07
Surface 1.25 7.71 1.59
intracellular 1.75 6.02 32.79 One unit of β-glucosidase activity is defined as the amount of enzyme that liberates µmol of p-nitrophenol per minute.
水解酵素(Exo-1,4-β-D-glucanase ,CBH)水解作用而生成，但由於纖維雙糖 (cellobiose)無法讓微生物所利用，因此表現β-葡萄糖苷酵素在酵母菌表面上，可 直接水解纖維雙糖(cellobiose)，產生出酒精。由圖十、十一得知，提供20g/l纖維 雙糖，pYDAGA2-Bgl之轉形株於誘導後會將β-葡萄糖苷酵素表現在細胞表面，
可直接將纖維雙糖，提供酵母菌生長及酒精生產，於發酵48小時可得到約5.3 g/l 的酒精，其產率為0.35 g EtOH/ g cellobiose (理論產率為0.5)。另外，pYD315-Bgl 之轉形株於誘導後會將β-葡萄糖苷酵素表現在細胞內，亦發現也可將纖維雙糖 發酵產生酒精，於發酵48小時候可得4.5 g/L的酒精，其產率為0.24 g EtOH/ g cellubiose，纖維雙糖的利用效率相較於表面表現的低。結果顯示，β-葡萄糖苷 酵素表現在表面或胞內都可將纖維雙糖發酵產生酒精，而酵母菌胞外表現有較高 的纖維雙糖的利用率。但宿主細胞幾乎不產生任何酒精，由此可更近一步證明我 們已建立β-葡萄糖苷酵素酵母菌表面表現的技術。
進一步利用50g/l纖維雙糖濃度的基質進行酒精發酵，結果如圖十二、十三所 示，pYDAGA2-Bgl之轉形株於誘導後發酵，24小時可得到約8 g/l的酒精，其產 率為0.23 g EtOH/ g cellobiose (理論產率為0.5)。pYD315-Bgl之轉形株於誘導後發 酵，60小時候可得10.5 g/L的酒精，其產率為0.25 g EtOH/ g cellobiose (理論產率 為0.5)。相同的宿主細胞並無法利用纖維雙糖產生任何酒精。在纖維雙糖的利用 速率方面，表面表現的pYDAGA2-Bgl之轉形株在高濃度的纖維雙糖條件下，有 較快的利用速率；相對於胞內表現的pYD315-Bgl之轉形株，在纖維雙糖的利用 情形則有遲緩的現象，在36小時候才有酒精產生。在提供100g/l纖維雙糖發酵方
Time (hour)
0 10 20 30 40 50 60
Ethanol (g/L)
0 1 2 3 4 5 6
Host SC-pYD315-Bgl SC-pYDAGA2-Bgl
Time (hours)
0 10 20 30 40 50 60
Cellobiose (g/L)
0 5 10 15 20 25
Host SC-pYD315-Bgl SC-pYDAGA2-Bgl
圖十、十一 pYDAGA2-Bgl、pYD315-Bgl之轉形株及宿主細胞本身在誘導後利 用20 g/l 纖維雙糖(cellobiose)發酵生產酒精
Time (hour)
0 20 40 60 80
Ethanol (g/L)
0 2 4 6 8 10 12
Host SC-pYD315-Bgl SC-pYDAGA2-Bgl
Time (hour)
0 20 40 60 80
Cellobiose (g/L)
0 10 20 30 40 50
Host SC-pYD315-Bgl SC-pYDAGA2-Bgl
圖十二、十三 pYDAGA2-Bgl、pYD315-Bgl之轉形株及宿主細胞本身在誘導後利用 50 g/l 纖維雙糖(cellobiose)發酵生產酒精
Fermentation time (hr)
0 20 40 60 80 100 120
Ethanol (g/l)
0 5 10 15 20 25 30
Host SC-pYD315-Bgl SC-pYDAGA2-Bgl
Ferm entation tim e(hr)
0 10 20 30 40 50 60 70
Ethanol (g/l)
0 5 10 15 20 25
SC-pYDAGA2-Bgl- without induction SC-pYDAGA2-Bgl-induction
圖十四、十五 pYDAGA2-Bgl、pYD315-Bgl之轉形株及宿主細胞本身在誘導後 利用100 g/l 纖維雙糖(cellobiose)發酵生產酒精
面，結果如圖十四、十五所示，pYDAGA2-Bgl之轉形株於發酵72hr可得到約23g/l 的酒精，其酒精轉化率約23%。相對於胞內表現的pYD315-Bgl之轉形株則在高濃 度的纖維雙糖下，其代謝纖維雙糖的能力完全被抑制，而無法產生酒精。相同的，
宿主細胞也無法產生任何酒精。在酵母菌表現系統的啟動子方面，酵母菌基因表 現系統常見之啟動子(promoter)包括組成性(constitutive)啟動子和誘導性
(inducible)啟動子兩種:組成性啟動子包含glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase(GPD)、phosphoglycerate kinase(PGK)、alcohol dehtdrogenase I(ADHI) 及triose phosphate isomerase(TPI)等啟動子，誘導性啟動子包含galactokinase(GAL) 和acid phosphatase(PHO5)，可經由glucose/galactose或無機磷酸鹽進行誘導表現。
而本研究是利用GAL promoter之系統。因此在長時間的發酵下，由於在發酵液中 並無galactose之添加，所以在發酵過程中所長出的新細胞並無法誘導出胞外與胞 內的β-葡萄糖苷酵素表現，因此無法利用纖維雙糖產生可被代謝之葡萄醣，只 能以酒精當碳源，導致酒精濃度有些許減少的現象。
本研究主要目的是希望藉由細胞表面表現之β-葡萄糖苷酵素，在纖維素進 行同步糖化水解發酵時，可藉由細胞表面之β-葡萄糖苷酵素來分解纖維雙糖，
避免累積過多之纖維雙糖(cellobiose)及一些寡醣(oligosaccharide)而抑制
Endo-1,4-β-D-glucanase及Exo-1,4-β-D-glucanase之酵素活性。在使用
pYDAGA2-Bgl之轉形株於纖維素之同步糖化水解發酵(SSF)生產酒精方面，提供 20g/l之磷酸處理過後之棉布纖維進行同步糖化發酵，由圖十六可得知，
pYDAGA2-Bgl之轉形株於發酵36hr後，約可產生4.6g/l之酒精，而宿主細胞於發 酵36hr時，約可生成3.5g/l之酒精，由此結果得知，轉形株經由細胞表面表現之 β-葡萄糖苷酵素提升了32%的酒精產量，另外，轉型菌生產3g/l之酒精約只需要 6小時，而宿主細胞則需花約30小時，才能到達此酒精量。因此酵母菌表面表現 β-葡萄糖苷酵素能有效提升利用纖維素同步糖化發酵之效率。
Fermentation time (hr)
0 10 20 30 40 50 60
Ethanol (g/l)
0 1 2 3 4 5
Host
SC-pYDAGA2-Bgl
圖十六 表面表現β-葡萄糖苷酵素之酵母菌以棉布纖維進行同步糖化發酵生產 酒精
貳、參考文獻
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參、計畫成果自評
1. 已成功完成可在酵母菌Saccharomyces cerevisiae細胞表面表現及細胞內部表 現β-葡萄糖苷酵素之質體pYDAGA2-Bgl、pYD315-Bgl之建構，而且已能以電轉 殖方式將此質體轉形進入酵母菌之染色體中。
2. 所篩選出的轉形株經誘導後可在酵母菌細胞表面表現出β-葡萄糖苷酵素，
細胞表面表現的活性為7.71 U/g DW C，細胞內表現活性32.79 U/g DWC，此轉形 細胞可直接利用纖維雙糖發酵產生出酒精。在20g/L濃度之纖維雙糖發酵下，細 胞表面表現與細胞內表現的轉形株皆可將纖維雙糖發酵成酒精。
3. 以100g/L濃度之纖維雙糖發酵可產出23 g/L之酒精，其效率遠不及直接使用 100g/L葡萄糖濃度所產生之40 g/L 之酒精，主要原因在於所建構之表現質體是以 galactose誘導表現，然而發酵過程中並無galactose之持續添加，導致所長出的新 細胞表面並無β-葡萄糖苷酵素，因此無法將纖維雙糖轉化為可發酵成酒精之葡 萄醣。
4. 而細胞表面表現之β-葡萄糖苷酵素直接應用於纖維素進行同步糖化水解發 酵時，則可能提升了32%的酒精產量，酵母菌表面表現β-葡萄糖苷酵素能有效 提升利用纖維素同步糖化發酵之效率。
5. 所建構之galactose誘導表現質體，需更改為無需誘導之組成性表現質體，才 能使此表面表現之酵母菌在纖維素同步糖化發酵發揮最大之效率。
出席國際學術會議心得報告
計畫編號 96-2221-E-011-076-MY2
計畫名稱 酵母菌細胞表面蛋白之表現及其在生質酒精生產上之應用 出國人員姓名
服務機關及職稱
李振綱
國立台灣科技大學化學工程系 教授
會議時間地點 2008 年 7 月 28-31 日，香港理工大學，香港
會議名稱
International conference on Multifunctional materials and structures and their applications(MFMS 2008)
2008 年多功能材料結構及其應用國際會議
發表論文題目
The design of novel scaffolds by integrating microbial cellulose onto plasma treated polypropylene
Nani Wibowo, Meng-Jiy Wang, Chin-Chuan Chang, Cheng-Kang Lee Department of Chemical Engineering, NTUST, Taipei, Taiwan.
一、參加會議經過
2008 年多功能材料結構及其應用國際會議的主要會議目的，為邀請來自世 界各地，包括北美、南美、歐洲、澳洲以及亞洲等地學有專精的學者與會，對 新穎性材料、複合材料以及其應用，交換並討論研究之成果。會議的主辦地點 為香港理工大學，位於香港中心的九龍半島上，接近紅磡以及尖沙嘴地區。會 議的舉行分成每天上午 8:00-10:00 的兩場 key note 演講，邀請在新穎及複合材 料方面的學者以及產業界的專家提出現階段世界研究的方向；在專題演講方 面，每天有三個場次，包括每天上午 10:30-12:30，下午 13:30-16:00 以及 16:30-18:30 等場次。會議的第三天則有上午以及下午兩場次的海報展示。
二、與會心得
近二十年來，因為科技以及生活型態的改變，在許多材料科學與工程的研究 方向上，出現了顯著的轉變趨勢，例如，在規模上，傾向微米、奈米的研究與 應用；在材料的選擇方面，重複使用材料、廢物利用、有機以及無機的複合材 料，因為經濟效益以及有助於環境保護，受到廣泛的注意；在新材料的開發方 面，生物材料、組織工程學、綠色能源概念材料，包括能源的產生、觸媒的製 備則成為重要的研究領域。有鑒於新材料的研發已及研究成果交換的重要性，
特別參加此次由香港理工大學主辦的多功能材料會議。
2008 年多功能材料結構及其應用國際會議的議程安排為，每天上午有兩場 key note 演講，邀請來自各相關領域的學者，對於目前材料研究，提出前瞻性的 觀察以及展望，例如美國 Arkansas 的 Varadam 教授特別針對”奈米、生物、資訊 感測器”提出在醫學以及工程方向上的展望以及現階段在北美洲的研究情形，包 括技術移轉、學校與產業界合作所面臨的問題以及產業界研發的現況。英國劍 橋大學的 Clyne 教授則是提出先進的金屬複合材料的應用，以及目前歐洲的研究 概況。
來自德州農工大學的 Lagoudas 教授所分享的，是利用數值方法模擬形狀記 憶性合金(shape memory alloys)材料，以及磁性的記憶性合金(magnetic memory alloys)等。澳洲先進複合材料中心的 Scott 教授則是特別提出，在研發未來複合 材料，考慮其應用時所需考慮的問題，包括奈米材料與微米材料的結合，有機
討以及考量的問題。
由於本人的研究方向與生物材料關係密切，因此本次會議主要參與和本主題 相關的專題演講。在生物材料方面，許多學者提出材料表面官能性對於提升材 料生物相容性的影響方面的研究；同時，對於醫用材料，特別是骨質的材料以 及牙醫用材料，都有密切的討論。在骨質以及牙醫用材料方面，材料的機械性 質都扮演重要角色，但是材料的表面同時要能夠使得骨細胞適當附著以及生 長。在生物感測器研究方面，不同的感測模式，應用於不同的化學反應或是專 一反應，材料的選擇是一重要課題。在這方面的討論，包括如何增進氧化還原 反應，使化學反應訊息增強，提高靈敏度；或是如何設計材料的表面，包括利 用微結構或是複合材料的方式，使得反應的選擇性提升。
本次與會報告的論文題目為：“The design of novel scaffolds by integrating microbial
cellulose onto plasma treated polypropylene”，為薄膜表面處理與天然纖維素之附著研 究。研究的方式為利用高能激發不同氣體，處理薄膜表面，薄膜表面會因為氣 體的選擇不同，而引入不同的官能基，同時，薄膜表面的親疏水性也會因此而 改變。本次會議的報告引起許多學者的注意，其中，日本的學者對於如何選擇 適當的氣體，並以高能激發，以得到較好的纖維素附著，提出問題。本研究得 到的結論為使用氧氣、二氧化碳或是含氮的氣體，能夠使得薄膜表面轉變為親 水性，並且使得纖維素較易附著。來自香港的學者則對於纖維素的大量產生以
了具有良好的機械性質，同時更具有良好的保濕性及生物相容性，因此非常適 用於醫用的敷藥基材，並且可應用於組織工程學的基材。
本次參加會議，除了報告研究成果之外，更藉由此次機會，結識來自世界各 地相關的研究人員，交換討論研究的心得，收穫非常豐富。
