中草藥抗發炎作用之篩選暨半枝蓮與Scutellarein抗發炎研究;Studies on the Anti-inflammatory Activity in Selected Traditional Chinese Herbs, Scutellaria rivularis Wallich and Scutellarein

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(1)中國醫藥大學中國藥學研究所博士班博士論文編號：ICPS-D052. 指導教授：吳金濱副教授共同指導教授：謝明村教. 授. 共同指導教授：彭文煌副教授. 中草藥抗發炎作用之篩選暨半枝蓮與 Scutellarein 抗發炎研究 Studies on the Anti-inflammatory Activity in Selected Traditional Chinese Herbs, Scutellaria rivularis Wallich and Scutellarein. 研究生：廖容君 Jung-Chun Liao. 中. 華. 民. 國. 九. 十. 五. 年. 七. 月.

(2) 目錄內文目錄……………………………………………………………… Ⅰ 圖目錄………………………………………………………………… Ⅵ 表目錄………………………………………………………………… Ⅷ 略字表………………………………………………………………… Ⅸ 中文摘要……………………………………………………………… Ⅹ 英文摘要……………………………………………………………ⅩⅡ. 內文目錄第一章緒言…………………………………………………………. 1. 第一節研究動機背景…………………………………………. 1. 第二節研究目的………………………………………………. 3. 第二章總論…………………………………………………………. 5. 第一節發炎反應………………………………………………… 5 第二節中草藥在抗發炎藥物中的發展………………………. 7. 第三節角叉菜膠(λ- carrageenan)誘導發炎模式之簡介……… 9 一、λ-carrageenan 誘發小鼠足蹠浮腫實驗……………… 12 二、浮腫率(edema rate)及抑制率(inhibition rate)之計算. 12. 三、λ- carrageenan 引起的發炎與自由基的關係………. 13. 第四節一氧化氮與發炎性疾病的關係………………………… 14 一、一氧化氮之生理作用………………………………… 16 二、與一氧化氮有關的疾病……………………………… 17 三、巨噬細胞 RAW264.7 測定 NO 模式………………… 18 第五節疼痛反應………………………………………………… 19 一、疼痛的分子生物學研究……………………………… 20 二、鎮痛實驗動物模式…………………………………… 20 I.

(3) (一) 扭體反應試驗……………………………………… 22 (二) 福馬林試驗………………………………………… 23 第六節半枝蓮植物考察………………………………………… 25 一、半枝蓮之藥用植物學研究彙整…………………… 26 二、半枝蓮之成分研究彙整…………………………… 32 三、半枝蓮之藥理作用………………………………… 33 四、半枝蓮成分漢黃芩素(wogonin)之理化性質與藥理作用…………………………………………… 34 五、半枝蓮成分黃芩素(baicalein)之理化性質與藥理作用……………………………………………… 35 六、半枝蓮成分高山黃芩素(scutellarein)之理化性質與藥理作用……………………………………… 37 第三章實驗之部…………………………………………………… 38 第一節. 八十七種中草藥及半枝蓮成分漢黃芩素 (wogonin)、黃芩素(baicalein)、高山黃芩素 (scutellarein)對 LPS 與 INF-γ 誘發巨噬細胞 264.7 產生 NO 之抑制活性試驗…………………… 38. 一、實驗材料……………………………………………… 38 (一) 實驗材料之收集………………………………… 38 (二) 實驗材料之抽提………………………………… 38 (三) 檢品之製備……………………………………… 39 (四) 細胞培養………………………………………… 39 (五) 實驗試藥………………………………………… 39 (六) 實驗儀器………………………………………… 40. II.

(4) 二、實驗方法……………………………………………… 41 (一) 一氧化氮測定…………………………………… 41 (二) 細胞存活率測定(MTT assay)………………… 41 第二節半枝蓮及其成分 scutellarein 鎮痛作用之研究………… 43 一、實驗材料………………………………………………… 43 (一) 實驗材料之製備………………………………… 43 (二) 實驗動物………………………………………… 43 (三) 實驗試藥………………………………………… 44 二、實驗方法………………………………………………… 44 (一)扭體反應試驗……………………………………… 44 (二)福馬林試驗………………………………………… 44 第三節半枝蓮及其成分 scutellarein 對 λ-carrageenan 誘發足蹠發炎之抗發炎機轉研究…………………………… 46 一、實驗材料………………………………………………… 46 (一) 實驗材料之製備………………………………… 46 (二) 實驗動物………………………………………… 46 (三) 實驗試藥………………………………………… 46 (四) 實驗儀器………………………………………… 46 二、實驗方法………………………………………………… 47 (一)角叉菜膠誘導小鼠足蹠腫脹之影響……………… 47 (二)角叉菜膠誘導小鼠足蹠腫脹作用機轉之探討…… 48 (三)肝組織抗氧化酵素活性測定……………………… 48 1. SOD 之測定……………………………………… 48 2. GSH-Rd 之測定………………………………… 49 3. GSH-Px 之測定………………………………… 50 III.

(5) (四) 腳組織一氧化氮(NO)及丙二醛(Malondialdehyde； MDA)含量測定…………………………………… 51 1. NO 之測定……………………………………… 51 2.MDA 之測定……………………………………… 53 第四節統計學分析…………………………………………… 56 第四章實驗結果…………………………………………………… 57 第一節. 八十七種中草藥及半枝蓮成分漢黃芩素(wogonin)、黃芩素(baicalein)、高山黃芩素(scutellarein)對 LPS 與 INF-γ 誘發巨噬細胞 264.7 產生 NO 之抑制活性試驗……………………………………………… 57. 一、八十七種中草藥對 LPS 與 INF-γ 誘發巨噬細胞 264.7 產生 NO 之抑制活性試驗…………………… 57 二、Wogonin、baicalein、scutellarein 對 LPS 與 INF-γ 誘發巨噬細胞 264.7 產生 NO 之抑制活性試驗…………………………………………………… 66 第二節. 半枝蓮及其成分 scutellarein 鎮痛作用之研究……… 68. 一、半枝蓮鎮痛作用……………………………………. 68. (一)醋酸扭體反應試驗結果…………………………… 68 (二)福馬林前期舔足試驗……………………………… 69 (三)福馬林後期舔足試驗……………………………… 70 二、Scutellarein 鎮痛作用………………………………. 71. (一)醋酸扭體反應試驗結果…………………………… 71 (二)福馬林前期舔足試驗……………………………… 72 (三)福馬林後期舔足試驗……………………………… 73. IV.

(6) 第三節半枝蓮及其成分 scutellarein 對 λ-carrageenan 誘發足蹠發炎之抗發炎機轉研究………………………… 74 一、半枝蓮對 λ-carrageenan 誘導足蹠腫脹的影響…… 74 二、Scutellarein 對 λ-carrageenan 誘導足蹠腫脹的影響及抗發炎機轉研究…………………………… 75 (一) Scutellarein 對 λ-carrageenan 誘導足蹠浮腫的影響………………………………………………… 75 (二) Scutellarein 抗氧化與抗發炎關係探討…………… 76 1. Effect of scutellarein on NO level………………… 76 2. Effect of scutellarein on MDA level……………… 77 3-1. Effect of scutellarein on liver SOD activity induced by λ- carrageenan ……………………………… 78 3-2. Effect of scutellarein on liver GSH-Rd activity induced by λ- carrageenan……………………… 79 3-3. Effect of scutellarein on liver GSH-Px activity induced by λ- carrageenan……………………… 80 第五章討論………………………………………………………… 81 第六章結論………………………………………………………… 89 謝. 辭……………………………………………………………… 93. 參考文獻……………………………………………………………… 95. V.

(7) 圖目錄圖一、λ-carrageenan 誘發小鼠足蹠浮腫發炎之作用機轉………. 11. 圖二、半枝蓮植物照片……………………………………………… 25 圖三、半枝蓮植物寫生圖…………………………………………… 27 Figure 4. Analgesic effects of indomethacin and SREtOH on acetic acid (0.1 ml/10g) induced writhing response in mice……………………………………………………… 68 Figure 5. Analgesic effects of indomethacin and SREtOH on the early phase in the formalin test in mice……………… 69 Figure 6. Analgesic effects of indomethacin and SREtOH on the late phase in the formalin test in mice……………… 70 Figure 7. The effects of indomethacin and scutellarein on acetic acid-induced writhing response…………………………… 71 Figure 8. Analgesic effects of indomethacin and scutellarein on the early phase in the formalin test in mice………………… 72 Figure 9. Analgesic effect of indomethacin and scutellarein on the late phase in the formalin test in mice………………… 73 Figure 10. The effects of indomethacin and SREtOH extract on mice hind paw edema induced by λ-carrageenan……………………………………………… 74 VI.

(8) Figure 11. The effects of indomethacin and scutellarein on mice hind paw edema induced by λ- carrageenan………… 75 Figure 12. The effects of indomethacin and scutellarein on NO level induced by λ- carrageenan……………………… 76 Figure 13. The effects of indomethacin and scutellarein on MDA level induced by λ- carrageenan…………………… 77 Figure 14. Effect of scutellarein on liver SOD activity induced by λ- carrageenan………………………………………… 78 Figure 15. Effect of scutellarein on liver GSH-Rd activities induced by λ- carrageenan………………………………………… 79 Figure 16. Effect of scutellarein on liver GSH-Px activities induced by λ- carrageenan………………………………………… 80. VII.

(9) 表目錄表一. NO 標準曲線溶液配製方式………………………………… 52. 表二. MDA 標準溶液配製方式…………………………………… 54. 表三. MDA 標準曲線製作方式…………………………………… 55. Table 4. Inhibitory activity of 87 species of traditional Chinese herbs on NO production by a murine macrophage-like cell line, RAW264.7, activated with lipopolysaccharide and interferon-γ and the viability of macrophage by the MTT assay………………………………………………… 59 Table 5. Inhibitory activity of wogonin, scutellarein, and baicalein on NO production by a murine macrophage-like cell line, RAW264.7, activated with lipopolysaccharide and interferon-γ and the viability of macrophage by the MTT assay………………………………………………… 67. VIII.

(10) 略字表 eNOS：endothelial NOS GSH：glutathione GSH-Px：glutathione peroxidase GSH-Rd：glutathione reductase H2O2：hydrogen peroxide IFN-γ：interferon-γ IL-1ß：interleukin-1ß iNOS：inducible NOS LPS：lipopolysaccharide MDA：malondialdehyde NF-κB：nuclear factor kappa B nNOS：neuronal NOS NO：nitric oxide NOS：nitrite oxide synthase NSAIDs：non-steroidal anti-inflammatory drugs －. O2 •：superoxide anion radical OH•：hydroxyl radical －. ONOO ：peroxynitrite PAF：platelet activating factor ROS：reactive oxygen species SOD：superoxide dismutase TNF-α：tumor necrosis factor-α TXA2：thromboxane A2. IX.

(11) 摘要本研究首先從八十七種用於治療抗發炎、解熱及鎮痛之中草藥篩選對 LPS 與 interferon-γ 誘導巨噬細胞(RAW264.7)產生 NO 活性抑制之影響，結果顯示有 15 種中草藥對 LPS 與 Interferon-γ 誘導巨噬細胞 (RAW264.7)產生之 NO 含量有顯著的抑制作用，其抑制率都在 80％以上。並就其中活性佳且台灣民間常用的抗癌藥物半枝蓮(Scutellaria rivularis Wallich) 進一步以醋酸扭體法、福馬林舔足試驗及 λ -carrageenan 足蹠腫脹法，探討半枝蓮及其成分 scutellarein 之鎮痛及抗發炎藥理作用，最後測定λ-carrageenan 誘導足蹠腫脹小鼠之腫脹腳掌的 MDA 及 NO 含量、肝組織中抗氧化酵素(SOD、GSH-Rd、 GSH-Px)活性，以探討 scutellarein 之抗發炎機轉。醋酸扭體法實驗結果發現，口服給予半枝蓮粗抽物與腹腔注射給予 scutellarein 均可明顯減少小鼠因醋酸所引起疼痛之扭體次數，顯示有鎮痛作用。福馬林舔足試驗實驗結果發現，半枝蓮粗抽物與 scutellarein 可明顯減少小鼠福馬林誘發後期之舔足反應時間，顯示其具有週邊鎮痛作用。 λ-carrageenan 足蹠腫脹法實驗結果發現，口服給予半枝蓮粗抽物與腹腔注射給予 scutellarein 可明顯降低 λ-carrageenan 誘導的急性足蹠浮腫，顯示半枝蓮粗抽物具有抗發炎作用。 X.

(12) 最後測定λ-carrageenan 誘導足蹠腫脹小鼠之腫脹腳掌的 MDA 及 NO 含量、肝組織中抗氧化酵素(SOD、GSH-Rd、GSH-Px)活性發現，scutellarein 能明顯降低λ-carrageenan 所引起之腫脹腳組織 NO、 MDA 濃度及明顯提升肝臟中 SOD、GSH-Rd 抗氧化酵素的濃度，顯示 scutellarein 之抗發炎作用與增強自由基的酵素活性，因而減少 MDA 與 NO 含量有關。綜合上述結果，經由本研究設立的 NO assay 篩選平台所篩選出來對 NO 具有抑制活性的半枝蓮與其成分 scutellarein，經藥理與生化指數證實確實具有鎮痛與抗發炎作用，期待此簡便的篩選平台能夠提供研究同道們選取抗發炎實驗題材之參考依據。. 關鍵詞：半枝蓮，一氧化氮，中草藥，鎮痛，抗發炎，抗氧化酵素。. XI.

(13) Abstract In the present study, the effect of eighty-seven species of traditional Chinese herbs on nitric oxide (NO) production by a lipopolysaccharide (LPS) and interferon-γ (IFN-γ) activated murine macrophage-like cell line, RAW 264.7 was investigated. The inhibitory rate of the fifteen species is more than eighty percent. Scutellaria rivularis Wallich, used as anti-cancer drug in Taiwan, showed strong inhibitory effect. Therefore, I investigated the analgesic and anti-inflammatory effects of S. rivularis and its constituent-scutellarein. First, we investigated the analgesic effect of S. rivularis and scutellarein by acetic acid-induced writhing response test and formalin test. The anti-inflammatory activity of S. rivularis and scutellarein were determined by the λ- carrageenan induced mice paw edema. The writhing response and carrageenan-induced paw edema showed significantly reduced by treatment with S. rivularis and scutellarein. These results suggested that S. rivularis and scutellarein exerts analgesic and anti-inflammatory activity. Scutellarein treatment also caused a significant reduction of the NO and MDA levels in the edema paw, while increasing SOD and GSH-Rx activities in the liver tissue.. XII.

(14) In conclusion, the anti-inflammatory mechanism of scutellarein may be related to an inhibition of the NO and MDA production and the increase in the activities of antioxidant enzymes (SOD, and GSH-Rd). We suggest that scutellarein may be used as a pharmacological agent in preventing and treating disease in which free radical formation is a pathogenic factor.. Keywords：Scutellaria rivularis Wallich, nitric oxide, traditional Chinese herbs, analgesic, anti-inflammatory, antioxidant enzymes.. XIII.

(15) 第一章緒言第一節研究動機背景進入二十一世紀的今天，仍然有許多疾病 (例如感染性疾病、癌症、糖尿病等)常伴隨著全身或局部性的發炎作用，這些病症無法從西方醫學中獲得全面性的治療或預防，反觀我民族使用歷史悠久的中醫藥因而逐漸引起研究者的注目與高度的興趣。 2002 年，著名的美國前三軍聯席醫院院長 Koop 博士曾經指出，「因應未來醫藥之希望與需要，學界、藥廠與食品藥物管理局(FDA)，應加強天然藥物之研究發展與合作」(1)。2003 年 5 月 28 日第五十六屆世界衛生大會(WHA56.31)，會中公開支持傳統醫學，並注意到世界衛生組織傳統醫學戰略，包括制定政策，提高安全性、有效性和品質，確保獲取，以及促進合理使用等四項主要目標，傳統醫學於是更加受到國際間研究者的注意。我國民間常用之中草藥即屬傳統醫學的一部份，中草藥典籍中關於具有抗發炎、解熱、鎮痛等功效之中草藥的記載非常多(2. 、3). ，再加. 上民間習用的秘方或驗方，大量記載了這些藥物的臨床療效。但往往中草藥的品質良窳不齊，影響了藥物的使用效果，加上中草藥成分複雜、不明確，並且缺乏符合現代醫學要求的實驗平台驗證，以至於目 1.

(16) 前市面上販售的的中草藥不是效果不明就是過分誇大療效，往往使得使用者無所適從，亦無法廣受西方醫學所肯定。炎症反應是一種極其常見而又十分複雜的基本病理過程，是許多疾病的發病基礎。所謂的炎症是指具有血管系統的活體組織對損傷因子所發生的免疫防禦反應，而在局部表現為紅、腫、熱、痛及機能障礙五大主癥(4)。其發炎反應係與肥大細胞、巨噬細胞、嗜伊紅性白血－. 球及嗜中性白血球活化，產生大量 O2 • (superoxide anion radical)有關，而其機轉據學者研究指出與高反應性含氧分子(reactive oxygen species, ROS)：如一氧化氮（nitric oxide; NO）、自由基生成釋出等在發炎過程中扮演重要的角色(5)。又自由基中的 NO 在發炎過程中扮演促進發炎物質（如 IL-1， TNF…）生成的角色，間接或直接地參與巨噬細胞所調控的發炎反應 (6). 。NO 在發炎反應過程中主要是經由活化一氧化氮合成酵素(nitric. oxide synthase, NOS)而將細胞內之 L-arginine 轉變成為 L-citrulline 及 NO 的釋放(7)。因此從抑制過多的 NO 生成的角度來探索新的抗發炎藥，應是一種新的指標。. 2.

(17) 第二節研究目的本研究為了探討中草藥之抗發炎作用，首先藉由篩選具有抗發炎作用之中草藥對於 LPS 與 INF-γ 誘導小鼠巨噬細胞(RAW264.7)產生 NO 活性抑制之作用為指標，希望在本研究室設立一簡便且實驗結果再現性高的篩選平台，方便往後進行藥理體內試驗評估之依據。根據此平台進行了 87 種中草藥的篩選工作，發現其中 15 種能夠明顯的抑制 NO 生成(8)，在這 15 種中草藥中，選擇台灣常用的抗癌藥物—半枝蓮為接下來的研究主題。半枝蓮基原為唇形科 Scutellaria rivularis Wallich 的全草，具有治療吐血、衄血、黃疸、咽喉腫痛、疔瘡、瘰癧及腫瘤之功效(9-12)。現代藥理研究亦發現其具有抗癌作用 14). 、免疫調節作用(15)、抑菌作用(16)與解痙袪痰等作用. (17). (13、. 。另外據學. 者研究指出，半枝蓮的乙醇抽出物經分劃後的氯仿層含有 baicalin、 baicalein、wogonin 等成分，具有明顯的抗炎作用及保肝活性(18. 、19). ，. 而半枝蓮的活性成分中 baicalin 有很好的抗炎作用，wogonin 具有保肝活性(20)。並有研究指出黃酮類成分 oroxylin A 主要是藉由抑制細胞內轉錄因子 NF-κB 的活化，進而導致細胞內誘導型 NOS 之表現受到抑制所致(21)；baicalin、baicalein、wogonin 具有抑制 LPS 誘導之 PGE2 (LPS-induced prostaglandin E2) 產生的能力(22) 。然而半枝蓮成分中與 oroxylin A、baicalin、baicalein、wogonin 結構相近的另一個成分. 3.

(18) scutellarein，其鎮痛及抗發炎作用與機轉仍未見探討。因此本研究再應用醋酸扭體試驗及福馬林試驗於探討半枝蓮粗抽物及其成分 scutellarein 之鎮痛作用，應用 λ-carrageenan 試驗及測定浮腫腳掌之丙二醛(MDA)及 NO 濃度、肝組織之抗氧化酵素(SOD、 GSH-Rd、GSH-Px)之活性，以探討半枝蓮粗抽物及其成分 scutellarein 之抗發炎作用機轉，俾開發能抑制 NO 且具鎮痛抗炎作用的藥物。. 4.

(19) 第二章總論第一節發炎反應炎症（inflammation），係指具有血管系統的活體組織對損傷因子所發生的防禦反應，也是一種極其常見又十分複雜的基本病理過程，同時炎症也是許多疾病的重要組成部分。內外源性損傷因子均可引起機體細胞和組織各種各樣的損傷性變化，與此同時機體的局部和全身也發生一系列複雜的反應，以侷限和消滅損傷因子，清除及吸收壞死組織和細胞，並同時進行細胞的再生修復損傷，這種機體的損傷和對損傷的複雜反應構成炎症現象(23)。在公元前的古希臘羅馬時代，Celsus 就提出了炎症的四大特徵，即為紅、腫、熱、痛。後來在 19 世紀德國病理學家 Virchow 又提出局部機能障礙的第五大主癥(4)。受傷害的組織細胞，會釋出組織胺，刺激附近的血管，導致局部血管擴張及微血管通透性增大。症狀包括局部血管擴張，使該部血流增加，呈現紅、熱症狀；微血管通透性之增大，致使血漿滲出較多，造成腫脹，進而壓迫神經而感覺疼痛。在炎症反應的各個階段都有炎症介質的釋放和參與，這些炎症介質大致可分成三類：（1）高反應性含氧分子（ROS）：如一氧化氮（NO）。（2）脂質衍生物：包括血小板活化因子及環氧化酶（cyclooxygenase）和脂氧化酶（lipooxygenase）代謝花生四烯酸 5.

(20) （arachidonic acid）所生成之發炎分子包括白三烯酸（leukotrienes）、前列腺素（prostaglandins）及血栓凝集素（thrombine）。（3）蛋白質：通常是 interleukin、TNF-α、TNF-γ。這些炎症介質的作用扮演著促進發炎、抗發炎或者雙重角色，在一定階段時。某種介質可能引起主要作用，引起某種反應，並可刺激其他介質的生成和釋放，引起連鎖反應，促進炎症反應。但在另一個階段，它又可能抑制其他介質的生成或抑制其作用，甚至通過負回饋調節自身生成，而抑制炎症發展。. 6.

(21) 第二節中草藥在抗發炎藥物中的發展自從世界衛生大會公開宣示支持傳統醫學，傳統醫學於是更受到國際間的注意。事實上近年來，國際社會對於中草藥的需求與日劇增，各種中草藥產品充斥於坊間，例如以健康食品、膳食補充品或中藥處方藥物等形式大量販售。許多疾病(例如感染性疾病、癌症、糖尿病、阿茲海默症等)常伴隨著全身或局部性的發炎作用，例如慢性腸炎會增加大腸癌發生的機率(24)，此時為降低發炎反應，通常可使用一些抗發炎藥物，如具有清熱解毒方面功效的藥物。由於保健食品、健康食品或膳食補充品的蓬勃發展，現代藥理關於中草藥具有抗發炎作用的研究非常多，例如陳皮的成分 nobiletin 對 LPS 與 INF-γ 誘導巨噬細胞(RAW264.7)生成 NO 及 PGE2 有抑制作用 (25). ；杜仲、甘草、當歸之乙醇粗抽物對 LPS 誘導小鼠巨噬細胞. (RAW264.7)生成的 NO 及 PGE2 具有抑制作用(26)；當歸成分 ferulic acid、馬鞭草粗抽物對 λ-carrageenan 誘導小鼠足蹠浮腫均具有明顯的抑制作用(27. 、28). ；甘草主成分 glycyrrhizin 具有抗發炎、抗潰瘍、抗過. 敏、抑制免疫效果等功能(29)；山葡萄為民間常用在利尿、消炎、止血、治療慢性肝炎等作用，據 Hsieh(1998)研究指出其甲醇粗抽物對福馬. 7.

(22) 林誘發舔足試驗具抑制效果，對 λ-carrageenan 誘導小鼠足蹠浮腫具有明顯的抑制作用(30)。. 8.

(23) 第三節角叉菜膠 (λ- carrageenan) 誘導發炎模式之簡介誘發小鼠組織急性浮腫發炎的介質包括 λ-carrageenan、 histamine、5-HT、dextrose、bradykinin、prostaglandin 等，其中以 λ-carrageenan 誘發小鼠足蹠浮腫發炎之作用機轉 (如圖一) 最明確，因此廣泛使用於評估抗發炎藥物的效果。 λ-carrageenan 是一種植物多醣體，為非刺激性的致炎物質，最初是由藻類角叉菜（愛蘭苔 Irich seamoss，學名 Chondrus crispus）抽提而得，其誘發小鼠足蹠浮腫之機轉，被認為具有雙相（biphasic）之機轉(31)，原因在於注射 λ-carrageenan 後，在不同時間釋放出不同的物質而引起發炎，即 0-1.5 小時或 20 分至 1 小時內（first phase），此時 histamine、serotonin、PAF（platelet activating factor）會游離出來；而 1.5-2.5 小時（second phase），kinin 類物質會釋放；2.5 小時之後（third （32）. phase），prostaglandin 及 leukotrienes、NO 和自由基. 會被釋放出來。. 急性發炎反應，是指受到傷害之組織立即產生的變化，包括大量的化學媒介物（如 histamine、serotonin、prostaglandins、leukotrienes、 bradykinin、interleukin-1 等）被製造及釋放。雖然受傷部位不同，但引發致炎之媒介皆相同，因此急性發炎的基本形態是一樣的。而 carrageenan 所誘發的炎症反應，與臨床之急性炎症非常類似，其過程包括 arachidonic acid（花生四烯酸）代謝產物 prostaglandin 和. 9.

(24) leukotrienes 之增加；釋放 histamine、serotonin 及 bradykinin 等物質，造成血管通透性增加；嗜中性球（neutrophil）及單核球（monocyte）之吞噬反應等。所以實驗上常以 λ-carrageenan 引發炎症反應來評估藥物之抗急性炎症效果。實驗並選用正對照藥物 indomethacin，indomethacin 為非類固醇抗炎藥（NSAIDs），其抗炎機轉主要在抑制 cyclooxygenase 之活性，使 arachidonic acid 無法變成前列腺素（prostaglandin）、TXA2、prostacyclin 等致炎物，並能減少微血管的通透性和多型核白血球的（PMN）轉移，以達抗炎的作用。所以在許多 NSAIDs 藥物的研究中，indomethacin 也就常成為評估生藥抗炎活性的對照藥物。. 10.

(25) 圖一、λ-carrageenan 誘發小鼠足蹠浮腫發炎之作用機轉(32). 11.

(26) 一、λ-carrageenan 誘發小鼠足蹠浮腫實驗用記號筆在小鼠右後肢踝關節周圍做一標記，將小鼠右後肢浸入浮腫測定儀器，測量正常足蹠容積後，分別在小鼠右後肢足蹠皮下注（33）. 射1% λ-角叉菜混懸液（0.1 ml/隻）致炎. 。誘導2.5小時後，將小鼠. 分別以不同劑量之檢品腹腔給予，正對照組於誘導後1.5小時，皮下注射indomethacin（10 mg/kg），給藥量皆為0.1 ml/10g。給藥後每隔1小時皆按上法，各測一次足蹠容積，連續測7小時，記錄結果，並分別計算誘導後每小時足蹠體積與誘導前個別足蹠之體積差（△V）。. 二、浮腫率（edema rate）及抑制率（inhibition rate）之計算浮腫率（E）% = [（Vt – V0）/ V0] ×100 抑制率（I）% = [（Ec – Et）/ Ec ]×100 V0 = carrageenan 注射前之足蹠體積（mL） Vt = carrageenan 注射後 t 小時之足蹠體積（mL） Ec = 控制組的浮腫率 Et = 藥物組的浮腫率. 12.

(27) 三、λ- carrageenan 引起的發炎與自由基的關係研究指出角叉菜膠所誘導的發炎反應與自由基有關(34) 。以 λ-carrageenan 誘導大鼠足蹠發炎反應，λ-carrageenan 會活化巨噬細－. 胞，受活化的巨噬細胞會釋放出大量的超氧陰離子自由基（O2 •）。－. 而 O2 •會經由超氧歧化酵素（SOD）作用產生 H2O2，H2O2 會經由 catalase 和 GSH-Px，轉換成無害的氧和水。λ-carrageenan 也會經由活－. －. 化 iNOS 生成 NO，NO 會和 O2 •作用，形成 ONOO 。OH•和 ONOO －. 攻擊細胞膜脂質，導致細胞損傷而發炎(5. 、35). 。活性氧自由基，例如. O2 •、H2O2、OH•、ONOO ，是急性發炎反應中重要介質(35)，發炎－. －. 組織中的活性氧自由基，於發炎反應後 1-6 小時即可被表現出來。且有文獻指出注射 λ-carrageenan 三小時後，最大的水腫反應和藥物的抗炎作用均會在這時期發生(36)。因此，發生炎症時如能有效地減少 ROS 含量，可以得到良好的抗發炎效果(37)。. 13.

(28) 第四節一氧化氮（NO）與發炎性疾病的關係 NO 是哺乳動物中最小、最輕並具有廣泛生物學功能的信息分子與效應分子(7)，無色、無味氣體，可溶於水和脂肪。它不帶電荷且有ㄧ個未配對電子，在體內以自由基的形式存在，由於不帶電荷使它可以自由的穿越細胞膜。廣泛存在於神經系統、心血管系統、免疫系統、消化系統、生殖系統與呼吸系統的細胞內(38)。它的半衰期很短，約 5-10 秒，會迅速被氧化成硝酸鹽和亞硝酸鹽。NO 在體內是由一氧化氮合成酶（NOS）催化 L-arginine 轉成 L-citrulline 的過程中生成的(7)。一氧化氮合成酶（NOS）主要分為三種形式，分別是 eNOS、 nNOS、iNOS，分佈在不同組織中，在體內調節不同生理功能。eNOS 是於血管內皮細胞中發現，由其生成的NO，可促進血管舒張達到降血壓之作用(39)；第二種是主要存在於腦細胞或神經細胞中 nNOS，由 nNOS 生成的NO 則與神經傳導之調節、腦部記憶和學習有密切關係。其中eNOS 與 nNOS屬於結構性的合成酶，不需誘導即自然存在於體內，機體內正常濃度一般約在 nmole之譜(40)。而第三種 iNOS 則屬於誘發型，主要存在於巨噬細胞中，必須被誘導才會呈現活化，如細菌內毒素（LPS）或細胞激素（cytokines）包括TNF-α、IFN-γ、IL-1ß 等皆可誘導 iNOS 之產生。但IL-4 與IL-10等具有抗發炎作用的細胞激素，可藉由抑制促發炎的細胞激素（TNF-a、IL-1、IL-6）的生成，. 14.

(29) 進而抑制 iNOS的表現，並且減少NO之生成。Weisz（1994）(41)等學者研究指出，iNOS主要調節於轉錄階段，LPS 和IFN-α 可以藉由活化巨噬細胞中iNOS transcription factor：NF-κB，增加其與iNOS 之 DNA binding而促進iNOS mRNA 轉錄作用，進而增加NO之生成。 Ohshima與Bartsch（1994）(42)進一步指出，iNOS誘導生成之NO具殺菌作用並參與宿主防禦機能，由此路徑誘導生成之NO，濃度約為 eNOS 或 nNOS 路徑生成之1000倍，且其本身為一自由基(free －. radical)，故若長期暴露於此過量NO環境下，可能會與 O2 • 作用，－. 生成一強氧化劑 ONOO ，進而對組織細胞產生毒害作用，引起發炎反應並增加致癌機率。. 15.

(30) 一、一氧化氮之生理作用 NO 有兩大重要功能：(1)NO 是細胞和細胞間信息傳遞的重要調節因子，作為第二信息和神經傳導物質而有各種不同的作用，如調節血管張力，調節血壓、傳遞神經信息和抑制血小板凝集等。(2)NO 在細胞免疫和炎症毒性扮演重要的角色。NO 在炎症反應的許多環節中發揮複雜的調節作用，炎症反應時，致炎物質或炎症介質可誘導或增加局部 NO 的合成與釋放(6)。大致上，組織中誘導型 NO（iNOS）在炎症反應中被誘導產生，生成大量 NO，促進炎症反應，例如血管擴張反應、細胞毒性、水腫及細胞因子依賴過程的間接作用等。相反地，由內皮細胞中原生型 NO 合成酶（eNOS）所產生的 NO，則透過活化微血管中的中性粒細胞，阻止細胞黏附以及氧化物的釋放而發揮其保護作用及抑制炎症反應的作用。NO 在炎症機制中發揮著雙重作用，一方面，NO 促進炎症反應的作用包括使血管舒張、形成水腫和局部紅斑、增加炎症滲出、促進敗血症的發展、活化前列腺素合成酶以及參與類風濕的發展等；另一方面，NO 又可與前列腺素相互作用，調節一系列生理的和炎症的過程，體內存在著一套精確地調控 NO 合成的機制(43)。. 16.

(31) 二、與一氧化氮有關的疾病如上一節所述，適量的 NO，可作為神經傳導物質、並會引起血管平滑肌鬆弛及抑制血小板凝集。然而，高濃度的 NO 會造成病理上的血管擴張、組織傷害。以下彙整一些因高濃度 NO 引起相關疾病的文獻。 1. 造成菌血症(sepsis)患者血壓大量下降、對神經元傷害造成神經退行化疾病(44)。因此 NO 與格蘭氏陰性菌引發之敗血性休克及 circulatory failure 有關(45)。 2. 在發炎或感染的組織中，巨噬細胞產生的 NO 明顯增加。包括關節炎(arthritis) (46. 、47、48). 、癌症、動脈粥樣硬化、中風(38. 、44). 及敗血性. 休克(septic shock)(49) 3. B 型肝炎、肝腫瘤或結腸癌的發生可能和慢性發炎有密切關係(42)，且這些疾病的發生可能和 NO 有密切的關係(40. 、50). 4. 阿茲海默氏症患者腦部大量沉積 senile plaque，主要由 beta-amyloid 引起。有證據指出因 beta-amyloid 活化了 microglial cell，促使其產生 NO 而傷害了神經細胞(51)。在老鼠的 glial cell 中，â-amiyloid 會刺激 iNOS 表現增強，並產生高濃度 NO，而此高濃度 NO 可能即是造成阿茲海默氏症的病因之ㄧ(52)。 5. TypeⅠ糖尿病患者血清中一氧化氮增高。目前認為一氧化氮能損. 17.

(32) 傷胰島 β 細胞，使胰島素合成下降，導致血糖升高(53)。. 三、巨噬細胞 RAW264.7 測定 NO 模式巨噬細胞在發炎及宿主對抗細菌或病毒上均扮演重要角色，在活化的巨噬細胞所釋放的各種媒介物質當中，一氧化氮為巨噬細胞在抗腫瘤及抗菌作用上能發揮調節或細胞毒素作用的有效分子之一，負責巨噬細胞合成一氧化氮的酵素是 iNOS，然而平常 iNOS 是不存在的，但在細菌內毒素（LPS）和炎症的細胞分裂素作用下能強力引發 iNOS產生，INF-γ對LPS作用下的巨噬細胞具有協同作用能引發更大量 iNOS產生，然而 INF-γ單獨並不能引發巨噬細胞產生 iNOS。然而，在急性或慢性發炎中發現過多的一氧化氮可能導致宿主細胞及組織嚴重的損壞，在種種發炎疾病中，例如風濕性關節炎患者體內就發現其巨噬細胞產生過多的一氧化氮。因此，抑制過多的一氧化氮成為目前找尋抗發炎藥物的一個重要指標。. 18.

(33) 第五節疼痛反應 1979 年國際疼痛研究協會(International Association for the Study of Pain , IASP)將人類疼痛定義為：「不愉快的感覺及情緒的變化伴隨著實際上或潛在的組織傷害」，1996 年美國疼痛醫學會發表「疼痛」為呼吸、血壓、心跳、脈搏以外的第五大生命徵象。疼痛為人類共有的一種複雜生理、心理反應，且個體差異很大的一種不愉快的主觀感覺；它是一種主觀的、複雜的感覺傳導，並提供軀體受到威脅的警報信號，是生命裏不可缺少的一種特殊保護功能。目前關於止痛劑的發展雖然不斷的推陳出新，然而大多限制在西藥的發展為主，不可諱言的，西藥的治療又多帶有一些副作用，例如癌症引起的劇烈疼痛多需使用成癮性麻醉鎮痛藥，例如 morphine 類製劑，雖有很好的止痛效果但也往往造成許多身體與精神方面的障礙。而非成癮性麻醉鎮痛藥 (NSAID)，雖然無成癮的隱憂，但亦多有些副作用或毒性，例如廣泛使用的水楊酸類製劑(salicylic acid)對消化道的刺激性，及 acetaminophen 對肝臟的毒性等。因此如果能從傳統中草藥中發掘出對於鎮痛方面具有療效，而毒副作用又小的藥物，對於深受疼痛之苦的人來說，將是一個新的選擇。. 19.

(34) 一、疼痛的分子生物學研究愈來愈多的證據顯示，長期的傷害性刺激會導致中樞神經特殊的改變，使得中樞神經敏感化(sensitization)，對於輕微而短暫的刺激產生強烈而持續的反應(54. 、55). 。疼痛刺激從初級傳入神經去極化開始，. 透過突觸間傳遞及自由擴散的方式將訊號送入中樞神經系統之神經細胞核內，必須經過三級制訊號傳遞系統. (56). 。這些經由傷害性神經. 刺激所造成的中樞神經可塑性變化(neuroplasticity)，主要經由興奮性胺基酸受器(excitatory amino acid receptor)以及受器活化後引發的一連串胞內訊息傳遞物質的影響(57)。這些物質包括了興奮性胺基酸，神經細胞內鈣離子，一氧化氮、前列腺素、PKC 以及 C-Jun、C-Fos 等蛋白的調節。因此當細胞受到疼痛刺激後，經由興奮性胺基酸、受器，以及一連串胞內的訊息傳遞物質會導致神經細胞特殊變化的分子生物學機轉。. 二、鎮痛實驗動物模式一般引起疼痛反應的刺激種類，可分為機械刺激法、熱刺激法、電刺激法及化學刺激法等四大類傷害性刺激。研究疼痛的實驗動物模式包括：簡單反射測量模式，如 tail-flick test、limb-withdrawal reflex、jaw-open reflex；持續疼痛模式，如 formalin. 20.

(35) test、adjuvant poly arthritis、carrageenan induced inflammation；未學習行為反應模式，如 hot-plate test、writhing response；學習行為反應模式，如 shock titration、reaction time confict task 等(58)。由於常用的幾個疼痛模式中，各有其限制及缺點。例如 tai-flick test 雖然是一簡單且量化性高的實驗，但也僅能代表動物對痛覺的反射行為 (reflex behavior)，而沒有高級中樞痛覺整合的參與，且須注意實驗過程中不能影響到動物的運動神經及肌肉的功能，否則會改變反射的延遲時間而造成誤判，另外 baseline 的變異不小，亦是 tail-flick test 的困擾，因此必須選擇合適的紅外線功率及 cut-off 時間。在近幾年的研究中，有學者提出實驗環境溫度及鼠尾溫度會干擾 baseline latency(59)，因此，必須控制固定且合適的室溫(22-24℃)並記錄實驗前後的鼠尾溫度變化，若有改變要再用公式來校正。化學刺激中，用醋酸腹腔注射造成急性腹膜炎所引起的臟腑痛 (visceral pain)，可見到扭體反應(writhing response)，其中要注意實驗動物的年齡及體重造成的誤差，而扭體反應也僅能代表位於周邊的疼痛作用。相反的許多機械性刺激(tail pressure test，tail pinch test)、熱刺激(hot plate)及電刺激(electric foot shock)亦僅能代表中樞的鎮痛作用。唯有化學性刺激中的福馬林試驗較特別，它可同時測得中樞以及周邊所引起的痛覺反應，這是此試驗的優點(60)。因此本研究採用扭體. 21.

(36) 反應試驗及福馬林試驗方式評估半枝蓮乙醇粗抽物與 scutellarein 鎮痛之作用。. (一) 扭體反應試驗一般引起疼痛反應的刺激種類，可分為機械、溫熱、電氣及化學的刺激等。如以化學物質刺激實驗動物，常用的化學物質有 acetic acid、bradykinin、K+等，以腹腔注射刺激腹膜或接觸皮膚，會引起刺激化學敏感型接受體引發疼痛反應，實驗動物表現出腹部收縮內陷、後肢伸展、身體扭曲或蠕行等扭體表現(61)。本研究採用醋酸扭體實驗乃是 Siegmand 等人所提出. （62）. ，以化學物質刺激實驗動物的化學敏感. 型接受體，使動物疼痛而產生腹肌收縮、扭體等反應的實驗. （63、64）. 。. 然而包括鴉片類與內生肽類等神經鎮痛物質及固醇類和非固醇類週邊性鎮痛抗炎物質皆可抑制此扭體反應(65)，因此可廣泛使用於篩選大部分鎮痛物質. (66、67). 一般認為醋酸扭體之作用機轉乃經由醋酸對腹部之直接刺激所引發之疼痛反應，造成其腹部內縮、後腿伸直、身體拉長扭曲之現象. （62）. ；. 其所媒介之機轉以周邊作用較強，但亦有中樞之作用（中樞許多神經傳遞物質參與鎮痛系統的作用，例如 β- endorphin 等鴉片樣物質）(65)，因而無法確認其作用機轉是經由中樞或周邊而來，所以必須進一步以福馬. 22.

(37) 林試驗進行研究，以確認其真正的鎮痛作用機轉。. (二) 福馬林試驗福馬林舔足實驗最早由 Dubuisson 和 Dennis 於 1977 年提出，對許多鎮痛藥物的篩選為一可靠有效的方法(68)，皮下注射稀釋過的福馬林於大鼠、小鼠、貓或靈長類動物可觀察到兩相痛反應，在小鼠右後足掌注入福馬林，因刺激引起疼痛而有舔足或頓足的行為反應，此一動物模式經由 Shibata （1989）等研究發現，其所產生之舔蹠反應呈雙相（biphasic response）的作用，亦即其舔足時間具有兩個高峰期，在福馬林注入 0-5 分鐘會造成起痛 (initial pain)反應而引起小鼠舔足，稱之為前期 (early phase)，前期主要因直接刺激痛覺接受體造成 substance P 或 bradykinin 等致痛物質釋放；而在 20-30 分鐘所表現舔足時間稱之為後期 (late phase)，後期主要因為福馬林溶液引起發炎反應造成化學傳遞物質，例如 histamine、serotonin、prostaglandin 及 kinin 等有關物質由受損組織細胞中釋出所引起(69)。本實驗所選用之正對照藥物--非類固醇消炎藥 indomethacin 只能降低福馬林刺激的第二階段疼痛行為(70)。 Hunskaar (1987) (71)等人研究報告指出福馬林試驗對發炎性和非發炎性疼痛之鎮痛藥物評估為一有效之模式，亦即前期為非發炎性疼痛，後期為發炎性疼痛。另外，以福馬林誘導產生的疼痛反應中，福馬林的. 23.

(38) 濃度也佔了很重要的因素，當福馬林濃度僅 0.02-0.2%時僅能誘導出前期舔腳反應，如以光學顯微鏡下觀察組織，發現其對組織的改變相當小；而使用 1%或更高之福馬林濃度時即可誘導出前期及後期舔腳反應，如注入 5%福馬林，30 分鐘之後，在光學顯微鏡下觀察組織，可發現組織呈現急性發炎反應，顆粒性白血球破壞及腫脹均清楚可見(70)。近代亦有文獻(72)指出，脊髓中樞的變化是造成福馬林刺激第二階段疼痛很重要的原因。在福馬林皮下注射後，紀錄脊髓背角單一神經元，發現在一階段之前注射局部麻醉劑，能夠預防第二階段疼痛行為的發生。由於第二階段的疼痛反應必須倚賴第一階段的疼痛刺激。因此，福馬林測試，在研究各種阻斷劑的對於過敏性疼痛的止痛效用時，便提供了我們很好的一個疼痛行為評估模式。. 24.

(39) 第六節半枝蓮植物考察. 圖二、半枝蓮植物照片(陳忠川老師提供). 半枝蓮（Scutellaria rivularis Wallich）（如圖二）為台灣民間常用藥，自生於台灣全境平野濕潤地。多年生草本植物，於開花期間採全草，鮮用或乾燥後使用。有清熱、解毒、散瘀、止血、鎮痛等功效。用於抗發炎、肝硬化、抗癌與利尿作用等(9. 、12、73、74). 25. 。.

(40) 一、半枝蓮之藥用植物學研究彙整 (一) 來源：為唇形科植物半枝蓮的全草。 (二) 分布：分佈於華東、華南、西南及河北、陝西南部、河南、湖北、湖南(73)。台灣全境平野濕潤地、田畔、溝旁自生(12)。 (三) 特徵：半枝蓮 Scutellaria rivularis Wallich (Scutellaria barbata D.Don)係多年生草本植物，高 15-50 cm。莖四棱形，無毛或在花序軸上部疏被緊貼小毛，不分枝或具或多或少的分枝。葉對生；葉柄長 1-3 mm；葉片卵形、三角狀卵形或披針形，長 1-3 cm，寬 0.4-1.5 cm，先端急尖或稍鈍，基部寬楔形或近截形，邊緣具疏淺鈍齒，上面橄欖綠色，下面帶紫色，兩面沿脈疏生貼伏短毛或近無毛，側脈 2-3 對，與中脈在下面隆起。花對生，偏向一側，排列成 4-10 cm 的頂生或腋生的總狀花序；下部苞葉葉狀，較小，上部的逐漸變得更小，全緣；花梗長 1-2 mm，有微柔毛，中部有 1 對長約 0.5 mm 的針狀小苞片；花萼長 2-2.5 mm，果時達 4 mm，外面沿脈有微柔毛，裂片具短緣毛，盾片高約 l mm，果時高約 2 mm;花冠藍紫色，長 1-1.4 cm，外被短柔毛，花冠筒基部囊狀增大，寬 1.5 mm，向上漸寬，至喉部寬 3.5 mm，上唇盔狀，長約 2 mm，下唇較寬，中裂片梯形，長約 3 mm，側裂片三角狀卵形；子房 4 裂，花柱細長；雄蕊 4，前. 26.

(41) 對較長，具能育半藥，退化半藥不明顯，後對較短，具全藥，花絲下部疏生短柔毛；花盤盤狀，前方隆起，後方延伸成短子房柄。小堅果褐色，扁球形，徑約 l mm，具小疣狀突起。花期 5-10 月，果期 6-11 月(73)。(如圖三). 圖三、半枝蓮植物寫生圖(75). (四) 炮製：取原藥材，揀去雜質，用水洗淨。瀝去水，切段，乾燥 (73). 。. (五) 異名(73)： 1. 廣州植物誌：狹葉韓信草 2. 南京民間藥草：通經草、紫連草、並頭草 3. 江蘇省植物藥材誌：牙刷草. 27.

(42) 4. 廣西藥用植物圖誌：水韓信 5. 江西民間草藥驗方：溪邊黃芩、金挖耳 6. 浙江民間常用草藥：野夏枯草、方草兒、半向花、偏頭草、四方草 7. 廣西中草藥：耳挖草 8. 福建中草藥：小號向天盞 9. 福建新醫療法資料選編：狹葉向天盞. (六) 品種考證：半枝蓮之名最早見於外科正宗，用治毒蛇傷人。蔣儀藥鏡拾遺賦云："半枝蓮解蛇傷之仙草。"但均無形態描述，故難於確定為何種植物。綱目拾遺在”鼠牙半支”條內收載。百草鏡收載半枝蓮飲，所用半枝蓮為鼠牙半支，並描述其形態云:" 鼠牙半枝二月發苗，莖白，其葉三瓣，層積蔓生，花後即枯，四月開花黃色，如瓦松。"據所述特徵考訂，應為景天科景天屬 (Sedum)植物。此外，江蘇、浙江、雲南等地有些地區稱唇形科植物韓信草 Scutellaria indica L.為半枝蓮，均非本品(73)。. 28.

(43) (七) 藥材鑑別(73)： 1. 性狀鑒別全草長 15-30cm。根纖細。莖四棱形，直徑 2-5mm，表面黃綠色至暗紫色。葉對生，皺縮或卷摺，展平後呈卵狀披針形，長 1.5-3cm，寬 0.5-lcm，被疏柔毛，上面深綠色，下面灰綠色；葉柄短或近無柄。枝頂有偏於一側的總狀花序，具殘存的宿萼，有時內藏四個小堅果。莖質軟，易折斷。氣微，味苦澀。以色綠、味苦者為佳。 2. 顯微鑒別葉表面觀：表皮細胞長多角形，垂周壁波狀彎曲，上表皮細胞較大，有的細胞含橙皮苷結晶，以氣孔周圍為多見；氣孔直軸式。非腺毛 1-4 細胞，壁具厭狀突起，基部細胞有放射狀紋理。腺鱗較多，頭部類圓形，4-10 餘細胞，直徑 25-47μm，形大者類圓形或橢圓形，有的邊緣凹凸，由數十個細胞組成，直徑 140-266μm。另有小腺毛，頭部類圓形，1-2 細胞，直徑約 28μm，柄短，單細胞。 3. 理化鑒別 (1)取本品粉末 10g，加 80%乙醇 50ml，置水浴迴流 0.5h，趁熱濾過。取濾液 lml，加鎂粉少許及濃鹽酸數滴，漸顯緋紅色。(檢查黃酮類)；(2)取(1)項濾液 1m1，加 1%三氯化鐵試液 1-2 滴，溶液顯墨綠色。(檢查酚類)；(3)取(1)項濾液 4m1，置水浴上蒸乾，殘渣加 5%鹽酸 5m1,攪拌溶解，. 29.

(44) 濾過。濾液分置 3 支試管內分別加碘化泌鉀試液、碘化汞鉀試液、矽鎢酸試液各 1-2 滴，各試管均產生沉澱。(檢查生物鹼). (八) 性味(73) 味辛、苦，性寒。歸肺、肝、腎經。 1. 廣西藥用植物圖志：「味辛微腥，性平，無毒。」 2. 南寧市藥物誌：「甘，平，無毒。」「性寒，味苦。」 3. 江西草藥： 4. 廣州部隊常用中草藥手冊：「微苦，涼。」. (九) 功能與主治(73) 清熱解毒，散瘀止血，利尿消腫。主治熱毒癰腫，咽喉疼痛，肺癰，腸癰，累癧，毒蛇咬傷，跌打損傷，吐血，衂血，血淋，水腫，腹水及癌症。 1. 南京民間藥草：「破血通經。」「消炎，散瘀，止血。治跌打傷，血痢。」 2. 廣西藥用植物圖誌：「消腫，止痛。治跌打，刀傷，瘡瘍。」 3. 南寧市藥物誌：「清熱解毒，消腫止痛。」 4. 江西草藥：「治腫瘤，闌尾炎，肝炎，肝硬化腹水，肺 5. 全國中草藥彙編：膿瘍。」. 30.

(45) 6. 福建藥物誌：「主治痢疾，吐血，血淋，肝炎，肺結核，淋巴腺炎，癌腫，胃痛，風濕關節痛，小兒高燒，白帶，乳腺炎，蛇頭疔，頸淋巴結核，角膜炎，瘡瘍腫毒，跌打損傷，狂犬及毒蛇咬傷。」 7. 浙江藥用植物誌：「治咽喉腫痛。」. (十) 採收加工(73) 種子繁殖的，從第 2 年起，每年的 5 月、7 月、 9 月都可收穫一次。分株繁殖的，在當年 9 月收穫第 1 次，以後每年可收穫 3 次。用刀齊地割取全株，揀除雜草，捆成小把，曬乾或陰乾。. 31.

(46) 二、半枝蓮之成分研究彙整全草主要含黃酮類、多醣、植物固醇、有機酸及其他類成分。黃酮類包括紅花素(carthamidin)，異紅花素(isocarthamidin)，高山黃芩素 (scutellarein)，高山黃芩苷(scutellarin)；多醣有半枝蓮多醣；此外還含有硬脂酸(stearic acid)、β-谷固醇(β-sitosterol)等(76)。半枝蓮的乙醇抽出物經分劃後的氯仿層含有 baicalin、baicalein、 wogonin 等成分(18)。其揮發油含有 menthol、hexahydrofarnesylacetone、 eugenol、globulol 等 41 種成分(16)。另據報導，從地上部分分離得到一個新的 diterpenoid (scuterivulactone D) (77)、rivularin (78)、 E-1-(4'-hydroxyphenyl)-but-1-en-3-one (79)、抗菌活性成分 apiginin 及 luteolin (80)，與抗肝癌的成分 pheophorbide a (81)。. 32.

(47) 三、半枝蓮之藥理作用 (一) 抗癌作用. 半枝蓮萃取物經體內試驗發現，對 S-180 mouse. sarcoma、U14 cervical carcinoma、solid hepatoma、W256 rat sarcoma 以及 Ehrlich′s sarcoma 等癌症均具有抑制癌細胞生長的作用(13)；對人類肺癌細胞 cell line A549 有抑制細胞生長的作用(14)。 (二) 免疫調節作用半枝蓮多醣在體外可促進刀豆球蛋白 A(Con A) 誘導的小鼠脾細胞淋巴細胞轉化。皮下注射給藥 1 星期後可明顯提高小鼠外周血淋巴細胞中酯酶陽性細胞的百分率，促進二硝基氯苯 (DNCB)誘導的遲發型變態反應，但大劑量注射 (200 mg/kg) 可抑制小鼠胸腺指數，對脾指數無影響(15)。 (三) 抑菌作用. 半枝蓮揮發油經體外試驗發現，對大腸桿菌等 20 種. 細菌具有抗菌作用(16)；從半枝蓮分離到二個抗菌活性成分 apiginin 及 luteolin 不管對 methicilin 具抗藥性的(methicilin-resistant)或對 methicilin 有效的(methicilin-sensitive) Staphylococcus aureus 株細菌均具有相當的抑制作用. (80). 。. (四) 解痙袪痰作用紅花素有較強的對抗由組織胺引起的平滑肌收縮作用，並有很好的袪痰作用(17)。. 33.

(48) 四、半枝蓮成分漢黃芩素(wogonin)之理化性質與藥理作用. (82). [異名]漢黃芩黃素、沃貢寧、次黃芩素 [結構式]. OCH3 HO. O. OH. [分子式及分子量]. O. C16H1205，284.27. [來源] 唇形科植物黃芩 (Scutellaria baicalensis Georgi) 根，顛黃芩 (S. amoena C.H. Wrignt) 根，半枝蓮 (S. rivularis Wallich) 根；夾竹桃科小錦蘭 (Anodendron affine (Hook. & Arn.) Druce) 莖。 [活性] 小鼠離體的小腸實驗表明有罌粟鹼樣的解痙作用，但作用較弱，約為罌粟鹼的 1/5。本品大鼠口服可降低乙醇所致的甘油三酯水準。還具有抗癌作用和利尿作用。. 34.

(49) 五、半枝蓮成分黃芩素(baicalein)之理化性質與藥理作用. (83). [異名]黃芩苷元、黃芩黃素 [結構式]. HO. O. HO OH. [分子式及分子量]. O. C15H10O5，270.25. [來源]唇形科植物並頭草 (Scutellaria scordifolia Fisch. ex Schrank) 根、葉，黃芩 (S. baicalensis Georgi) 根和葉中常以其 7-葡萄糖苷酸形式存在，S. galericulata Linnaeus 中則以其 7-鼠李糖苷形式存在，半枝蓮 (S. rivularis Wallich) 根。紫葳科木蝴蝶. (Oroxylum indicum (L.) Vent.) 種子、莖皮，及葉子中則以其 6葡萄糖苷和 6-葡萄糖苷酸形式存在。車前科大車前 (Plantago major Linnaeus) 葉。. [活性]具有抗炎作用，對豚鼠離體氣管過敏性收縮及整體運動過敏性氣喘有緩解作用，還能抑制過敏性水腫及炎症和降低小鼠耳毛細血管的通透性；急性利尿試驗表明，利尿作用強于漢黃芩素和黃芩苷；並能降低實驗大鼠肝的總膽固醇、游離膽固. 35.

(50) 醇與三酸甘油脂含量。據實驗證明，baicalin 與 baicalein 均具有抗焦慮作用(84)。. 36.

(51) 六、半枝蓮成分高山黃芩素(scutellarein)之理化性質與藥理作用. (85). [異名]黃芩配質、黃芩次苷配質、野黃芩黃素、印黃芩素、6-烴基芹菜素(6-hydroxyapigenin). [結構式] OH HO. O. HO OH. [分子式及分子量]. O. Cl5Hl006，286.25. [來源] 唇形科植物韓信草 (Scutellaria indica Linnaeus) 全草，半枝蓮 (S. rivularis Wallich) 全草；紫葳科木蝴蝶 (Oroxylum indicum (L.) Vent.) 葉、莖、皮，姊妹樹 (Miuingtonia hortensis ) 葉；另外，薔薇科珍珠梅 (Sorbaria arborea Schneid) 葉、花中含其 7-鼠李糖苷；菊科宿根矢車菊 Centaurea depressa Bieb.花中含其 5-葡萄糖酸。同時其配糖基存在於百合科日光蘭屬. (Asphodelus)；玄參科 Digitalis orientalis Lam.葉；和唇形科黃芩屬 (Scutellaria) 植物根部。. [活性] 具有抑制引朵-3-乙酸氧化酶和 ATP 生成和抑制穀實夜蛾 (Heliothis zea)幼蟲生長的作用。 37.

(52) 第三章實驗之部第一節. 八十七種中草藥及半枝蓮成分漢黃芩素(wogonin)、黃芩素. (baicalein)、高山黃芩素(scutellarein)對 LPS 與 INF-γ 誘發巨噬細胞 264.7 產生 NO 之抑制活性試驗一、實驗材料. (一) 實驗材料之收集本實驗材料部分收集自市面上或採集自本省各地，部分蒙瀋陽藥科大學姚新生教授提供蒐集自大陸各地，共有 87 種具有抗發炎、解熱及鎮痛作用中草藥。台灣蒐集之藥材經本校中國藥學研究所邱年永技正鑑定及比對藥用植物形態學或以生藥學書籍比對藥材之外部形態確立其基原，藥材樣本並存本校中國藥學研究所。姚新生教授提供之藥材經瀋陽藥科大學孫啟時、吳維春教授鑑定之。本實驗所採用之藥品漢黃芩素（wogonin）、黃芩苷（baicalin）購自日本松浦藥業株式會社；高山黃芩素（ scutellarein ）購自法國. Extrasynthese 公司。. (二) 實驗材料之抽提將中草藥實驗材料洗淨、切片後陰乾成飲片，以 50%乙醇室溫浸泡 72 小時後，用紗布過濾，收集濾液，如此反覆三次，合併濾液， 38.

(53) 在 40℃下減壓濃縮至乾，即得實驗材料 50%乙醇粗抽取物。. (三) 檢品之製備. （86）. 精確秤取實驗材料乙醇粗抽取物一至二毫克，精秤之材料以每毫克溶於二十微升 DMSO 製成檢品溶液。. (四) 細胞培養. （71）. RAW264.7 細胞為大鼠巨噬細胞樣細胞，以 Abelson leukemia virus 轉化，得自於 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)。培養於 Nutrient Mixture F-12 Ham (Ham’s F12) （Sigma, N4888, 500mL）培養基 [培養基添加 10%非動化胎牛血清 (heat-inactivated fetal bovine serum) (Gibco, Cat. No. 16000-036, 100mL), 1%穀胺醯酸 (L-glutamine) (Sigma, G7513, 20mL), 及 6% kanamycin sulfate (Wako, 117-00341, 1g)], 並置於 37℃ 二氧化碳培養箱中 (5%二氧化碳，95% 潮濕的空氣)。以塑膠培養皿（Falcon, No.1001; Becton Dickinson）培養細胞，每週繼代二次。. (五) 實驗試藥 Ham’s F-12 細胞培養基、穀胺醯酸購自 Sigma 公司（St. Louis, MO, USA），胎牛血清購自 Gibco BRL 公司（Grand Island, NY, USA）， 39.

(54) RAW264.7 購自於 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)，IFN-γ 購自 Genzyme 公司（Cambrige, MA, USA），LPS (Escherichia coli, O55: B5) 購自 Difco 公司（Detroit, MI, USA）， kanamycin sulfate、sulfanilamide、N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride、phosphoric acid、 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) 購自 Wako Pure Chemical Industries（Osaka, Japan），本實驗應用之化學藥品及試劑均為最純的商品。. (六) 實驗儀器倒立顯微鏡：NIKON（TMS Type 104）. CO2 培養箱：SANYO CO2 Incubator（5% CO2）冷凍離心機：HITACHI（himac CF 7D2）. Microplate reader(UV)：BIO-RAD Model 3550 Microplate reader 均質機：TAITEC（Microincubator M-36）抽液幫浦：日本理化學器材株式會社（NRK, UP2 型）. -30℃凍箱：SANYO（Medicool, MPR-411F） Pipet-Aid XP（用來吸放細胞） Eppendorf （Micropipet，微量取樣器）0.1~2.5，50~200，200~1000μL. 40.

(55) 多次分樣器（吸一次量為 2.5mL，每按一次可設定 50~250μL 的量）. 二、實驗方法. (一) 一氧化氮測定（NO Assay）86-88 （. ）. 每 200μL（調整細胞濃度 1.2×106 個/mL）細胞分注至 96 孔盤（Sumitomo Bakelite, #8096R, Tokyo）中，37℃、5%二氧化碳培養箱中培養一小時，加刺激物 LPS (Escherichia coli)（100ng/mL，Sigma）、. IFN-γ（0.33ng/mL，Genzyme），並加入樣本 DMSO 溶液 0.4μL，將 96 孔盤置於 37℃二氧化碳培養箱培養 16 小時，取出上清液 100μL (剩餘細胞留待 MTT assay 檢測細胞毒性)，加入 Griess reagent [0.1%. N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride 溶液（1mg/mL，Wako）、 1% sulfanilamide in 5% H3PO4 溶液] 各 50μL，呈色，十分鐘後以 Microplate Reader (BIO-RAD, Model 3550) 570nm 測吸光度，將亞硝酸根離子(Nitrite)定量。. (二) 細胞存活率測定（MTT Assay）89 （. ）. MTT 法是一種檢測哺乳類細胞存活和生長的方法。MTT 是一種能接受氫原子的黃色染料，化學名為. 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，商品. 41.

(56) 名是噻唑藍。哺乳類動物活細胞粒腺體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的 MTT 還原為難溶性的藍紫色結晶物（formazam）並沈積在細胞中，而死細胞則無此功能。DMSO 能溶解細胞中的紫色結晶物，用 ELISA 在 570nm 波長處測定其光吸收值，在一定細胞數量範圍內，MTT 結晶物形成的量與活細胞數量成正比，因此由吸光值可間接反應其活細胞數量，故可用於檢驗 NO 活性抑制藥物給藥後巨噬細胞存活率。當取完上清液 100μL 後，剩餘細胞溶液再加入 25μL MTT 溶液（2. mg/mL），置於 37℃二氧化碳培養箱培養 4 小時，將上清液倒掉，加入 150μL DMSO 將深藍色結晶物（formazan）混和均勻，等待數分鐘讓結晶物完全溶解，即可以 Microplate Reader (BIO-RAD, Model 3550). 570nm 測吸光度。. 42.

(57) 第二節半枝蓮及其成分 scutellarein 鎮痛作用之研究一、實驗材料. (一) 實驗材料之製備本實驗材料半枝蓮購自台中市漢強中藥行，經本校中國藥學研究所邱年永技正鑑定及比對藥用植物形態學或以生藥學書籍比對藥材之外部形態確立其基原。將半枝蓮以 50%乙醇室溫浸泡 72 小時後，用紗布過濾，收集濾液，如此反覆三次，合併濾液，在 40℃下減壓濃縮至乾，即得半枝蓮 50%乙醇粗抽取物(簡稱為 SREtOH)。本實驗所採用之藥品高山黃芩素（ scutellarein ）購自法國. Extrasynthese 公司，實驗當天以 tween 80 助溶，並用二次水新鮮配置。. (二) 實驗動物本實驗採用之動物為國家實驗動物中心、及樂思科生物科技公司所提供之 ICR 系雄性小鼠，體重 18～25 公克。飼養於溫度控制在23 ± 1℃的空調飼養室，採12小時亮12小時暗. (08：00燈亮，20：00燈暗)的燈光控制系統，食物與飲水之供應不予限制。實驗動物均依中華民國實驗動物學會出版之實驗動物飼養與管理指南之規定管理與照顧。. 43.

(58) (三) 實驗試藥 1.醋酸（acetic acid）購自Merck。 2.福馬林（formalin）購自日本試藥株式會社。 3.Indomethacin購自Sigma 。 4.Ethyl Ether購自日本島九藥品株式會社。. 二、實驗方法. (一) 扭體反應試驗（writhing response test）：將不同劑量之SREtOH（0.5、1.0 g/kg）口服給予及半枝蓮成分高山黃芩素scutellarein（10、20 mg/kg）腹腔注射給予，30分鐘後由腹腔注射1﹪醋酸溶液，小鼠每10g體重給予0.1 ml，用以誘發扭體反應，將小鼠置於觀察箱中，5分鐘後開始觀察，並以計數器記錄注射醋酸後5-15分鐘內，小鼠腹部因醋酸溶液引起的肌肉收縮，其所伴隨之扭體次數(62) ，並以indomethacin（10 mg/kg）為正對照組，於注射醋酸前20分鐘腹腔注射給藥。. (二) 福馬林試驗（formalin test）：福馬林誘發舔蹠反應試驗，採用經 Dubuisson 及 Dennis(68)修飾後的方法，將不同劑量之 SREtOH（0.5、1.0 g/kg）口服給予及 scutellarein. 44.

(59) （10、20 mg/kg）腹腔注射給予後 30 分鐘，用微量注射器以 27 號針頭，在小鼠右後足背，皮下注射 20 μl 的 5 % 福馬林溶液，立即將小鼠置入觀察箱中，觀察並每隔 5 分鐘記錄小鼠舔其足蹠（右後腳背注射福馬林的部位）之累積秒數，共記錄 30 分鐘. （90）. 。將 0-5 分鐘之. 累積舔蹠秒數稱為早期或第一相（early phase; first phase）之痛覺反應時間，而 20-30 分鐘之累積舔蹠秒數稱為晚期或第二相（late phase;. second phase）之痛覺反應時間。並以 indomethacin（10 mg/kg）為正對照組，於注射福馬林前 20 分鐘腹腔注射給藥。. 45.

(60) 第三節半枝蓮及其成分 scutellarein 對 λ-carrageenan 誘發足蹠發炎之抗發炎機轉研究一、實驗材料. (一) 實驗材料之製備同上一節鎮痛作用之實驗材料。. (二) 實驗動物同上一節鎮痛作用之實驗動物。. (三) 實驗試藥 1. 1,1,3,3-tetraethoxypropane (TEP)、thiobarbituric aicd (TBA)、butylated hydroxytoluene (BHT) 、 λ-carrageenan 、 indomethacin ：購自 Sigma 公司。. 2. Ethyl Ether購自日本島九藥品株式會社。 3. GSH-Px kits：Art. J68131，購自Randox。 4. SOD kits：Art. ORD04，購自Randox。 5. GSH-Rd kits：Art. 21023 購自Oxis Research。 6. NO kits：購自 Cayman。. (四) 實驗儀器 1、浮腫測定儀器 NK-101 CMP PLETHYSMOMETER. 46. (Muromachi)。.

(61) 2、酵素免疫分析儀：Powerwave X 340 Microplate。 Spectrophotometer (Bio-Tek instruments INC.) 3、高速冷凍離心機：HERMLE Z233MK-2 (組織檢品離心用)。 4、高速冷凍離心機：Backman GS-6R (血清檢品離心用)。 5、全自動生化分析儀：Roche 公司 COBAS MIRA plus。 6、均質機 POLYTRON PT 1200：造鑫企業有限公司。. 二、實驗方法. (一) 角叉菜膠致大鼠足蹠腫脹之影響用記號筆在小鼠右後肢踝關節周圍做一標記，將小鼠右後肢浸入浮腫測定儀器，測量正常足蹠容積後，分別在小鼠右後肢足蹠皮下注射1% λ-carrageenan混懸液（0.1 ml/隻）致炎. （33）. 。誘導2.5小時後，. 將小鼠分別以不同劑量之SREtOH（0.5、1.0 g/kg）口服給予及scutellarein （ 10 、 20 mg/kg ）腹腔給予，正對照組於誘導後 1.5 小時，皮下注射. indomethacin（10 mg/kg），給藥量皆為 0.1 ml/10g。給藥後隨後每隔1 小時皆按上法，各測一次足蹠容積，連續測7小時，記錄結果，並分別。計算誘導後每小時足蹠體積與誘導前個別足蹠之體積差（△V）. 47.

(62) (二) 角叉菜膠誘導小鼠足蹠腫脹作用機轉之探討分別在小鼠右後肢足蹠皮下注射 1 % λ-角叉菜膠混懸液 (50 μl/ 隻) 致炎。誘導 2 小時後，將小鼠分別以不同劑量之 SREtOH (0.5、1.0. g/kg) 口服給予及其成分 scutellarein (10、20 mg/kg)腹腔注射。正對照組於誘導後 1.5 小時腹腔注射 indomethacin (10 mg/kg)，給藥量皆為. 0.1 ml/10g。給藥後 1 小時，將動物犧牲，並取其肝大葉及腳組織，用於探討 SREtOH 及其成分 scutellarein 對肝及腳組織氧化傷害有無保護作用，並探討肝臟抗氧化酵素活性與腳組織 NO 及 MDA 含量變化。. (三) 肝組織抗氧化酵素活性測定： 1. SOD 之測定（super oxide dismutase assay）本實驗方法依據 1984 年，Kakkar 和 Viswanathan(91)提出之方法，取肝組織 0.5 g，加入 0.5 ml 0.9﹪的 Normal Saline，以均質機均質，取 300 μl 均質液於試管中，加入 1.8 ml 冷的二次去離子水，4℃、冷藏 15 分鐘，混合均勻。取 20 μl 的混合液加入 120 μl 0.1M Phosphate. buffer（CAPS 40 mmol/L、EDTA 0.94 mmol/L，PH7.0）均勻混合，最終，取 5 μl 混合液加入 340 μl Mixed Substrate1 （ xanthine 0.05 ，再加入 xanthine oxidase 呈色，混合均 mmol/L、I.N.T 0.025 mmol/L）勻後於波長 505 nm，反應溫度 37℃下測量吸光值，每隔 30 秒測量一. 48.

(63) 次，總共測量 3 分鐘，計算每分鐘吸光值變化速率，以多重校正曲線計算濃度. （92）. 。SOD 活性以單位時間內抑制 I.N.T 自動氧化速率為一. 單位（U），肝組織內 SOD 比活性以 U/mg protein 表示。. 2. GSH-Rd 之測定 (glutathione reductase assay) 本實驗方法依據 1966 年，Guntherberg 與 Rost 提出之方法. （93）. ，. 主要利用 NADPH 來測量 GSH-Rd 的活性， NADPH 在波長 340nm 下具有吸光值，而 NADPH 經由 GSH-Rd 作用下代謝變成 NADP，吸光值會下降，所以 GSH-Rd 活性與吸光值呈反比。取肝組織 0.5 g，加入 0.5 ml 0.9 % 的 normal saline 均質，取 10 μl 的均質液，加入 190 μl 的 precipitation reagent (trichloroacetic acid in. water)混合均勻，離心 3000g，4℃、10 分鐘。取上清液 50 μl 於 Cuvette 中，依序加入等量 50 μl 的 Buffer (potassium phosphate、. diethylenetriamine pentaacetic acid 、Lubrol 、PH 7.8)，Reducing agent (tris(2-carboxyethyl) phosphine in HCl)，Chromogen (1-methyl-4-chloro-7- trifluoromethyl- -quinolinium methylsulfate in HCl)，Color developer (NaOH in water)混合均勻，於波長 340 nm 下測量吸光值. （94）. ，肝組織內 glutathione reductase 活性以 U/mg protein 表. 示。. 49.