(一) DiI-AcLDL（Acetylated low-density lipoprotein）：
DiI-AcLDL（Acetylated low-density lipoprotein, Molecular Probes）是一種對 細胞無害的脂類化學物質，因為血管內皮細胞的表面有專一性的LDL receptor，
而DiI-AcLDL會經由血管內皮細胞的LDL receptor噬入細胞內，因此在螢光顯微 鏡下會發出螢光（Voyta, et al., 1984）。由於血管中的外被細胞（pericytes）與血 管平滑肌肉細胞（vascular smooth muscle cells）並不會噬入DiI-AcLDL，所以由 此可以分辨出血管內皮細胞（Garrick, 2000；Voyta, et al., 1984）。先將24 well plate 放入經滅菌的玻璃片，然後 coating 一層明膠，之後以滅菌水清洗後，待乾燥後 將適量的細胞種入有玻璃片的well中，以含10%血清的M199，25℃、5%CO
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培養 三天。之後選用Molecular probes公司的DiI-AcLDL，抽出先前的培養液，再以PBS 清 洗 後 ， 在24 well plate 中 加 入 1 毫 升 的 無 血 清 M199 培 養 液 （ 含 有 50μl 的DiI-AcLDL），在25℃、5%CO
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培養overnight，之後將培養液抽出，玻璃片以PBS 清洗，滴上甘油，放在載玻片上，以螢光顯微鏡觀察，利用FRET（Fluorescence Resonance Energy-Transfer, TE2000-U, Nikon, Japan）系統偵測螢光。(二) DAF（4,5-Diaminofluorescein）：
血管內皮細胞會產生出一氧化氮（NO），而DAF（4,5-Diaminofluorescein, Sigma, USA）能夠通過細胞膜去和NO結合發出螢光（Itoh, et al., 2000）。先將 24 well plate放入經火烤過滅菌的玻璃片，然後 coating 一層明膠，之後以滅菌 水清洗後，待乾燥後將適量的細胞種入有玻璃片的well中，以含10%血清的 M199，25℃、5%CO
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培養三天。抽出先前的培養液，再以PBS清洗後，在24 well plate中加入1毫升的無血清M199培養液（1毫升的培養液含有1μl的DAF，DAF購 自Sigma），在25℃、5%CO2
培養6小時，之後將培養液抽出，玻璃片以PBS清洗，滴上甘油，放在載玻片上，以螢光顯微鏡觀察，利用FRET系統偵測螢光。
(三) 聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)與定序：
將紅體的細胞先以含有10%血清的 M199 培養液培養在 T-25 培養瓶（flask）
（先前已coating 明膠）中，之後從細胞中抽取出 RNA 反轉錄成 cDNA 後，以 cDNA 為模板，加入 VEGF primers（此 primers 由實驗室已經定序出的鰻魚 VEGF 序列所設計出來），做出PCR 產物，設定的反應條件為：94℃反應 5 分鐘；94℃
反應30 秒，55℃反應 30 秒，72℃反應 30 秒，進行 35 個循環；72℃反應 7 分鐘，
最後維持在4℃下。以 2％的 agarose gel 跑電泳，經 UV 照射後得到 VEGF 的條 帶（band）。
VEGF 條帶經純化 DNA 後，利用載體（vector）接合（ligation）DNA 後，
再轉型（transformation）到勝任細胞（competent cell）中，塗在培養皿（plate）
上，37℃培養 16 小時之後，挑出 10 個可能含有重組載體的大腸桿菌菌落，並做
大腸桿菌菌落聚合酶連鎖反應（E. coli colonies PCR）去做篩選（screening），
並且利用 LB 培養液（含有 Ampicillin）去培養放大大腸桿菌菌落，抽取大腸桿 菌菌落之質體（plasmid）。將質體送至成大醫院定序，定序之後的序列在 NCBI VEGF f1： ATGAACTTTGCTGCCAGCTT
VEGF R340： AATTGTGTTGCGTCACATGC
(四)免疫染色法（Immunostaining）：
先將24 well plate放入經滅菌的玻璃片，然後 coating 一層明膠，之後以滅 菌水清洗後，待乾燥後將適量的細胞種入有玻璃片的well中，以含10%血清的
（Horseradish peroxidase-tetramethylbenzidine）系統於相位差顯微鏡中觀察染色 情況，具VEGF的胞器呈藍色。