八十七種中草藥及半枝蓮成分漢黃芩素

噬細胞264.7 產生 NO 之抑制活性試驗

一、實驗材料

(一) 實驗材料之收集

本實驗材料部分收集自市面上或採集自本省各地，部分蒙瀋陽藥 科大學姚新生教授提供蒐集自大陸各地，共有87 種具有抗發炎、解 熱及鎮痛作用中草藥。台灣蒐集之藥材經本校中國藥學研究所邱年永 技正鑑定及比對藥用植物形態學或以生藥學書籍比對藥材之外部形 態確立其基原，藥材樣本並存本校中國藥學研究所。姚新生教授提供 之藥材經瀋陽藥科大學孫啟時、吳維春教授鑑定之。

本實驗所採用之藥品漢黃芩素（wogonin）、黃芩苷（baicalin）

購自日本松浦藥業株式會社；高山黃芩素（scutellarein）購自法國 Extrasynthese 公司。

(二) 實驗材料之抽提

將中草藥實驗材料洗淨、切片後陰乾成飲片，以50%乙醇室溫浸

在40℃下減壓濃縮至乾，即得實驗材料 50%乙醇粗抽取物。

(三) 檢品之製備^（86）

精確秤取實驗材料乙醇粗抽取物一至二毫克，精秤之材料以每毫克溶 於二十微升DMSO 製成檢品溶液。

(四) 細胞培養^（71）

RAW264.7 細胞為大鼠巨噬細胞樣細胞，以 Abelson leukemia virus 轉化，得自於 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)。培養於 Nutrient Mixture F-12 Ham (Ham’s F12) （Sigma, N4888, 500mL）培養基 [培養基添加 10%非動化胎牛血清 (heat-inactivated fetal bovine serum) (Gibco, Cat. No. 16000-036, 100mL), 1%穀胺醯酸 (L-glutamine) (Sigma, G7513, 20mL), 及 6% kanamycin sulfate (Wako, 117-00341, 1g)], 並置於 37℃ 二氧化碳培養箱中 (5%二氧化碳，95%

潮濕的空氣)。以塑膠培養皿（Falcon, No.1001; Becton Dickinson）培 養細胞，每週繼代二次。

(五) 實驗試藥

Ham’s F-12 細胞培養基、穀胺醯酸購自 Sigma 公司（St. Louis, MO,

RAW264.7 購自於 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)，IFN-γ 購自 Genzyme 公司（Cambrige, MA, USA），LPS (Escherichia coli, O55: B5) 購自 Difco 公司（Detroit, MI, USA），

kanamycin sulfate、sulfanilamide、N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride、phosphoric acid、

3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) 購自Wako Pure Chemical Industries（Osaka, Japan），本實驗應用之化 學藥品及試劑均為最純的商品。

(六) 實驗儀器

倒立顯微鏡：NIKON（TMS Type 104）

CO2培養箱：SANYO CO2 Incubator（5% CO2） 冷凍離心機：HITACHI（himac CF 7D2）

Microplate reader(UV)：BIO-RAD Model 3550 Microplate reader 均質機：TAITEC（Microincubator M-36）

抽液幫浦：日本理化學器材株式會社（NRK, UP2 型）

-30℃凍箱：SANYO（Medicool, MPR-411F）

Pipet-Aid XP（用來吸放細胞）

Eppendorf （Micropipet，微量取樣器）0.1~2.5，50~200，200~1000μL

多次分樣器（吸一次量為2.5mL，每按一次可設定 50~250μL 的量）

二、實驗方法

(一) 一氧化氮測定（NO Assay）^（86-88）

每 200μL（調整細胞濃度 1.2×10⁶個/mL）細胞分注至 96 孔盤

（Sumitomo Bakelite, #8096R, Tokyo）中，37℃、5%二氧化碳培養箱 中培養一小時，加刺激物LPS (Escherichia coli)（100ng/mL，Sigma）、

IFN-γ（0.33ng/mL，Genzyme），並加入樣本 DMSO 溶液 0.4μL，將 96 孔盤置於 37℃二氧化碳培養箱培養 16 小時，取出上清液 100μL (剩 餘細胞留待MTT assay 檢測細胞毒性)，加入 Griess reagent [0.1%

N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride 溶液（1mg/mL，Wako）、

1% sulfanilamide in 5% H₃PO₄溶液] 各 50μL，呈色，十分鐘後以 Microplate Reader (BIO-RAD, Model 3550) 570nm 測吸光度，將亞硝 酸根離子(Nitrite)定量。

(二) 細胞存活率測定（MTT Assay）^（89）

MTT 法是一種檢測哺乳類細胞存活和生長的方法。MTT 是一 種能接受氫原子的黃色染料，化學名為

3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，商品

名是噻唑藍。哺乳類動物活細胞粒腺體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 的MTT 還原為難溶性的藍紫色結晶物（formazam）並沈積在細胞中，

而死細胞則無此功能。DMSO 能溶解細胞中的紫色結晶物，用 ELISA 在570nm 波長處測定其光吸收值，在一定細胞數量範圍內，MTT 結 晶物形成的量與活細胞數量成正比，因此由吸光值可間接反應其活細 胞數量，故可用於檢驗NO 活性抑制藥物給藥後巨噬細胞存活率。

當取完上清液100μL 後，剩餘細胞溶液再加入 25μL MTT 溶液（2 mg/mL），置於 37℃二氧化碳培養箱培養 4 小時，將上清液倒掉，加 入150μL DMSO 將深藍色結晶物（formazan）混和均勻，等待數分鐘 讓結晶物完全溶解，即可以Microplate Reader (BIO-RAD, Model 3550) 570nm 測吸光度。

第二節 半枝蓮及其成分 scutellarein 鎮痛作用之研究