en 私立中山聲學院醫學研究所

私立中山聲學院醫學研究所

Graduate Insti的te ofMedicine

Chung Shan Medical and Dental College

碩士論文

Master Thesis

各種藥物對感染廣東住血緣姦小鼠治療效果之 生化評估及其致病機轉之研究

Biochemical eva1uation of milbemycin D

、 albendazole

and VD-99-11 on A ngiostrongylus cantonensis infected in mice &

studies on pathogenesis of Angiostrongylus cantonensis in mice

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研究生:歐嘉仁 (Chia-Jen 0日)撰

中華氏國八十六年六月

授權書

(i年研士論文)

本投權書所投權之論文為本人在中山時學院 醫學研究所

一…一_~l51一一一組的學年度第 2 學期所撰碩士學位論文。

論文名稱:各種禁物對是民染廣東住血線蟲小鼠治療效果之生化評姑及其致病機轉之研究

d同意 已不同意

本人具有著作財產權之論文提耍，授予國家圖書館、本人畢業學校及行政院 國家科學委員會科學技術資料中心. ，得重製成電子資料檔後收錄於該單位之 網路，並與台灣學術網路及科技網路連線，得不服地域時間與次數，以光碟 或紙本章製發行。

函意口不同意

本人具有著作財產權之論文全文資料，授予行政院留家科學委員會科學技術 資料中心，得不 Fìt 地域時間與次數以微縮、光碟重製後發行，並得享該中心 微縮小組製作之研究報告、獎勵代表作、博碩士論文三擋資料等位新台幣伍 佰元之服務 O 本論文因涉及專利等智慧財產權之申請，請將本論文全文延後

至民國位五年二三月後再公開 o

口同意已同意

本人具有著作財產權之論文全文資料，授予教育部指定送繳之園書館及本人 畢業學校圖書館，為學衛研究之目的以各種方法重製，或為上述目的再授權 他人以各種方法重製，不 Fìt 時間與地域，惟每人以一份為 Fìt 0

上述授權內容均無須訂立讓與及授權契約書。依本授權之發行權為非專屬性發行 權利 O 依本授權所為之收錄、重製、發行及學術研發利用均為無償 o

指導教授姓名:王朝鐘李秀雄

研究生糾:一盤主任一 學號:即4124

(親筆正椅)

目期:民圓金全年一豆一月一L~L 日

備說1.上述同意與不同意之攔位若未勾選，本人向意視同授權。

2. 授權第二項者，請再交論文一本予承辦人員 o

3. 本授權書已於民國 85 年是月 10 日送請著委會修正定稿 D

簽署人須知

1.依著作權法的規定，任何單位以網路、光蝶與微縮等方式整合國內學術資料，

均須先得到著作財產權人授權，請分別在三種利用方式的同意棚內錦還並填妥 各項資料 o

2. 所謂非專屬授權是指被授權人所取得的權利並非獨占性的使用權，授權人尚可 將相同的權利重複授權給他人使用;反之即為專屬授權，如果您已簽署專屬授 權書予其他法人或自然、人，請勿接署本授權書。

3. 授權人的權利與義務:

在美國授權博碩士論文予 UMI 公司(博碩士論文全文資料發行公司)製作發行

，須交付美金 45 元的出版費，銷售年址七件以上時得享收入 10% 的權利金約美 金 20 元;在國內本計畫之經費全數由政府支應，收入亦應歸國庫，為答謝您的 支持，科資中心特為您提供新台幣 500 元的等值資料服務(以研究報告、獎勵 代表作、博碩士論文三擋為眼) ，請逕洽本案聯絡人，地址電話詳如第 5 項 O 義務方面唯一要注意走，著作人日後不可以主張終止本授權書，但您仍可以授 權其他自然人或法人上述的行為 O

4. 全聞博碩士論文全文資料微縮片整合計畫的宏觀效益:

在個人方面，您的論文將可永久保存(微縮技衛在理論上可保存八百年，實證

已逾百年) ，也因為您的授權，使得後進得以透過電腦網路與光碟多管道槍索

，您的論文將因而被充分利用。在國家總體利革方面，紙本容易困影印而造成 裝訂上的傷害，圖書館中孤本的公開陳列與外惜也有破損之虞，唯有賴政府全 面性的聲令，借助科技設備才能一舉完成保存與利用的全方位效萃，回憶您過 去尋找資料之不使經驗，學弟與學妹確實須要您的論文與授權書 D

5. 本案聯絡電話 {02)7377746 江守田、王淑貞 地址:台北市和平泉路二段 106 號 17 樓 1702 室

1立合丸 r

研究生姓名:立法處It :::，聯絡電話:一哎哎主任一一

地址: 電台林縣@樣笠莫逆平路 t"f--"Þ忱

本論文為中山醫學院授予理學碩士學位之必備條件

之一會經中山醫學院醫學研究所碩士論文考試委員會

審查合格及口試通過 O

口試委員

因立中與大學獸醫學系 教授

私立中山醫學 i究生物化學研究所 教授兼所長

(本論文指導教授)

私立中山醫學院寄生蟲學科

教授兼主任

(本論文指導教授)

王俊秀博士

Z dA才

王朝鐘博士

~ í月 ti

李秀雄博士

在文祥

學生歐嘉仁論文題目為各種藥物對感染廣東住血線

蟲小鼠治療效果之生化評估及其致病機轉之研究，其

論文已經中山醫學院醫學研究所碩士論文考試委員

會審查合格及口試通過，並由指導教授核閱後無誤 O

指導教授:李秀雄博士 簽名:

王朝鐘博士 簽名:付1

目錄

目錄. . . .

*' • • • • • • *' • • *' • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

1

縮寫表. . . .

*' *' *'

2

中文摘要. . .

*' • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

3

英文摘要. . . .

*' • • • *' • • • • • • *' • • • • *' • • • • • • *' • *' • • • • • • • • • • • • •

4

研究動機. . . .

*' • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

6

五丹究架構. . . . .. . . . .. 7

緒言. . . . .. .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. 8

材料與方法. . . .

*' • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

.22

結果. . . . .. . . . .. . . . .的 討這命.

• • • • • • • • • • • • • • • • • • .. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

50

圖表. . . . " . . . .. . 56

參考文獻. . . . .. . . .衍

A.c.

AP 間 l

BCIP BSA DAB DAG EDTA EGTA Eso FBS GABA Hb Hct NBT PAGE PBS PKC aPKC cPKC nPKC Plt PMSF RBC SDS TBST TEMED WBC

縮寫表

: Angiostrongylus cantonensis : Activator protein-l

:

5 岫 bromo-4 間 chloro-3 咽 indolylphosphate

: Bovine serum albumin

: 3 , 3' -diaminobenzeidine tetrahydrochloride : Diacylglycerol

: Ethylene diamine tetraacetic acid

: Ethylene glycol bis ( ß-aminoethylether )- N , N , N' , N'-tetraacetic acid

: Eosinophil

:

Feta:l、 bovine

serum

:y舟minobutyric

acid : He'moglobin

: Hematocrit

: Nitrobluetetrazolium

: Polyacrylamide gel electrophoresis : Phosphate buffered saline

: Protein kinase C

: Atypical protein kinase C : Conventional protein kinase C

: Novel protein kinase C : Platelet

: Phenylmethylsulfonyl fluoride : Erthrocyte , red blood cell

: Sodium dodecyl sulfate

:

Tris 岫 buffered

solution Tween-20 : Tetramethyl ethylenediamine

: Leukocyte , white blo"od cell

中文摘要

為探討廣東住血線蟲所引起的致病機轉，以三種驅

品藥如 milbemycin

D

、 VD-9 弘 1 1 及 albendazole 治療感 染廣東住血緣蟲第三期幼姦小鼠，於感染後第 5 ，的及 42 天解剖，取小鼠絡部組織萃取液?以生化電泳分析

(

SDS 目PAGE) 、西方墨點分析法( Western 間 blot )分 析腦內是否有特異性蛋白出現且以及偵測其 protein

kinase C (PKC) 、 ferritin 及原致癌基因 c-Jun 、 c-fos 與 c­

myc 蛋白表現J 章是否與對照組有差異，以作為與傳統治 療效果評估之比較，同時藉由實驗所得的結果來探討廣 東住血線最對宿主的致病機轉 O

實驗結果在感染廣東住血緣品而未加以治療，及以 VD 四 99-11 治療之小鼠腦部組織細胞核部份的萃取液之 SDS 且PAGE 電泳分析中發現有一分子量約為 50-kDa 的蛋 白表現，然而在未感染及以 milbemycin

D

、 albendazole 治療組之小鼠腦部組織中卻沒有此特其性的蛋白質出 現;據此，我們認為以生化方法初步評估治療效果是可

行的;在進一步的實驗中，我們發現 PKC 、 ferriti n 與 c-Jun 、 c-fos 與 c-myc 蛋白測定可得到在實驗組中的未 治療組及未治癢組與陰性對照組比較，亦有顯著的差 異;可發現.PKC 在感染初期(即第 5 天) ，在感染組皆 有明顯大量表現 PKC 在感染第 25 天，感染各組與陰 性對照組的 PKC 表現量相當;在感染後第白天?感染 紐約 PKC 表現量明顯小於陰性對照妞，然而， ferritin 、 c-Jun 、 c-fos 與 c-myc 在陽性對照經典 VD-99 胃口治療恕

的蛋白表現量都隨感染時間的延長成正比增加其表現 暈 o

依據以上的實驗結果，我們初步可了解廣東住血緣 蟲之致病原因可能和 PKC

translation

、 ferritin 的表現及 致癌基因 c-Jun 、 c-fos 與 c-myc 蛋白活化之闊的相關 性，唯其詳細機轉有待進一步探討 o

Abs甘詣的

ln this study , we have investigated the pathogenesis of the Angiostrongylus cantonensis. The objectives of this work are to compare the

e能cts

ofthree kinds ofthe drugs as milbemycin D , VD-99-11 and albendazole , besides this , 1 proposed to study the effect of the parasite in ICR mice , in vivo model and evaluate the traditional and biochemical chemo- therapeutics. We have taken some laboratory techniques like sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electro- phoresis (SDS-P AGE) , western-blot , to analyze the extracts of the brain tissue. In order to check the different changes of protein

,

including some

distin 皂uishing

protein

,

ferritin

,

protein kinase C (PKC) and three kinds of proto-oncogenes (c-jun , c-fos and c-myc).

Several clinical diagnostic criteria have been applied to evaluate the cli l1 kal manifestation as well as the underlying mechanism for the parasite disease (angiostrongyliasis)

developme肘，

including the

hematologic 剖， pathologic 訓，

bio-chemical and molecular biological examinations of the infected mice at different time periods of infections. The results of this experiment: significantly increased in both leukocyte and eosinoph i1 counts have been found among the infected mice than those of controls. Evident inflammatory ,

infi 1trative tissue as well as other pathologic changes were

noticed by histological examinations of the infected and incured mice.

In addition , we have found the 50-kDa protein band pattern was quantitatively increase in brain nucleus from the A. cantonensis infected and incured mice , however , it was almost absent in normal and cured mice. And another protein variation ,

fe討itin實 was

also been found in the nucleus of brain.

Besides these , obvious expressions of both cytoplasmic and membranous PKCs were detected by western blotting analysis.

In the other hand , the results of western-blot have been

demonstrated that increased , significant expressions of c-jun , c-fos and c-myc. Although this study has provided some evidences to elucidate the causal relationship between A. cantonensis infection and

pathogenes站，

however

^,

the underlying mechanism sti 11 needs

t。

如此her

c1arified.

研究動機

近年來台灣社會長足進步，經濟能力與生活品質上 的大幅提昇 9 使得民眾感染各稜寄生品的機會在今已不

再多丸，但每年在台灣仍發現有許多因飲食不當而感染 廣東住血線蟲的病例，該姦蟲體對人體中樞神經系統的 傷害?如引起嗜伊紅性腦膜炎及嗜伊紅性腦膜腦炎?更 是對人類造成嚴重的威脅，且由於目前尚無有效的藥物 可供治療 9 只能針封為人的臨床症狀採取支持性療法以 舒緩兵病痛實在此吩能尋找一有效治療廣東住血緣蟲的 驅蟲藥以為研究動機之一;另外就現今相關文獻針對廣 東住血緣品如何破壞腦部組織的致病機轉方面的研究仍

未充份明瞭?前述有關經蟲藥之研究也隨之受到影響，

文獻中對於廣東住血線最症之生化學研究更是寥寥可 數，近年來由於分子生物學之研究突飛混進，應用比方

面技術對於致病機轉之探討應有非常好的研究空閑 o 有鑒於此，本篇論文的研究目的是想以各種生化技 街評估在活體內(

in vivo

)模式，來探討確立廣東住血 緣蟲之致病機轉;就以與人類同為非適當宿主之小鼠臟 器病害在生化學上的反應為研究途徑，以人工感染廣東 住血緣蟲第三期幼品之小鼠，經 milbemycin

D

^{、 VD-}

99-11 、 albendazole 這三種藥物加以治療處理，以分析 治療後未治癒及治癒之感染廣東住血線蟲小鼠腦部蛋白 質是否有變化，再藉由探討自由基所造成的氧化性壓力 是否對蛋白激酵素( PKC) 、 ferritin 及致癌基因 c-j 仰、

c-fos 與 c-myc 蛋白的表現是否有差異來評估與感染廣東 住血緣蟲之問是否有相關性，紛能以此做為分析藥物治 療成效之依據與探討其可能之致病機轉 o

研究架構

研究目的:廣東住血線蟲之致病機轉

以廣東住血線蟲第三期幼蟲感染小鼠

以 milbemycin

D

、 VD 岫 99-11 、 albendazole 等 更感染廣東住血線蟲第三期幼蟲二

體內 (in yivo) 試驗

進行藥物治療效果評估用以 探討廣東住血線蟲蟲體之機械性傷害或

其釋出物質對行鼠所造成之影響

血液學 ^病理學 生化學

中

_{:提 3夜}

A

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常 生 學 組 質 ^ι豆ι豆J

規 f匕 ^{觀 織 品也, 京}

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學 ^杏 染 析 PKC

檢 色

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C-

緒 AZ

口

一.廣東住血線蟲( Angiostrongylus cantonensis )

廣東住血線是(

Angiostrongylus cantonensis)

, 種主要寄生於噶齒類動物的寄生姦(1) ，可經意外感染於 人類，屬於人畜共通寄生蟲(

zoonotic parasites

)中的 一種;其感染地域主要分佈在赤道帶地區實包括熱帶及 亞熱帶手氣候監事在此區域中可發現廣東住血線蟲是導致 當地居民權患嗜伊紅性腦膜炎(

eosinophilic meningitis )

(2~4) 與嗜伊紅性腦膜腦炎(

eosinophilic meningoence-

phalitis

)的主要病因 (5~11)O 最早發現廣東住血緣蟲是一

位中關學者陳心陶先生，於 ]933 年在中題廣東省境內調 金褐鼠與玄鼠體內寄生品時，在鼠類肺動脈及心臟內所 發現此種線品類寄生蟲 F 當時命名為 Pulmonema

canto nens

iS (1 2) 在台灣，鼠類被發現感染廣東住血緣品

的第一份報告是在 1937 年， rb 日籍學者松本( Matsu 岫

moto)

，在台灣東部地區的野鼠肺臟中發現此品(

13

)同

年橫川(

Yokogawa

)將之命名為 Haemostrongylus

ratti

(1 4) 0 首例人體感染廣東住血緣蟲的病例報告，是於

1945 年在台灣由野村(

Nomura

)與林(

Lin

)兩位學 者在一位疑似罹志腦膜炎死亡的十五歲日本男孩的腦脊 髓液內發現，該蟲蟲體?經橫 )11 證實為廣東住血線蟲的未

成熟蟲體(1 5) 至 1946 年， Dougherty 發況 Pulmonema

cantonensis 及 Haemostrongylus ratti 兩者為同種類線 蟲 F 且在分類學上與 A

ng i

⁰

s t r

⁰

n gy 1

us 屬相同?因此正式 將此寄生蟲重新命名為廣東住血緣品 ，

Angiostrongylus CGntonensis(16)O

廣東住血緣品為一纖細白色孟全體，成是寄生於老鼠 游動派與心臟，雄性成蟲姦體長 20 ~

25 mm

、直徑為 0.30

'" 0.40

mm 雌性成品 iJ~ 體長 22 ~

32

mm 、 LI生徑為 0.32 ~

0.50 mm

'雌蟲晶體的特色是腸道與子宮小管(

utcri uc

tubules

)纏繞在一起?看似理髮店前的招牌，故稱為

barber's pole(17)

⁰

廣東住血緣蟲的生活史 (Figure

1)

，在經由實驗室建 立動物感染模式而闡明(1 8 ， 19) 在其生活史中，需要利用 一些軟體動物當作中間宿主，包括陸生螺類?有非洲大 蝸牛(

Achatina fulica )

(20~27) 與薄殼蝸牛(

Bradybaena similaris )

(20) 、水生螺類，有四螺(

Cipangopaludina chinens is ) (28) 、1、安腹螺( Ampullarium canaliculatz的)

(29) 與國寶螺(

Pomacea canaliculata

)(30) 以及二種結瑜?

為大型結瑜(

Laevicaulis alte )

(26 ， 31) 與小型結瑜( Vagz 由

nulus plebeius )

(21) 等;此外，在廣東住血線蟲的傳播途 徑中，亦有多種動物被當作為保蟲宿主，至今被發現的

保蟲宿主有蛙類 9 分別有金線蛙( Ranα plancy ) (26) 與

虎皮蛙(

Rana tigrina )

(26) 、渦品類(

planarian )

(21) 、 淡水蟹與淡水蝦 (32~36); 中間宿主與保蟲宿主兩者皆為流 行病學土重要之傳染媒介，另外?也有報告指出第三期 幼蟲會隨著中間宿主所分泌的黏液而附著在蔬菜、水果

(1)或水中 (37) 。

老鼠為其終宿主，據 1964 年 Kuntz 等學者 (22 ， 26 ， 38~

41) ，對台灣不同地豆豆之老鼠做流行病學調查 9 結果共發 現台灣有七種老鼠為廣東住血緣蟲的自然終宿.ì，分別 為刺鼠(

Rattus coxinga coxinga

)、白腹鼠(

R. losea

)、

褐鼠(

R. norvegicus

)、家鼠(

R. rattus subsp.

)、蘭 嶼黑鼠(

R. rattus

mindα nensis )、澎湖黑鼠(

R. rattus rufescens

)與鬼鼠(

Bandicota

indicα nemorivaga )等;

而人屬非適當宿主;當第一期幼品自感染廣東住血緣蟲 老鼠糞便排出後，第一期幼蟲可被中間宿主吃入或穿過 中悶宿主體表而感染 (42) ，在中間宿主體內說皮二次，由 第一期幼蟲發育為第三期幼姦 9 第三期幼蟲是具有感染 能力的幼蟲，在自然界中，老鼠是經食入中間宿主或食

用被中間宿主污染的食物而感染?幼品經口快速通 j過)'(

到達腸道?然後進入循環系統，經腸繫月莫靜脈或腸繫月莫 淋巴管、 F' 月泉、右心笠、肺?到達腦部僅需 1~2 天;在 第 4"-'6 天經說皮形成第四期幼蟲，約 7"-'9 夭再經蛻皮 形成第五期幼姦型最後幼蟲會移行至腦的表面和蜘蛛膜 下腔 (43) ，少數蟲體停在腦部組織內?其他的幼蟲則經顱 靜脈 9 約 26

"-'

29 天移行至心臟、肺動脈繼續發育為成 品，經交配產卵，卵隨血流主微血管中孵化為第一期幼 品，然後穿過微血管進入肺泡，在移行到氣管、咽喉，

經吞機進入腸胃，隨鼠糞排出體外;自鼠類食入第三期 幼蟲到糞便發現有第一期幼品?整個生活史約需 42 ~的 天 (44) ⁰

人類等非適當宿主經誤食 (37) 或經體表傷口進入動物 體內 (45) 而意外感染第三期幼蟲後 9 品體在非適當宿主體

內僅發育為大小長約 7.7 "， 18.3mm' 直徑。 .03 ~

0.3 mm

之第四期或第五期未成熟蟲體 (46) ，很少能發育為正常成 姦;但廣東住血緣蟲幼蟲在非適當宿主體內移行時所引 起的機械性傷害及浸潤之嗜伊紅性白血球所釋放的毒素 與化學物質，是造成中樞神經系統病害的主要原因 (47) 其感染性的第三期幼蟲進入人體之後，經消化道侵入胃 黏渡?隨後進入血管與淋巴管?造成胃腸道症狀 (48~50) ， 也可能因幼蟲侵入肝臟而引起肝股大 (51) ，之後，這些幼 蟲再經由血液循環或經由周圍神經系統進入腦部 (52~57)

包括有大腦髓質、小腦、橋腦、腦軟膜 (51 )和脊髓 (58) ，產

生如:嗜伊紅性腦脊神經炎(

eosinophil

meningo 闇

radiculitis )

(59) 、發燒、頑罰性頭痛 (60) 、嘔吐或噁心、

昏睡、倦怠、頸部僵硬、昏迷、智能障礙、缺乏定向感、

和說話不連貫等中樞神經系統之病害 (1);F 泛稱為廣東 住血緣品症(

angiostrongyliasis)

，除了在腦、脊髓、肝 臟內曾發現廣東住血緣熹;除此以外，也在肺臟組織 (43 ， 61-63) 及眼睛 (64~66) 發現過該品蟲體出現。

廣東住血緣蟲的分佈區域主要位於熱帶與亞熱帶多地

霞，大概是由北緯 23 度到南緯 23 度，東經 10 。度至西 經 150 度的區域內?其氣候溫暖潮濕多雨?為廣東住血 線蟲感染流行區的共同特徵?其泊萃的範園西從事L 牙海 岸 (67) 、埃及 (68) 、馬達加斯加 (69) 、模里西斯 9 經印度 (57 ， 70) 、 錫蘭到東南亞地昆?包括泰國(7 1 ， 72) 、高棉、馬來西亞 (73) 及印尼(7 4) 等函，台灣 (75) 、中國南部(7 6) ，為太平洋群島 上的大溪地 (7) 、夏威夷 (33) 、斐濟 (77) 及大西洋上的古巴 (7 8~81) 與巴西 (82) 也都發現有廣東住血緣熹;另外除了赤道

帶地區外，在日本(肘， 84 )、琉球 (64) 、澳洲北部 (85~87) 、紐西 蘭 (88) 及美國本土 (89) 等地，據報告亦有廣東住血緣品的存 在 o

廣東住血線蟲症( angiostrongyliasis) 在台灣是屬於 一稜相當重要的人畜共通寄生品性疾病，死亡率高達 3.1

%

(75 ， 90) ，從 1945 年 9 台灣發現第一例人體病歷報告以來，

這稜對太平洋上許多島嶼及東南亞國家居民所引起嗜伊 紅性腦膜炎之寄生蟲病才問始受到重視?自目前已達數 百例發病病歷報告 (62); 在台灣流行的地區主要分佈在台 灣南部及東部，北部其lJ 較少見 (40 ， 51) 就年齡分佈方面，

大多數為孩童感染 (11 ， 91 ， 92) ，性別上並無明顯差異;傳染 的流行季節主要在每年的雨季，約是五月到九月筒，這 是自為此季節有充沛的雨量提供了中問宿主良好的生存 壞境費而大量繁殖的中問宿主又增加人類等動物意外感 染的機會，在報告中，主要的感染途徑是因不良的飲食 習慣與食物處理不當、而遭到第三期幼姦污染的食物而 感染雪尤以吃入未煮熟的非洲大蝸牛 (51 ， 75 ， 94) 而造成感染 的比例最多 O

二.負由基與鐵蛋白 (ferritin) 、蛋白激酵素 C(PKC) 、 C-J 仰、 c-戶s 、 c-myc 致癌基因:

近年來有愈來愈多的研究顯示活性氧(

active

oxygen

)和自由基(

free radical

)與許多人類疾病的發

展有關 (98~100) 雖然人體在正常代謝過程中會產生活性 氧與自由基，但當人體細胞因外來物如感染、致癌物或' 藥物的侵入，在體內的代謝過程中也會產生活性氧和自 由基 o 這些自由基會進而攻擊細胞蝶、細胞組成物會同 時也會危害細胞核內暴自物質 O

雖然目前已知氧化傷害(

oxidative damage

)對人體 健康有相當大的影響，但時至今日對於體內如何形成氧

化壓力(

oxidati ve stress

)、氧化如何導致疾病典禮內

防禦作用的情形以及其機轉尚有不清楚之處，仍為目前 研究的重要課題 o 以下就對活性氣與自由基等做簡單介

紹:

氧是維持生命必須的基本物質會而氧化與還原則是 生物體內代謝所必經的反應 O 在大氣中氧是以安定的三

重態氧( 30

₂

)存在，活性氧則是指反應性較三重態氧

分子強之含氧分子。狹義之活性氧包括氧分子在正常的 呼吸作用下所產生之超氧陰離子( O

2

^{• 一)、通氧化氫}

( H

₂

0

₂ )及氮氧自由基 (-OH) ，以及氧分子受到光或 敏感劑激發所形成的草委態氧(

10

₂ )而廣義的活性 氧則包括:其他含氧的高反應性分子;許多活性氧亦屬 於自由基 O 自由基是指含有不成封電子之高能量分子;

自由基可依其未成對電子所在位置而區分成以碳、氧、

氮或硫為中心之自由基 O 一般來說大部分的自由基處於 高不穩定狀態，根易與其他分子發生反應 (101) ⁰

活性氧和自由基會經常由生物性和環境性過程形 成 9 並引起連鎖反應而形成更多的自由基 O 在體內正常 使用氧的狀態下，如呼吸作用及一些細胞間接的免疫功 能會經常性的形成自由基 o 在發炎或出血時亦會產生過

量的自由基;此外事一些藥 fTlj 與麻醉齊^{I} 在體內亦會皮生}

自由基 O

在好氧性下會生物體主要是經由兩稅途徑產生自由 基和活性氧:

( 1

)偶發性產生會生物體在正常的好氧性呼吸作用

下，氧氣(

02 )自拉線體電子傳遞鏈、微拉體，

細胞色素

P-450

或其他系統?經由連續步驟接 受四個電子及四個氫離子而還原成水 ^{D 在此過} 程中?經由電子轉移會依序產生起氧陰離子

( _O 2

^{←)、過氧化氫(日}

²⁰ 2

^{)和氫氧自由基}

( 'OH) (Figure 2

)在一些偶發的狀態下會

這些中問產物會從電子傳遞鍵中游離出來會對 細胞分子造成傷害 G 而一些化合物也會直接與

O

2

^{進行自氧化反應而形成 O}

2

^{e- 0 此外，一些較}

複雜的生化合成過程中亦會產生其他自由

基 O

(

2) 需求性合成，生物體計畫性的產生活性氧以作 為有利用目的之典型範倒是活化白血球以產 生 O

2 ^-

^{一、 HOCl 與日}

2

⁰

2

^{'此種特性對於白血球}

在殺死細菌和真菌上扮演相當重要的角色 ^O 證 據顯示除了白血球之外?體內其他型態的細胞

如淋巴細胞、纖維細胞(1

^{02)和血管內皮細胞(l00)}

亦會產生 O

2

^{e - 0 O}

2

←可能提供了數種生物功能 如調節細胞問訊號和細胞生長 o

由上述途徑產生之活性氧與自由基會經由連鎖反應 而產生更多的自由基;在正常狀態下鼠類的每個細胞每

天約消耗 10 12 個氧分子，其中大部分皆被逮原成水，但

約有 2%是以部份還原狀態下存在會亦即每個細胞每天

約產生 2xl0

^{10 個}

02

^{e 一和}

^H 2 ⁰ 2 ⁽¹

⁰³⁾ 0 且當生物體受到疾病

的侵襲時會所產生的活性氧數目會更多。

就環境中之活性氣與自由惡的方向來看書 1哀境中自 由基的主要來源包括離子輻射、空氣汙染、抽菸和暴露 於化學物質等 O 另外一些治療用築物在人體代謝時同樣

也會產生自由基 o

此外?值得注意的是金屬離子亦可催化氧分子使其 成為起氧陰離子(包←)或進一步地形成單重態氧

( 10

_{2 )} ，而促使生物體進行氧化作用 O

。

岫 e /1 M n +

+ O

2

•

^{M(n+l) +}

⁺

⁰

²

^{8 一，}_+H十\注

H0

₂⁸

活性氧手口自由基對生物體的許多傷害是始於其與金

屬反應所致

^O 如人體的鐵是以與蛋白質結合的狀憨下存 在，然而超氧陰離子會攻擊蛋白質 ferritin 使其釋放出 鐵，並還原為二二價鐵離子:

。2@一+ Ferritin岫Fe

³

+ → O 2 + Ferritin + Fe

²⁺

其他形式去。血紅索中的鐵背心@一之攻擊雖較具抵抗 性，性會受 H

2

⁰

2

攻擊破壞血紅蛋白而釋放出鐵 ^o

所生成

自由態的亞鐵離子若與 H

2

⁰

2

^反應?只lJ 會形成共高反應性 的 .OH ，繼而攻擊生體分子:

Fe

²+

+ H

₂

0

₂

• ^Fe

³⁺

^{+ OH- + -0日}

正常狀憨下生物體所產生的自由基和對抗這些自由 基的抗氧化系統會達成平衡狀態 O 然而此稜平衡會因疾 病或營養不良而受到破壞，如自由基額外的負擔或是抗 氧化劑保護作用的缺乏都會改變此種平衡 O 此種氧化平

衡的破壞可能導致許多疾病的形成。

事實上，人體內的抗氧化劑和促氧化劑的平衡通常

輕微的偏向後者 O 人體內的氧化傷害會不斷的形成?會 隨著年齡的增加而累積 O 體內雖然也有一些修復系統用 來對付這些傷害?但由於活性氧具有有孟的代謝角色?

因此並不會被百分之育的清除掉 O 無論如何?當活性氧 的產生增加或總抗氧化劑的防禦降低?將會導致所謂的，

氧化壓力(

oxidative stress

)產生 O

氧化壓力可以經由數種方式形成，總之，氧化壓力 的產生通常是因為產生過量的活性氧所致 D 疾病、外傷、

毒素和其他因素引起的組織傷害通常會導致活性氧形成 的增加與氧化壓力的加強 O

Fe²+ 也會與原本存在於細胞膜上的脂質反應?而起始

膜上的磷脂質氧化 (Figure 3)

⁰

Salonen 等( ] 992 年)

(l

04)

證實高鐵含量為心臟疾病的危害民子之一。而針對肺部 患有小細胞瘤(

carcinoma

)病人的研究亦顯示會血清 中 ferri tin 含量較低的病人其存活期顯著長於其他病人 (105); 在其他研究中也發現鐵的累積量與癌症的危害有關 (106); 因此推論活性氧和自由基與鐵的反應可能走過量鐵

導致疾病形成之部份原因 O

在氧化壓力對生物體分子造成的氧化傷害方面?當 人體暴露於活性氧與自由基下，在細胞內和細胞外的主 要組成成份中，蛋白質、酵素、脂質、 DNA 和 RNA 是 活性氧與自由基攻擊的主要目標;就蛋白質所造成的傷 害方面來看:

蛋白質在氧化狀態下其按基酸殘基會受到多種的氧 化修飾 ，如蛋白質 carbonyls 的形成 o 而許多活性氧也

可以氧化蛋白質上的心 H 暴，使得許多重要的酵素不能 活化。由於蛋白質經常會結合過渡金屬離子，因而在特

定位置上形成 'OH ，使蛋白質成為攻擊目標 (107);Nelizil

等( 1993 年) (l 08)證實蛋白質在數種氧化狀態下也會進

行連鎖氧化反應，而導致細胞中自由基的產生增加數倍

之多?並造成細胞的傷害甚至導致細胞死亡;可見自含 氧自由基所造成氧化壓力不平衡?對生物體細胞和分子

的傷害與許多疾病有關 O

當氧化壓力太過劇烈，防禦系統無法抵抗或被消耗 時，會導致細胞致命的傷害 O 氧化壓力與許多人類疾病 有關乎當抗氧化防禦系統無法勝任或讓步時 9 鐵會自平 時儲存於組織之 ferritin 釋放出來雪這些鐵會與超氣陰離

子(

superoxide

ra社 ical )進行氧化還原循環，而誘發路

質過氧化;脂質過氧化進行時其連鎖反應會遍布細胞 膜。事實上氧化壓力是大部分疾病的第二種表徵會為疾 病導致的一個結果?故可在此用來判別細胞或是生物體 是否有產生疾病的表徵 O

且白血球在慢性發炎的部位產生過葷的 H

2

⁰

2 、。

^2@一

及其他自由基產物，會導致細胞或組織劇烈的傷害 ^o 組 織傷害會將金屬離子自其在細胞中的儲存位置釋出，而 導致^{.0日的產生 O 當過量形成} 0

2

^{0一時，會使少量其催化}

性的鐵自儲存蛋白質中移出

， H

²

0

^{2 也會使} heme ^蛋白質

分解而釋出自由態的鐵 O

當氧化平衡傾向氧化狀態的一邊時，對刺激細胞分 裂是一個有效的指標(1⁰⁹⁾

。因此喪失了良好的氧化平衡可

能導致細胞轉化為不可控制的複製?甚至是癌症的形成

(1

10)

，以下就對活性氧與自由基之致癌作用至製作簡單介

紹:

( 1

^{)所生成的物質，如}

H 2 ⁰ 2 ^{'屬於腫瘤促進劑中}

的一種 ^o

( 2)

傷害生物艘中的大分子(1¹¹⁾⁰

( 3

^{)促使癌細胞轉移(1 12) 0}

(

4) ^{經活化蛋白質激酵素(}

protein kinase ) ( 5

)活化與生長及分化相闋的基因 ^O

(

6) 影響細胞內及細胞闊的交流作用 ^O

(

7) 誘導致為基囡之活化和抑癌基因之不活化 O

Protein kinase C

(PKC) ^是

1977

^{年首先由日本學者}

Nishizuka 等人事從牛的小腦所發現其於 protcin

kinasc ^

的 protein

kinase(

113) ，比後即受到廣泛地重視與研究，因 而得知 PKC 是一種鈣和磷脂依賴的蛋白諾夫酵素 (114)9 幾 乎存在於所有的器官和組織中?由不同組織中所得到的 PKC 均有類似的 kinetic 及催化特性 PKC 是由肌醇磷 脂(

inositol phospho 1i pid

)所分解而來;在穿透細胞膜 的訊息傳遞系統上扮演一個相當重要的角色(1 15 ， 116) ，比 酵素的活化需要細胞膜的磷脂和 Diacylglycerol

(DAG)

(117,118) ，當細胞受到外界刺激時，外來物與膜上相關接

受器作用後，經由受體的活化可進而活化 phospholipase

C

(PLC ，又稱 polyphosphoinositol

phosphodiesterase ) ,

可將細胞膜上的肌醇磷路(

inositol phospholipid

)分 解會產生第二訊息傳遞物(

second messengers ) di- acylglycerol

(DAG) 和 inositol 1 ， 4 ， 5 刊riphosphates

( IP

_{3 )} DAG 是一種與細胞內傳遞訊息有關的物質 (4)

因此當時認、為 PKC 可能與細胞內傳遞訊息(

signal

transduction

)的作用有闕，當 DAG 和 PKC 結合，能除

去調節最 domain 對此酵素的抑制效果?此論點經白發現 血小板所釋放的 serotonin 可被 PKC 增強而得到證實

(119); IP

3 溶解於細胞質促使儲存的鈣離子由

endoplasmic

reticulum 或 sarcoplasmic reticulum 中釋放而 增加細胞中的鈣離子濃度?親脂性的 DAG 則留在膜上，

在此時細胞質內的 protein

kinase

C 會移動到細胞膜上與

DAG

、鈣、磷脂質形成複合體(1 15 ， 116 ， 120) 會當 PKC 轉位 到膜上時會造成細胞內特殊蛋白質?例如 p80/87 kDa 、 68 kDa 或 Marcks 蛋白等的磷酸化而引起訊息傳

遞(1 21) 0

而當 PKC 引發了與細胞開始進入分裂週期有密切關 係的原致癌基閱(

proto-oncogenes)

c-fos 、 c-Jun 的 表現，所產生的 Jun-Fos

complex (AP-l

)便能促動多 種暴民的轉譯作用(

transcription )

(1 22) ，而帶動整個細 胞進入活耀狀態?使細胞產生增殖(

proliferation

)和分

化(

diffcrcnti-ation ) (123)

0 因此 PKC 被認為有促進細胞 增殖、分化作用、基因表現和腫瘤催化作用 (i24)o

截至目前我們驚 PKC 的了解 9 尚可歸納出至少約有 12 種的異構體(

isoforms)

(白、仰、 ßII 、 Y 、 8 、 ε 、

G

、 η 、 8 、 1 、 λ 與 μ) (119 ， 125~129) ，而各種異構體在細 胞內負責不同訊息的傳遞工作，也具有不同調控的基因 表現和細胞增麓的能力(1 30~142) 0 而依照參與 PKC 活化所

需的輔扇子(

cofactor

)的不同，可將其構體區分為三 類 (1 凹， 125~129 ， 133~135) .第一類為鈣離子依賴性( Ca²+一

dependent

)的其構體會如白、帥、 ßII 和 y ，稱為 cPKCs

( conventionalPKCs)

，此類型的 PKC 含有 4 個 con- served 區域(

C 1

^,....,

C4

)及 5 個 variable 區域， C

1

^區域為

membrane岫binding 區域， C 2

^和

^Ca

²

^{+ 的敏感度有關， C 3}

為催化區域?而 C

4

則能幫助辨識需磷駿化的受質;第二

類因缺乏

C 2 ^區域

^P

^{為不需要鈣離子 ( Ca}

^2十一

independent )

參與即可被 phosphatidylserine 、 diacylglycerol 及 phorbol ester 等活化反應的異構體會如 8 、 ε 、 η 、 6 與 μ ，被稱 為 nPKCs

(novel PKCs

)第三類為不需要鈣離子

( Ca

²

七 independent )及磷脂質( diacylglycerol 或

phosphatidylserine

)參與活化反應的異構體?即具有非

典型的活化特性?如巴、 1 與 λ ，稱為 aPKCs (由此稱為

atypical PKCs)

，只具有 cysteine間rich

zÎne finger-like

motif ，因此只受到 phosphatidylserine 的活化，而不會受

到 diacylglycerol 、 phorbol ester 或 Ca

²

+ 的影響 O

在細胞訊息傳遞中， PKC 具有調節基因表現及細 胞增援等的作用?而不同的異構體問由於結構的不同，

其酵素特性、活化方式及所表現出來的生理功能使有所

不同(1 36~138) ⁰

而-，E.. PKC 被活化，將進一步促使細胞內的許多蛋

白質磷酸化，如 histone (1 39) 、 EGF receptor(l 40) 、 insulin

receptor(141) 、 transferrin receptor(1 42) 、轉譯作用二號起始

因子( el f2 ) (1 43) 、 ribosomal protein S6 (1 44).. 等，而引發

一連串細胞內的訊息傳遞途經;在一些細胞外的訊息如 生長因子(

growth factors

)、荷商業(

hormoncs

)和 神經傳導物質(

neurotransmitters

)的傳遞穿過細胞膜

的反應中型 PKC 扮演著一個重要的角色(1 4刊物)。

PKC 的結構包括有二個調節區(

domain

)分子 量約 50 kDa 具 protein

kinase

活性區及分子量約 30，...，35 kDa 的調節盔，調節區有結合位置，可與 DAG 、鈣、磷 脂質結合會由以上的這些發現都顯示 PKC 和 metastatic potentical 有關 o

protein kinase C 與 Ca

²

+ 可共同增強激發 H 2 ⁰ 2

^的生

成

^{(1 47) 另外，}

protein kinase

C 經過磷酸化的活化之後 促使非活化型的 NADPH oxidase 轉變成活化型的

NADPH oxidase(148)

，以進行(1 49)

.

NADPlI oxìdasc

。2

+ NADPH • ^.0

2 -

+ H+ +NADP+

SOD

2

_{. 02}

-+

2 日+→ H

2

⁰

2 + O

₂

進而使得 H

2

⁰

2

^{增加 o H}

2

⁰

2

^{在人體被發現會造成}

DNA 的損傷(1 50) 在 Rochat (1 51-155) 等學者的研究中顯示 H

2

⁰

2

^{除了如前述會被} PKC 所引發而增加外;在 H

2

⁰

2

^增

加的情況之下，日20

2

也會反過來刺激 PKC 的活性而促

進訊息傳遞;另外， Rao 等(1 56) 則在 vascular smooth muscle cell ág

model 中發 2尼日20

2

^{會經由刺激 PKC 的活化}

而刺激 c-jun

(proto-oncogene

，原致癌基因的一種)進 行 transcription ;而 Rao 也在另一項研究中(1 57)指出，

H

2

⁰

2

^{也會經由刺激} PKC 的活化而刺激 c-fos 的表現 O 就 PKC 、 H

2

⁰

2 ^與

proto 帽 oncogene (如 c-Jun 、 c- foωS 與 C心-mηlYC 等等)的關係而言; protω0-叫lC∞ogene 是才指首存

在於正常細胞的一段基因'平時有其正常的生理功能，

這些功能不外乎與細胞的生長均分化有關，這些致癌基 因對一個正常細胞的生長與分化是不可或缺的?然而當

細胞受到外芥科激後?例如，史.flj 放射線 }Ht 刻、或者暴露 於某些化學物質下雪這些致癌基因本身結構會發生變 化，去。點突變、出現不正常的調節元素(

regulatory element

^{)、失去抑癌基因(}

suppressor gene

^{)的功能、}

染色體移位或者是基因本身過度表現(即基因放大，

gene amplification

)會均可使原致痞基因 proto 用 oncogene 在很短的時間內被激發而大量表現故又稱為早期反應基

因(1 58 ， 159) 基因過度活化的結果很可能會使得細胞增 生、生長失控或變形?亦有可能自病毒的感染而使得某 段基因被插入、漏失導致生成融合蛋白質 9 而參與癌症

的形成 (160) ⁰

1987 年 Maki (l 61) 在小雞白發性肉瘤細胞中分離出

一種反轉錄病毒害其中含有一段具有轉形能力的基函，

命名為 V-J 帥，其蛋白皮物的 C 端與酵母菌的轉錄因子 GCN4 的 DNA 結合區具有相當高的相似性，而在正常細 胞中也存在著一段相對應的 c-Jun 原致癌基因?它是一個

ear1 y response gene

，在過到促細胞分裂劑(

mitogen )

刺激的細胞生長時 ， c-Jun 就會被活化 9 其基因產物為構 成轉錄因子 AP 心(

Activator protein 1

)的其中成員，

執行細胞內的轉錄作用 (162) ⁰

V-fos 最早是從鼠類的反轉錄病毒 osteosarcoma V 1fUS 中所分離出來的，同樣地，在人體的正常細胞中亦 有相對應的 c-fos 原致癌基因具有調節轉錄的功能(1 63) ⁰ c-fos 基因的表現是細胞受刺激後早期的反應 ， c-fos 基 茵的表現受其上游三個調節區的控制，此三個霞域分別 為 (1)

TATA box

^,

(2)

c-fos 基本表現控制區，其包含一 段受 cAMP 調控的區域( CRE) 與一段 GC rich 的區域，

(3) 加強表現霞，此區內含有一段對稱序 7¹J

DSE

，又稱

TRE

，主要受到過氧化物、生長因子、 TPA... 等刺激而

表現(1 64) ⁰

根據以往研究推測(l 56)H

2

ü2 可能是經 PLA2- dependent 的 arachidonic acid 釋出及經由 li

poxygenase-

cytochrome p450

monooxygenase 系統的傳遞而使得 c-Jun mRNA 的表現增加?在這種傳遞之問， PKC 可能也參與 其中，而在 H

2

⁰

2 ^的刺激下

， c-fos 表現增加的機轉可能 也與 c-Jun 的路徑相閱(1 57) ⁰

myc 基因是一段含有1. 6 kb 的核甘酸序列 ，

c-myc

是種細胞核蛋白雪屬轉錄因子(

transcriptional factor )

, 不正常大量表現 c-myc 蛋白會導致細胞癌化 (1 65) ，

c-myc

的表現與細胞凋亡(

apopto'sis

)有關?在某些情況下四 c-myc 大量表現或 c-myc 表現不足而誘導細胞凋亡的現家

都有被報告過 (166 ， 167) 。

而最初 c-myc 是由 Duesbere 和 Mellon 兩位學者於 1977 年在 Avian^,

Myelocytomatosis virus MC

29 的基因庫

內首先發現 o c-仰.

ma

、 leukemia 和 sarc∞omaωs '並可使 fibroblast 發生變形 o 在 1982 年左右?同時有許多的研究發現在正常禽類和某

些哺乳類(包括人類)細胞中的 DNA 也有一段類似於

Avian Myelocytomatosis Virus MC

29 上的 myc 基因順序 (1 6 仰的) ，由於它的基民順序與上述病毒基因庫上的、基渴 順序有很大的相容性(

homolog

)而將之命名為 c-

myc

原致主義基濁。

大約在 1982 ，...， 1983 年筒，許多的研究均證實這種

c-

myc 原致癌基因在某些情況下可以被活化而具有致癌

性(1 70 ， 171) 在 1983 年， Land 等人更設實在 in vitro 的情

況下，

viral

c用 myc 原致癌基因可以將 primary

rat

ce l1 s 變 成一種細胞株，此種細胞株能持續不斷地分裂，也由於 myc 基目的這種特性，因而引起大家研究的興趣 o

有許多的證據顯示，在 c-myc 基因與細胞的分化 與增藏有密切關連 O 對於某些處於靜止態的細胞

( quiescent cell)

，其 c-myc 基因的表現微弱;但是當 給予某些 mitogen 刺激後，在 1 ，...，2 小時內即可見 c-myc RNA 有明顯增強的表現，因此更證實 c-myc 基因可能與

細胞生長的管制及調控有發切的關連性( 1 叫 O

材持與方法

一、實驗動物感染模式

1 .廣東住血線蟲第一期幼蟲之收集

由實驗室中撿取巳感染廣東住血緣蟲六週後 的大白鼠(

Wistar strain

)糞便，以收集廣東住 血緣蟲的第一期幼蟲 O 其方法如下所示:

將大白鼠糞便置於內含沾濕雙層紗布之漏斗

中型以 0.85

%

NaCl 之生理食鹽水浸泡，之後每 隔 20 分鐘，漏去已浸泡過鼠糞之生理食躍水，再 補充生理食盤水以浸泡之，如此重複約 20 次，再 以漓管吸取溶液下層之沉澱物，還於離心機內以 每分鍾的 00 轉的速度，離心 5 分鐘，之後將上 清液丟棄，再以滴管吸取下層沉澱物，再次離心，

使內含有廣東住血緣姦第一期幼蟲的蟲體數目密 度更高;將所得下層沈澱物收集於培養且中，用

以感染 Biomphalaria

glabrata ( Puerto Rican strain )

2.Biomphalaria glabrata 之人工感染

丹等待感染的 Biomphalaria

glabrata ( Puerto

Rican strain

)自水中撈出，吸去螺體多餘水份，

置於內含有廣東住血緣品第一期幼蟲的培揍血

中，於室溫下靜置隔夜，使 Biomphalaria

glabrata

自然吸入廣東住血線蟲的第一期幼蟲 O

3. 廣東住血綠豆區第三期幼蟲之收集

經實驗室人工感染廣東住血線蟲第一期幼蟲 之 Biomphalaria glabra 旬，經感染三通後 9 即可

收集具感染性的第三期幼蟲;共收集方法如下:

將已感染廣東住血緣蟲之 Biomphalaria

glabrata 破碎?再加入比例為 1 30 的人工胃蛋

白酵素消化液(因;另化液具酵素活性會故至使用 前 1 小時方可泡製)於 1000 ml 燒杯、置入磁性 攪拌子於溶液內，燒杯口封上銘箔紙，並以磁性 攪拌機於衍。C 之恆溫箱中均勻攪拌 2 小時，取出 用雙層紗布濾去雜質，加入生理食鹽水稀釋溶液 並靜置，之後每隔 30 分鐘倒去約一半的上清液，

再加入生理食鹽水反覆清洗至上層溶液完全清澈 為止;使用滴管吸取溶液下層之沉澱物，直於玻 璃器旦旦中?盡於解剖顯微鏡下?觀察並吸取寄生 於螺內的廣東住血線姦第三期幼蟲 O

*人工胃蛋白酵索消化液:

8 ml Hcl

7 g pepsin (1 2500 , Sigma)

加 distilled water 至 1000

ml

4. 實驗動物

ICR ( Institute for Cancer Research

)品系小

鼠(

mouse)

，購島國科會動物中心，為三通齡

雄性小鼠，體重為此 .84 士1. 27 公克 O 使用前至少 飼養於動物房一退。在動物房中以飼料與蒸餾水

不限制飲用，並維持在 12 小時亮及 12 小時暗的

循環中 O

5. 實驗動物分組

分成實驗表且與對照組兩種會封照組細分為陰 性與陽性對照組;實驗組再細分為三豆豆 9 分別用。

三種藥物加以處理，每組為 30 隻小鼠害每隻小鼠 分別感染 40 隻廣東住血緣蟲第三期幼蟲;如下 11j 所示:

a. 陰性對照系且 :不感染廣東住血緣品第三期 幼蟲、不投藥處理 O

b. 陽性對照組 :感染廣東住血線蟲第三期幼 蟲、不投藥處理 O

C. 實驗組(

1

)感染廣東住血緣品第三期幼 品、投予 milbemycin D 之驅 蟲藥(

Figure 4 )

d. 實驗組(

II

)感染廣東住血線蟲第三期幼 蟲、投予 albendazole 之驅熹 藥(

Figure 5 )

e. 實驗組 (III )感染廣東住血線蟲第三期幼 蟲、投予 VD-99 岫 1 1 之驅蟲 槃(

Figure 6 )

分別於感染後第 5 ，

25 ,

42 天解剖，每次每組解剖 10 隻小鼠 O

6. 動物感染模式

究照組與實驗組之小鼠，在感染前 12 小時均 給予禁水、禁食;除陰性對照組外，每隻小鼠以

口育管分別灌入含有的隻廣東住血緣蟲第三期 幼蟲之生理食鹽水;陰性對照組則每隻小鼠以口

胃管餵食等量之生理食鹽水，於感染後 12 小時再 恢復其供水、供食 O

7. 藥物處理

感染後第五天開始進行投榮?實驗組之小鼠 分別以口胃管餵食內含 mi

1 bemycin D

、 VD 個 99-11 (以上二種為 GABA 類藥物)、 albendazole 之生理

食鹽水;其投藥劑量與天數分述於下:

a. 實驗組 (1 )連續投子劑量為 5mg/kg 之

milbemycin

D 十夭 O

b. 實驗組(

II

)連續投予劑量為 25mg/旬之 albendazole 七天 o

c. 實驗組 (III )連續投予劑量為 O.8mg/旬之

VDθ 弘 1 1 三天 o

二、治療效果評估

在細分為傳統療效評估與生化詐估二大類:

1.傳統療效評估

可分為下歹IJ 五項:

a. 小鼠體重變化(1 73) •

感染後每 10 隻小鼠為一組會每二天秤量小

鼠體重 O

b. 小鼠腦重變化 (173 ， 174) •

感染後第 25 天解告I} 每組小鼠 10 隻，經剝

除腦殼後，秤量小鼠腦重。

c. 腦內蟲體回收:

感染後第 25 天解剖每組小鼠 10 隻 9 取鼠 月當於培養血內 9 置於解剖顯微鏡下計算小 鼠腦膜上存活之品體數目;再以鴿子撕碎

鼠腦，計算腦內存活之蟲體數目 O

d. 血中白血球與嗜伊紅性白血球計數:

於感染前及感染後 7 、 14 、 21 、 25 天分 別測量每組小鼠血液中白血球(

total

leukoc)忱 s )與嗜伊紅性白血球(

eosino- phil

)之數目;其計數方式(1 75) 如下:

使用材料 1) 血球計數器( hemocyto 間

meter )

，令 improved

Neubauer counting

chamber 計算盤、白

血球專用吸管 o

2) 顯微鏡

3) Turk solution

冰躇酸 (glacial

acetic acid)2 ml

與 1% 龍膽紫 (gentian

violet)

溶液 1

ml

'加 distilled

water

至 100

ml

，此稀釋液能破壞紅 血球會為除去酵母菌及徽葛等 干擾物質?使用前應加以通 濾 O

操作步驟 1) 用白血球吸管吸取經斷頭小 鼠血液至 0.5 刻度，擦淨沾於 玻漓管外之血液，迅速垂直 插入盛有 Turk solution 之瓶

中會吸取稀釋液至 1 1 刻度(避 免氣泡產生)此時稀釋倍數 為 20 倍 O

2) 白血球吸管兩端以拇指及中 才言自定會依橫軸方向予以震盪

而使之混合均勻，至少需震邊 三分鐘 O

3) 先吹去吸管前消 2~3 滴(約至 1. 0 刻度)捨棄不用(因此部 份液體為不合血液之稀釋液

) ，挨著拭乾吸管之尖端，然 後將吸管之尖端觸及蓋玻片及 計算盤中閻部份之交接處;吸 管內液體因毛細管之吸引作用 而進入蓋攻片下。進入蓋攻片 下之紅血球稀薄液不宜過多，

應使稀薄液不至遍及凹溝，否 則攻片易浮起，由此計得之紅

血球會過多;亦不能有氣池，

如所製得之玻片有以上不良情 形發生 9 則應全作 O

4) 略待數分鐘待血球穩定後 9 即 可用顯微鏡低倍 (x150 )觀察，

並計數計算室四角之四大格內 之血球數 O

5) 計數原則以左、上線接觸之血 球一併納入計數會而在右、下 線接觸之血球則不計會如此求 得之平均誤差可達最小 O

6) 因四個區域面積各為 1 mm

² ,

將此 4 mm

²

區域數得之白血球

e. 腦部病理變化:

a) 病理切片:

數目相加，以

4

^{除之事可得每}

mm

²

面積白血球之平均值;囡

計算盤之深度為 0.1

mm

'故需 乘 10; 白血球稀釋倍數為 1

20

'故應再采 20 0 即四大格 白血球數乘以 50 即可得每 1

mm

² 小鼠血液之白血球及嗜伊

紅性白血球數。

感染後第 25 天解剖小鼠 9 取出鼠月造型製 成病理切片，以觀察發炎(

inflammation

)、

浸潤(

infiltration

)之情形;其切片製作程

序如下:

1.昆定(

fìxation )

將鼠絡組織保存於中性福馬林( 10

0/

0

neutral buffered formalin

)固定 24 小時

以上，將組織切成 0.5 cm

²

，置於包埋金

中?然後於連續的水流中沖洗 2 小時會以 除去福馬林?避免影響切片的製作 O

2. 脫水(

dehydration )

將已去除福馬林的組織取出書用吸水

紙吸取多餘的水份，然後進行下列的脫水 步驟:

1) 70 % 2) 80 0/

⁰

3) 90 % 4) 95 % 5) 95 % 6) 70 0/

0

7) 70 %

3. 澄清(

clearing )

酒精

;琵精 酒精

酒精(

1 )

酒精(

II )

酒精(

1 )

酒精(

II )

20 分鐘 20 分鐘 20 分鐘 20 分鐘 20 分鐘 20 分鐘 20 分鐘

將已完全脫水的組織，浸置於二甲笨

( xylene

)中型直到組織浸至透明 O 因為

酒精與石蠟(

paraffìn

)不互溶 9 所以必 須完全以二甲萃取代組織內的活精成 份，才不至於影響浸潤過程 O 步驟如下:

1) 二甲笨(

1 )

2) 二甲笨(

II )

4. 浸潤(

infìltration )

由於二甲萃與石蠟可以互;容，故先以 二甲笨澄清後，才能使浸潤過程得以完

全?浸潤的目的是為了仗石蠟能完全進入 組織內 O 步驟如下:

1

)二甲求:石蠟(

1

2) 石蠟 ( 1 )

3) 石蠟 (

II )

的石蠟 (

III )

5. 包豆豆 (

embedding )

1

)的 oc 60 分鐘

55

⁰

C

30 分鐘 叮叮 30 分鐘 叮叮 30 分鐘

將已浸潤完成的組織置於樣子中 央書然後於模子中加入融化的石蠟以覆蓋 組織?按著將包土里去還於模子上會再加少 許石蠟使組織固定於包埋臺 O 然後置於一 20 ⁰C 冰箱會使石蠟結晶較細，帶石蠟凝

固後，除去模子?即完成包理 O

6. 連續切片(

serial section )

將包埋臺固定於連續切片機上，調整

刀片角度及距離，先以厚度為 20μm 粗切 至所要觀察的組織面，然後調整厚度為 5

μm 切出連續切片，取下所切出的連續切

片，置於 38 ⁰C 的水中，使其完全伸展，

再將切片置於沾附有蛋白與甘油比例為

1

1 的玻片中央，然後置於 38 ⁰C 的乾 燥台上烘乾 O

7. 染色(

stain )

以紫蘇木岫伊紅(

hematoxy

lin 團eosin

)

染色法，

H&E

stain 方式如下:

1) 二甲萃(

1 )

2) 二甲末(

II ) 3)

100% 酒精(

1 ) 4)

100% 酒精(

II )

6 分鐘 6 分鐘 6 分鐘 3 分鐘

5)

95 0/0 酒精 6 分鐘 6) 的%酒精 6 分鐘

7) 沖水 30 分錐

8) 以紫蘇本溶液染色 10 分鍾 的以酸性酒精辨色至核清楚為止

10) 沖水 30 分鐘

11

)以伊紅 Y 溶液染色 5 分鐘 12)70 0/0 酒精 30 秒

13)

^{80% 酒精 30 秒}

14)

90% 酒精 30 秒

15)

100% 酒精(

1 )

6 分鐘

16)

100% 泊精(

II )

3 分鐘 17) 二甲萃(

1 )

6 分鐘 18) 二甲萃(

II )

6 分鐘 8. 封蓋(

mount )

將封片膠滴於己染色的組織切片上，

以的。慢慢蓋上蓋玻片以避免氣泡產生會 待封片膠凝自後即完成封片 O

的兔疫組織化學染色法觀察 ferritin

感染後第 25 天解吾IJ 小鼠，取出鼠月番，製 成病理切片，以便觀察 ferritin 在腦內的表現 量是否增加之情形，並觀察 ferritin 存在鼠腦 之位置;其切片製作程序如下:

1.製作 5μm)享皮之組織石蠟切片 O

2. 將包埋在蠟中的組織切片置入已預熱至 56 ⁰ C 的 烘箱中月iL 蠟 O

3. 將已加熱的切片依照順序移至純二甲萃進行脫

蠟?再浸入絕對泊精，

95

(%酒精中各五分鐘以進 行水化 O

4. 將切片以二次水 ify i先十分鐘。

5. 將切片移至 Tris

buffer ( 0.05M

,

pH 7.8 NaCl 0.15M

，再加入 1

ml Triton X-1 0011 OOOml

)中五

分鐘 O

6. 將 citrite buffer 以微波爐加熱至沸騰 O

7. 將已月兒，蠟完全的切片移至煮沸的 citrite

buffer

,

再繼續加熱五分鐘 O 8. 待玻片降溫至室溫 o

9. 將玻片取出後以二二次水沖洗 O 10. 用 Tris buffer 沖洗五分鐘 O

1 1.用 3% 的日20

2

^{沖洗五至十分鐘 O}

12. 將攻片取出後以二次水沖洗 O 13. 用 Tris buffer 沖洗五分鐘 o

14. 在玻片上加入第一次抗體(

rabbit anti-rat ferritin

anti 圍 serum )反應 20 至 40 分鐘 O 15. 將攻片取出後以二次水沖洗 D

16. 用 Tris buffer 沖洗五分鐘 O

17. 在玻片上加入第二次抗體(

horseradish peroxidase conjugated goat anti-rabbit Ig G )

反應 30 分鐘。

18. 將玻片取出後以二次水沖洗 D 19. 用 Tris buffer 沖洗五分鐘 o

20. 在玻片上加入 Biotin ligand 反應 30 分鐘 O 2 1.將波片取出後以二次水沖洗 O

22. 用 Tris buffer 沖洗五分鐘 o

23. 加入 DAB 豆色劑在室溫下反應五分鐘 D 24. 以二次水清洗五分鐘 o

25. 加入 Hematoxy

1

in 以染背景，但染色的時間不能 超過一分鐘。

26. 以二次水清洗五分鐘 O

27. 將已染色的攻片還於 95% 的泊村。

28. 將玻片置於絕對酒精鐘五分鐘以脫水 O 29. 將玻片;為上 xylene ⁰

30. 用封片繆來封片 O

2. 生化評估

a. 蛋白質電泳:

詛目 1. 腦部組織萃取:

各組 ICR 小鼠?每組 10 隻在伯利編號後，

經斷頭、剖腦、秤重後，將每隻鼠腦分別各自離 心萃取;即置入相當於其堂堂比五倍體積比例之 均質液內，在冰浴中切碎腦組織，用均質機上下 研磨約 20 下?將此均質液置於冷凍離心機中，

在 4⁰C 下，以 600 g 轉遠離心 10 分鐘會離心後所 得的下層沈澱物即為細胞核(

nucleus

^)萃取物;

取出上清液以 4 ⁰C ，以 15 ， 000 g 轉遠離心 30 分 鐘 9 所得之下層沈澱物為粒線體

( mitochondria

)，在取離心後之上清液以 4 呵，

100 , 000

g 轉數離心 60 分鐘，可符其下層沈澱物 為微粒體(

microsome)

，剩下之上層懸浮液即 為細胞質(

cytosol

)經以上三次離心所得之細 胞核、拉線體、微粒體及細胞質萃取物，皆員于存

於由 70 ⁰C 冰箱中 O

*均質液:

0.242

皂 Tris.幽幽幽幽幽幽廿幽

67.24 mg EDTA (2 mM ) 19 . mg EGTA (0.5 mM ) 10 ml glycerol ( 10(w/

_v

)%) 1 1. 29 g sucrose (0.33M)

349μl 令mercaptoethenol

( 50 mM ) 34.8 mg PMSF (2 mM )

2.5 . mg Leupeptin

(25μg/ml

)

加 distilled water 至 100

ml

PMSF 、 Leupeptin 為酵素抑制劑，以防止所 要抽取之蛋白質被酵素所分解 O

如2. 蛋白質濃度測定 (176):

其原理為利用蛋白質可與 coomassie

billiant

blue

G 間 250 形成藍色複合物，當藍色愈深表是蛋

白質含章愈高 D 測試的方法如下:

取 10 /-l l 之小鼠腦部萃取液，加入所購買的 蛋白質定量試劑組(

protein assay dye , Bio-Rad )

200 抖，補蒸餾水至 1

ml

，於室溫下反應 10 分 鐘後，在波長 595 nm 條件下偵測吸光值，以 BSA

( bovin serum albumin

)為標準液以換算各萃取 液的蛋白質濃度 O

再取已定量的 40μg 蛋白質萃取液 9 加入等

體積的 protein loadinεbuffer ，於 100

⁰

C Dri-Bath

機器加熱 5 分鐘使蛋白質變性?迅速置白冰上 5

分鐘，再經 Microcentrifuge 低遠離心後 9 放於冰

上，等待 loading ⁰