由於巨噬細胞在發炎及宿主對抗細菌或病毒上均扮演重要角色
(98)，在活化的巨噬細胞所釋放的各種媒介物質當中，一氧化氮為巨噬
細胞在抗腫瘤及抗菌作用上能發揮調節或細胞毒素作用的有效分子
之一（99-102），負責巨噬細胞合成一氧化氮的酵素是iNOS，然而平常
iNOS 是不存在的，但在細菌內毒素（LPS）（103、104）和炎症的細胞分 裂素作用下能強力引發iNOS 產生，INF-γ 對 LPS 作用下的巨噬細胞 具有協同作用，能引發更大量iNOS 產生，然而 INF-γ 單獨並不能引 發巨噬細胞產生iNOS (41)，因此本研究採用LPS 與 iINF-γ 共同使用於 誘導巨噬細胞(RAW264.7)產生 NO。在急性或慢性發炎中發現過多的 NO 也可能導致宿主細胞及組織嚴重的損壞（105），在種種發炎疾病中，
例如風濕性關節炎患者體內就發現其巨噬細胞產生過多的一氧化氮
（106）
。據此，假設能抑制巨噬細胞產生一氧化氮的藥物將可能成為一 有效的抗發炎藥物。
因此，本研究篩選八十七種常見的中草藥對LPS 與 IFN-γ 誘導 巨噬細胞（RAW264.7）產生 NO 之抑制率做比較，並以 MTT 試驗檢 測樣本對細胞毒性作用，發現其中15 種具有很好的 NO 抑制活性。
而在這15 種植物中，本研究先選擇在台灣民間習用的抗癌植物半枝 蓮為研究目標；並探討半枝蓮的成分scutellarein、wogonin 和 baicalein
對LPS 與 IFN-γ 誘導巨噬細胞（RAW264.7）產生 NO 之抑制率的影 響，發現scutellarein 對 NO 活性抑制的效果最好，其 IC50為12.7±3.11。
接著，本研究進一步探討半枝蓮50%乙醇粗抽物及其成分 scutellarein 之鎮痛及抗發炎之藥理作用機轉。
首先，疼痛反應之評估可分為化學（醋酸扭體及福馬林舔足）及 機械刺激反應(107)。本研究所使用之疼痛模式為化學刺激之醋酸扭體 及福馬林舔足反應試驗。醋酸扭體反應試驗由1957 年由 Siegmund(62) 使用於測試疼痛反應，其方法是經由醋酸對動物之腹部直接刺激所引 發之疼痛反應，造成其腹部內縮、後腿伸直、身體拉長扭曲之現象。
鴉片類與內生肽類等神經鎮痛物質及固醇類和非固醇類周邊性鎮痛 抗炎物質皆可抑制此扭體反應(65)，可廣泛用於篩選大部分鎮痛物質
(62、66-68)，由本實驗結果得知半枝蓮粗抽物及scutellarein 均可減少由醋
酸所引起疼痛之扭體次數，顯示有鎮痛作用。但由於醋酸扭體模式其 所媒介之機轉以周邊作用較強，但亦有中樞作用，因而無法確認其作 用機轉是經由中樞或周邊而來，所必須進一步以福馬林試驗進行研 究，以確認其真正的鎮痛作用機轉。
福馬林舔足試驗最早由Dubuisson 和 Dennis 於 1977(68)年提出，
此實驗方法利用福馬林造成組織損傷的急性、中性及連續性（tonic）
疼痛來篩選鎮痛藥物的一個有效方法。此一實驗模式經由Shibata
(1989)(69)等研究，其所產生之舔蹠反應呈雙向(biphasic response)作
用，亦即舔足時間具有兩個高峰期，在福馬林注入0～5 分鐘會造成 痛（initial pain）反應而引起小鼠舔足，稱之為前期(early phase)，主 要因直接刺激痛覺接受體造成substance P 或 bradykinin 等致痛物質釋 放；而在20～30 分鐘所表現舔足時間稱之為後期（late phase），主要 是因為福馬林容易引起發炎反應造成化學傳遞物質，如histamine, serotonin, prostaglandin 及 kinin 等有關物質由受損組織細胞中釋出所 引起及脊髓背腳功能性改變(60 、69)。Hunskaar (1987)(71)等人研究報告 指出福馬林試驗對發炎性和非發炎性疼痛之鎮痛藥物評估為一有效 模式。前期為非發炎性疼痛，後期為發炎性疼痛，使用0.5-10%福馬 林皆可誘導出前期及後期舔足反應，而 5％福馬林濃度可誘導最大前 期和後期舔足反應(108)。故本研究以5％福馬林誘導疼痛反應。本實驗 結果發現半枝蓮粗抽物及scutellarein 對減少小鼠福馬林誘發前期之 舔足反應時間沒有明顯影響。但可明顯減少小鼠福馬林誘發後期之舔 足反應時間。顯示其對發炎性疼痛有明顯鎮痛作用，而對非發炎性疼 痛無明顯作用。根據1989 年 Shibata 等人研究報告指出，麻醉性鎮痛 劑如morphine 對前期及後期都有抑制作用，但 NSAID 只對後期有抑 制作用(69 、109)。半枝蓮粗抽物及sutellarein 之鎮痛作用可能與周邊作 用有關，但其確實之鎮痛機轉與何種發炎介質釋放有關，則有待進一
步探討。
其次，用於評估抗炎藥之許多篩選方法中，常以注射致炎劑後能 產生抑制浮腫之能力為先決條件，最常使用之致炎物包括λ-角叉菜膠
（λ-carrageenan）、histamine、右旋醣苷（dextrose）、白蛋白（albumin）、
酵母（yeast）等，其中又以 λ-carrageenan 最常用，1962 年由 Winter 等 人（67）使用0.05 ml，1﹪λ-carrageenan 注射大鼠足蹠，結果引發足蹠腫 脹，並於注射後連續測量3 小時後浮腫體積；1963 年以此分析
indomethacin 之抗炎作用，遂成為一種普遍研究抗炎活性之實驗；之 後，1964 年 Niemegeers 等人支持實驗模式，用其作臨床抗風濕活性藥 物之事先篩選；與其它誘發水腫之致炎劑相較，其優點是在發炎過程中 為局部刺激引起和抗原反應無關，且在毒性劑量下反應性佳，無全身性 作用，再現性高（110）。研究結果發現，腹腔給予半枝蓮粗抽物及
scutellarein 可明顯降低 λ-carrageenan 誘導的急性足蹠浮腫，顯示半枝 蓮粗抽物和scutellarein 具有抗炎作用。
事實上，λ-carrageenan 注入足蹠所引起的浮腫是雙向性反應（31）， 注射λ-carrageenan 後會在不同時間釋放出不同物質而引起發炎。第一 階段，即0-1.5 小時或 20 分至 1 小時內游離出 histamine、serotonin、
PAF 等物質(111)；第二階段從 1.5-2.5 小時，kinin 類物質會釋放出來；
2.5 小時之後為第三階段，prostaglandin 及 leukotriens、NO 和自由基（112）
會被釋放出來。又有研究指出角叉菜膠所誘導的發炎反應與自由基有
關 (34)。以carrageenan 誘發小鼠足蹠浮腫發炎實驗中，λ-carrageenan
會活化巨噬細胞，受活化的巨噬細胞會釋放出大量的超氧陰離子自由 基(O2－•)，而 O2－•會經由超氧歧化酵素(SOD)作用產生 H2O2，H2O2 會經由catalase 和 GSH-Px，轉換成無害的氧和水。λ-carrageenan 也 會經由活化iNOS 生成一氧化氮 (NO)，NO 會和 O2－• 作用，形成 ONOO－。OH•和 ONOO－攻擊細胞膜脂質，導致細胞損傷而發炎(5、35)。 活性氧自由基，例如O2－•、H2O2、OH•、ONOO－，是急性發炎反應 中重要介質(35)，發炎組織中的活性氧自由基，於發炎反應後 1-6 小時 即可被表現出來。且有文獻指出注射λ-carrageenan 三小時後，最大的 水腫反應和藥物的抗炎作用均會在這時期發生(36)。因此，發生炎症時 如能有效地減少ROS 含量，可以得到良好的抗發炎效果(37)。而肝組 織中含有許多抗氧化酵素，以抵抗自由基的作用。故本實驗於注射 λ-carrageenan 4 小時 (如圖 9)之後將老鼠犧牲，並取其肝組織，測定 肝臟中抗氧化酵素的活性。結果顯示，腹腔給予scutellarein 對肝臟中 SOD、GSH-Rd 活性均具增強作用。因此，scutellarein 可能藉由提升
肝臟中抗氧化酵素的活性，而強化清除自由基的能力，進而達到抗發 炎的作用。
以λ-carrageenan 誘發老鼠足蹠浮腫發炎實驗中，MDA 扮演重要
的角色。而相關研究指出，λ-carrageenan 注射之後 1~6 小時，會產生 OH•及 ONOO－(112)。而OH•和 ONOO－攻擊細胞膜脂質，而引發脂質 過氧化生成MDA。MDA 為脂質過氧化物最終產物之一，可作為體 內脂質過氧化作用指標，因此MDA 含量愈高，表示脂質過氧化程度 愈高；反之丙二醛含量降低，表脂質過氧化程度減少(113)。故本實驗 於注射λ-carrageenan 4 小時之後將小鼠犧牲，並取其腳組織，測定發 炎腳組織中MDA 的含量。實驗結果顯示，腹腔注射 indomethacin (10 mg/kg) 會減少小鼠足蹠 MDA 的濃度，此與 Kirkova 等人(114)的研究 結果相同。根據文獻指出，indomethacin 具有清除 O2－•、OH•、ONOO
－ 和NO 的能力(115)，因此推測 indomethacin 能減少 MDA 生成，可能 是藉由清除過多的活性氧自由基有關。腹腔給予scutellarein (10, 20 mg/kg)，亦均會減少小鼠足蹠 MDA 的含量，而 scutellarein 同時也會 增加肝臟及血液中抗氧化酵素的含量，因此推論scutellarein 減少小鼠 足蹠MDA 的含量，可能是藉由提升肝臟及血液中抗氧化酵素的含量 有關。
以λ-carrageenan 誘發小鼠足蹠浮腫發炎實驗中 (如圖一所示)，
NO 扮演一重要角色，NO 不但能刺激 COX 活性增加而產生過度的 pro-inflammatory prostaglandin(116)，NO 在發炎過程中扮演重要的角 色，其所誘導的發炎反應有兩期，NO 會在後期 1~6 小時產生，當
O2－•和 NO 作用，形成 ONOO－，ONOO－攻擊細胞膜脂質，而引發脂
質過氧化。實驗結果顯示，腹腔注射indomethacin 會減少大鼠足蹠中 NO 的含量。而腹腔給予 scutellarein，也會減少大鼠足蹠 NO 的含量，
因此scutellarein 會抑制發炎反應可能與抑制發炎組織中 NO 的生成有 關。
Indomethacin 為最普遍使用的一種鎮痛抗炎藥物，據文獻顯示，
indomethacin 不僅能抑制 PG 的生成(117)，也同時具有清除 O2－•、OH•、
ONOO－ 和NO 等自由基的能力(115)，相較於成癮性的鎮痛麻醉藥物，
NSAID 類的藥物在安全性上及使用性能上均相當優秀，然不可諱言 的，在使用indomethacin 的同時也具有一定的風險，包括引起急性精 神病學上的不安(Acute psychiatric disturbance)(118)與支氣管氣喘
(Bronchial asthma) (119)等副作用，經由本研究發現存在於半枝蓮等植 物中的成分scutellarein，其鎮痛抗炎作用與 indomethacin 相當。
關於半枝蓮成分wogonin、baicalein 及 scutellarein 抗炎機轉之探 討，據文獻記載天然黃酮類化合物 oroxylin A 主要是藉由抑制細胞內 轉錄因子NF-κB 的活化，進而導致細胞內誘導型 NOS 之表現受到抑 制所致(21)，又 baicalin、baicalein、wogonin 具有抑制 LPS 誘導之 PGE2
(LPS-induced prostaglandin E2)產生的能力(22)。在結構與活性關連部 分，據文獻指出，結構相似的flavone 亦會抑制 LPS 誘導之 NO 表現，
且flavone 化合物結構上之氫氧基數目愈多者其抗氧化能力愈強，並 且降低LPS 誘導之 NO 的能力也愈強(120)。Scutellarein 亦屬 flavone 類成分，其結構與baicalein 與 wogonin 相比，在第一個碳上連接苯環 的第三個碳位上多了一個氫氧基 (3´-OH)，所以 scutellarein 對 LPS 與Interferon-γ 誘導巨噬細胞(RAW264.7) 產生之 NO 含量的抑制率明 顯比baicalein 與 wogonin 高。
綜合以上結果顯示，本省的民間抗癌植物半枝蓮及其成分 scutellarein 對 LPS 併用 IFN-γ 誘導巨噬細胞（RAW264.7）產生一氧 化氮之抑制率最佳。半枝蓮粗抽物和scutellarein 於醋酸所引起疼痛之
綜合以上結果顯示，本省的民間抗癌植物半枝蓮及其成分 scutellarein 對 LPS 併用 IFN-γ 誘導巨噬細胞（RAW264.7）產生一氧 化氮之抑制率最佳。半枝蓮粗抽物和scutellarein 於醋酸所引起疼痛之