鰻魚紅體細胞細胞培養系統之建立與其血管內皮生成因子表現

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目錄中文摘要………1 英文摘要………....…3 前言………...……….…5 一、血管內皮細胞的結構和功能……….………...….5 二、血管內皮細胞功能異常……….6

三、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor)和血管新生 (Angiogenesis)………...7 四、影響 VEGF 表現的因子………..………..…..9 (1)、缺氧（Hypoxia）………..…..………….9 (2)、細胞激素（Cytokines）和生長因子（growth factors）……….……….10 (3)、細胞分化（differentiation）和細胞轉型（transformation）…….….…………..10 (4)、性類固醇（sex steroids）……….….………..11 五、不同種類血管內皮細胞系統之介紹……….……….………..11 六、為什麼用鰻魚當作模型……….………..12 實驗目的………..14 實驗材料………..15 儀器………..16 實驗的方法………..17

一、初代細胞培養（Primary cell culture）……….………..17

(一)、內皮細胞的取得……….17

(二)、細胞培養之培養液配製（culture medium）……….….17

(三)、細胞數目的測定……….18

(四)、藥品的配置……….18

(2)

(2)、睪固酮（Testosterone）的配製………….……….18

(3)、黃體激素（Progesterone）的配製………..………….….18

(4)、人類絨毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin）的配製………...…19

(5)、氯化鈷（CoCl2）的配製………….………..………19

(6)、多巴胺（Dopamine）的配製……….…….……19

(7)、鹼性纖維母細胞生長因子（basic Fibroblast growth factor）的配製…..…...19

二、內皮細胞的證明………..……19

(一)、DiI-AcLDL（Acetylated low-density lipoprotein）……….…….…..19

(二)、DAF（4,5-Diaminofluorescein）……….…………20

(三)、聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)與定序……….…….20

(四)、免疫染色法（Immunostaining）………....………..21

三、細胞對藥物處理後的生長代謝之測定……….………..22

(一) CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay………..…….22

四、血管內皮生長因子（VEGF）基因表現的分析……….………..………..22

(一)、藥物處理細胞………..……….….…….22

(二)、抽取 totalRNA………..…….…….…….23

(三)、cDNA 的製備（Revese Transcription）……….……23

(四)、即時定量聚合酶連鎖反應（real-time polymerase chain reaction ）………..24

五、統計方法………..26

實驗結果……….….27

一、鰻魚紅體細胞培養系統的建立………..……..27

(1)、猪皮膚之明膠（Gelatin from Porcine skin）當基質………..…….…….27

(2)、鮭魚皮膚之明膠（Gelatin from Cold fish skin）當基質……….………..27

(3)、猪皮膚明膠與鮭魚皮膚明膠對鰻魚紅體細胞生長的比較………..…...….….28

二、血清對鰻魚紅體細胞存活的影響………....………...28

(3)

(2)、血清濃度對鰻魚紅體細胞 VEGF 表現的影響………..……….29

(3)、VEGF 抗體對鰻魚紅體細胞生長的影響………..……….……….29

三、鰻魚紅體之血管內皮細胞的證明………..………..…..…..30

(1)、DiI-AcLDL（Acetylated low-density lipoprotein）……….….…....30

(2)、DAF（4,5-Diaminofluorescein）………..……….30

(3)、PCR 的證明……….…31

(4)、免疫染色法（Immunostaining）………..……….….………31

(5)、即時定量聚合酶連鎖反應 VEGF 和 28S 的標準曲線……..……….…….32

四、刺激因子對鰻魚紅體細胞生長的影響……….……….32

(一)、性類固醇（Sex steroids）對鰻魚紅體細胞的 VEGF 基因表現之影響………..32

(1)、雌二醇（Estradiol，簡稱E2）的處理……….…….32

(2)、睪固酮（Testosterone，簡稱 T）的處理………..33

(3)、黃體激素（Progesterone，簡稱P4）的處理………..…….34

(二)、人類絨毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin）………..34

(1)、人類絨毛膜促性腺激素對鰻魚紅體細胞代謝的影響………...……34 (2)、人類絨毛膜促性腺激素對鰻魚紅體細胞的 VEGF 基因表現之影響……....35 (三)、缺氧對鰻魚紅體細胞之影響……….35 (1)、氯化鈷（CoCl2）對鰻魚紅體細胞生長的影響……….………..35 (2)、氯化鈷對鰻魚紅體細胞的 VEGF 基因表現之影響……….….…..36 (四)、多巴胺（Dopamine）對鰻魚紅體細胞的 VEGF 基因表現之影響……….….37 (1)、多巴胺對鰻魚紅體細胞生長的影響………..……….37 (2)、多巴胺對鰻魚紅體細胞的 VEGF 基因表現之影響……….…..37

(五)、鹼性纖維母細胞生長因子（basic Fibroblast growth factor）對鰻魚紅體細胞 VEGF 基因表現之影響...…….38

討論……….….39

(4)

二、鰻魚紅體細胞與血清………..………….40 三、鰻魚紅體的血管內皮細胞之證明………..………….41 四、VEGF 的刺激因子對鰻魚紅體細胞 VEGF 基因表現之影響……….…..43 (一)、缺氧（Hypoxia）對鰻魚紅體細胞 VEGF 的影響………..……..43 (二)、性類固醇對鰻魚紅體細胞 VEGF 的影響……….44 (1)、雌二醇對鰻魚紅體細胞 VEGF 的影響………..………….45 (2)、睪固酮對鰻魚紅體細胞 VEGF 的影響………..……….46 (3)、黃體激素對鰻魚紅體細胞 VEGF 的影響………..………….48 (三)、hCG 對鰻魚紅體細胞 VEGF 的影響……….………...48 (四)、多巴胺對鰻魚紅體細胞 VEGF 的影響………..……...50 (五)、bFGF 對鰻魚紅體細胞 VEGF 的影響………..……..50 結論………..………52 參考文獻………..…....54 圖………..64 附錄………..95 附圖………103

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圖目錄圖一鰻魚紅體細胞在猪皮膚明膠生長實驗……….……….64 圖二鰻魚紅體細胞在鮭魚皮膚明膠中生長實驗……….……….65 圖三、鰻魚紅體細胞在不同基質中生長實驗………..….………….66 圖四不同濃度的血清細胞代謝實驗……….……….67 圖五不同濃度的血清對鰻魚紅體細胞VEGF基因的影響……….…..68 圖六抗鰻魚VEGF血清對鰻魚紅體細胞代謝的影響……….…..69 圖七DiI-AcLD染色實驗..………...70 圖八DAF染色實驗………..…71 圖九VEGF基因電泳圖………...72 圖十兔子抗鰻魚VEGF血清染色實驗……….…..73 圖十一VEGF和28S標準曲線……….……74 圖十二不同濃度的雌二醇處理鰻魚紅體細胞………..……75 圖十三10-7 M雌二醇短時間處理鰻魚紅體細胞………....……76 圖十四Tamoxifen和雌二醇實驗………..…..77 圖十五不同濃度睪固酮處理鰻魚紅體細胞………..…78 圖十六10-7 M睪固酮短時間處理鰻魚紅體細胞………..……..…79 圖十七10-7 M黃體激素短時間處理鰻魚紅體細胞………..………..80 圖十八不同濃度的hCG處理細胞代謝實驗……….….…81 圖十九hCG處理鰻魚紅體細胞的是否死亡測試………..82 圖二十10IU的hCG處理鰻魚紅體細胞……….….…83 圖二十一10IU的hCG短時間處理鰻魚紅體細胞……….….84 圖二十二1IU的hCG短時間處理鰻魚紅體細胞………85 圖二十三不同濃度的氯化鈷鰻魚紅體細胞………..86 圖二十四10-7 M氯化鈷連續六天處理鰻魚紅體………87

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圖二十五氯化鈷短時間處理鰻魚紅體細胞………..88 圖二十六10-7 M氯化鈷短時間處理鰻魚紅體細胞………89 圖二十七10-7 M 雌二醇加上不同濃度氯化鈷處理鰻魚紅體細胞………..90 圖二十八不同濃度多巴胺處理鰻魚紅體細胞細胞代謝分析………..…91 圖二十九不同濃度的多巴胺處理鰻魚紅體細胞……….….…92 圖三十10-7 M多巴胺短時間處理鰻魚紅體細胞……….…….……..93 圖三十一不同濃度的bFGF處理鰻魚紅體細胞………..….…..94

(7)

附錄

附錄一、藥品………95 附錄二、內皮細胞的產物與相關功能………..……….……....97 附錄三、血管生長因子（angiogeneic acivators）及血管抑制因子（angiogeneic inhibitors）………98 附錄四、分離內皮細胞之種類及來源(Species and sources for isolating EC)……..99 附錄五、（A）部份鰻魚 VEGF 基因序列………...…100 附錄六、（B）部份鰻魚 VEGF 基因轉譯氨基酸序列比對……….….101 附錄七、鰻魚紅體細胞 VEGF 抗體染色… ……….….102

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附圖

附圖一、血管新生（angiogenesis）的過程...103 附圖二、（A）VEGF 家族和 VEGF 受體………....104 附圖二、（B）VEGF 信息傳遞路徑……….……….104

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鰻魚紅體細胞細胞培養系統之建立與其血管內皮生成

因子表現

指導教授：黃永森博士國立高雄大學生物科技研究所學生：黃文良國立高雄大學生物科技研究所摘要血管內皮位於血管內側的位置，瞭解內皮細胞的生物功能是發展預防和治療心血管、腦血管和腎臟方面疾病、動脈硬化的基礎。自從1980 年代開始，血管內皮細胞的結構和功能漸漸被瞭解。血管內皮細胞就像一個屏障，將血液以及組織分開，不但可以選擇性的讓物質通透、還分泌一些活性因子，例如NO（Nitric Oxide）、PGI2（prostacyclin）、 bFGF（basic fibroblast growth factor）、VEGF（vascular endothelial growth factor）等；它們不僅參與正常生理上的自我平衡(vascular homeostasis)，而且也參與像血栓、發炎反應、血管重整(vascular wall remodeling) 等病理的進程，其中最重要的生長因子便是bFGF 和 VEGF。VEGF 不但是血管通透因子（vascular permeability factor），也是血管生長因子，它的活化會刺激脈管生成(vasculogenesis)和血管新生(angiogenesis)，因此 VEGF 在調控血管內皮細胞生理中扮演著關鍵性的角色。本論文主要以鰻魚為研究模型，取其紅體(rete mirabile)上的血管內皮細胞，嘗試建立細胞培養系統，並且以的不同 VEGF 刺激因子刺激細胞，並抽取細胞的RNA，經由 real-time PCR、測其 VEGF mRNA 表現的變化。

由實驗結果發現，哺乳類和魚類基質對鰻魚紅體細胞生長都不影響，主要影響鰻魚紅體細胞的生長因素是血清，血清濃度與鰻魚紅體細胞代謝率成正相關。並且經實驗證實血管內皮細胞約佔鰻魚紅體細胞的 60%-80%。氯化鈷和多巴胺

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不會影響鰻魚紅體細胞的代謝，但是hCG會造成鰻魚紅體細胞死亡，詳細的原因還不清楚。不同濃度雌二醇和睪固酮處理鰻魚紅體細胞六天，雌二醇和睪固酮的濃度在 10-9M會刺激鰻魚紅體細胞的VEGF基因表現；短時間以雌二醇、睪固酮和黃體激素處理鰻魚紅體細胞，雌二醇和睪固酮在2 至 3 小時開始促進鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現，黃體激素則在 1 至 2 小時開始促進鰻魚紅體細胞VEGF 基因的表現；此外，以抑制雌二醇藥物Tamoxifen處理鰻魚紅體細胞，其結果顯示Tamoxifen似乎會抑制由雌二醇引起的鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現。hCG會抑制鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現，但是給予較高濃度的血清，hCG似乎會短暫刺激鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現，但隨後hCG又抑制鰻魚紅體細胞VEGF 基因的表現，原因仍然不清楚。氯化鈷在第0.5 小時就會刺激鰻魚紅體細胞VEGF 基因的表現，如果氯化鈷加上 10-7M雌二醇，在 10-5M氯化鈷就會刺激鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現。多巴胺長時間處理鰻魚紅體細胞，在 10-7M和 10-8M的濃度會刺激鰻魚紅體細胞的VEGF基因表現，多巴胺在短時間處理鰻魚紅體細胞，在2 至 3 小時開始促進鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現。不同濃度的bFGF處理鰻魚紅體細胞，bFGF在 10-7M和 10-8M能刺激鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現。 關鍵字：VEGF、bFGF、紅體、脈管生成、血管新生、性類固醇、Tamoxifen、 hCG、雌二醇、氯化鈷、睪固酮、多巴胺、黃體激素。

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Cell culture of eels (Anguilla japonica) rete mirabile

and the regulation of its vascular endothelial growth

factor expression

Advisor: Dr. Yung-Sen Huang Institute of Institute of Biotechnology

National University of Kaohsiung

Student: Wen-Liang Huang Institute of Institute of Biotechnology

National University of Kaohsiung

Abstract

Endothelial cells are located in the innermost layer of the blood vessels. Since 1980s, endothelial cells are well studied, the structure and function of endothelial cells have been understood. Endothelial cells separate the bloodstream from tissues as a barrier, meanwhile they also produce factors, such as Nitric Oxide (NO), prostacyclin (PGI2), basic fibroblast growth factor (bFGF), vascular endothelial growth factor (VEGF). So, endothelial cells not only participate in normal physiology of vascular homeostasis, but also in the process of pathologenesis, such as thrombus, inflammation response, and vascular wall remodeling. The most two important growth factors to endothelial cells are bFGF and VEGF. VEGF is not only a vascular permeability factor, but also is a growth factor to blood vessel. Indeed, vasculogenesis and angiogenesis areminly regulated by VEGF.

In the study, a primitive vertebrate, Japnese eel (Anguilla japonica), is chosen as the research model. We set up a rete mirabile cells culture system, and the cells are treated with various factors, then the levels of VEGF mRNA were measured by RT

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real-time PCR. The cell culture substrates from either mammal or fish dose not have any significant difference to in vitro eel rete mirabile cells. while the primary factor to influence mirabile cells is the fetal calf serum (FCS). It shows a positive relation between the FCS concentration and the endothelial cells’ metabolic rate. By various methods and chemicals, it has been estimated that the endothelial cells comprise about 60%-80% of the total eel rete mirabile cells. Chlorine cobalt (CoCl2) and dopamine (DA) do not have any significant effect to the endothelial cells’ metabolic rate, but huaman chorionic gonadotropin (hCG) leads the cells to die. The cells are treated with different concentrations of estradiol (E2) and testosterone (T) for 6 days, it seems that 10-9 M of E2 and T stimulate VEGF gene expression . The cells are treated with E2, T and progesterone (P4) in a short term, the results show that both E2 and T stimulate VEGF gene expression in 2 - 3 hours while P4 in 1 - 2 hours. However, the positive effects of E2 is inihibited by Tamoxifen (an anti-estrogen). The hCG suppresses VEGF gene expression in the lower FCS condition.In the other hand,

it seems that under higher concentration of FCS, hCG sitimulates VEGF gene by expression transient 10-7 M, but not 10-5 M, of CoCl2 stimulates the cell expression of VEGF in 30 minuites. If cells treated with both 10-7 M of E2 and 10-5 M of CoCl2 the expression of VEGF gene is stimulated. We also treated eel rete mirabile cells with DA. In a long term, it shows that 10-7 M -10-8 M of DA stimulate the VEGF gene expression. DA stimulated VEGF gene expression in 2-3 hours. the expression of VEGF is stimulated by 10-7 M -10-8 M of bFGF.

keywords：VEGF, bFGF, rete mirabile, vasculogenesis, angiogenesis, sex steroids, Tamoxifen, hCG, estradiol, chloride cobalt, testosterone, dopamine, progesterone.

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前言：

血管內皮細胞（vascular endothelial cells）是位於血管壁內側單層扁平多邊形的細胞，連續延展於整個血管內腔表面。血管內皮細胞是人類身體中最大的分泌組織，一個成人的內皮細胞數大約有1×1013個（Sumpio et al., 2002），完全鋪張開來後估計約有7 平方公尺（Cines et al., 1998），而所有的內皮細胞的總重量約 可達到2 公斤重（Ramesh and Ashok Shenoy, 2003）。血管內皮細胞具有廣泛且多樣的功能、是調控血管生成（angiogenesis）最重要的調控者（Michiels, 2003）。 1980 年代開始、血管內皮細胞的結構和功能已廣泛的被研究，而且血管內皮細胞具有廣泛且多樣的功能，在不同物種、不同組織中，血管內皮細胞有不同的功能，例如人類心臟血管內皮細胞和腦的血管內皮細胞功能不同（Tiziana and Lucia, 2000）。血管內皮細胞於活體內（in vivo）正常狀況下複製速度極為緩慢，幾乎 呈現靜止的狀態，基本上是處於一種最終級分化之穩定狀態；大部分血管內皮細胞在成年人之中的細胞週期(cell cycle)變化非常緩慢，從數個月到數年都有；但是，血管內皮細胞在子宮內膜（endometrium）和卵巢黃體（corpus luteum）中會快速分裂，一周內有兩次，和而腫瘤中的血管內皮細胞變化的時間約一至兩週有兩次（Bachetti and Morbidelli, 2000）。雖然血管內皮細胞幾乎呈現靜止的狀態，但若細胞若受到傷害，在數天內會改變它們的型態（phenotype）、移行和增生去治療損傷的部位。（Bachetti and Morbidelli, 2000）。

一、血管內皮細胞的結構和功能：

血管內皮細胞的結構和功能在支持血管壁當作血管支撐的骨架和循環的功能上是非常重要的，血管內皮細胞就像是屏障（barrier）一樣，具有選擇性通透的功能，而且能控制和運送大分子和小分子（Sumpio et al., 2002）。血管內皮細胞與組織之間、或血管內皮細胞與血管內皮細胞之間的細胞間連結（intercellular junction）可以區分至少兩種細胞接合的形式，分別為緊密連接

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（tight junctions，TJs）和附著連接（adherens junctions，AJs）（Dejana et al., 1995； Staddon and Rubin, 1996）。一般來說，附著連接為普遍存在血管內皮細胞之間的一種形式，而緊密連接則是血管內皮細胞發展出來非常重要的一種形式，例如在腦中的血腦障壁，在腦部的血液和腦部的組織之間保護著大腦，細胞間的連結必須非常簡單而且完全密封，因此緊密連接常存在於原始的組織中（Lampugnani and Dejana, 1997）。

血管內皮細胞在血流調控、血壓控制、凝血作用過程中均具重要的角色（Ramesh and Ashok Shenoy, 2003）。血管內皮細胞本身具有各種不同的代謝和合成作用的生理功能性，同時，血管內皮細胞具有旁泌作用（paracrine）和自泌作用（autocrine），會影響血管平滑肌細胞或者是血液中血小板和白血球，使血管放鬆或是產生發炎反應（Sumpio et al., 2002）。

血管內皮細胞能夠釋放出多種抗凝血因子和溶血因子，例如前列環素 (prostacyclin，簡稱PGI2)、一氧化氮（Nitric oxide，簡稱NO）、組織血漿蛋白原活化劑(tissue plasminogen activator，簡稱tPA) （見表一）（Ramesh and Ashok Shenoy, 2003）。血管內皮細胞也被認為是一種免疫組織，如果血管內皮細胞暴露在不同組織相容性抗原（histocompatibility antigens）和血型抗原（blood group antigen）則會產生免疫反應（Ramesh and Ashok Shenoy, 2003）。

二、血管內皮細胞功能異常：

血管內皮細胞因為直接與血液循環接觸，因此、可能造成血管內皮細胞異常的原因就會非常多，而且互為因果，如高血壓、動脈硬化、其他危險因子有關。其他有關危險因子包括脂肪代謝異常或是高膽固醇血症（hypercholesterolemia）、胰島素抗敏性（insulin resistance）、或是醣類代謝異常和抽煙（Kingwell, 2000）。低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，簡稱LDL）被血管內皮細胞吞噬後易被氧化，結果增加超氧陰離子（superoxide anion）的產

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生，超氧陰離子會與一氧化氮結合產生過氧亞硝基物（peroxynitrite），而其結果會刺激白血球黏附到血管內皮細胞上，引發發炎反應，而其發炎反應最後造成動脈粥狀硬化（atherogenesis）（Kingwell, 2000）。血管內皮細胞若發生異常時，會誘導血管產生不同生長因子（見表一）（Pohlman, 2000）。而生長因子的釋放可能會刺激或抑制血管平滑肌細胞的移行（migration）和增生（proliferation），事實上，如果血管內皮細胞被破壞會造成血管收縮和血管舒張的功能失衡，進一步造成血管方面的疾病，例如像是心肌梗塞和中風（Furchgott and Zawadzki, 1980）。

三、血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor）

與血管新生（Angiogenesis）：

血管新生（angiogenesis）是指由已經存在血管再長出新的血管來，在血管新生的過程中，微血管網進行重整並形成動脈和靜脈；而脈管生成（vasculogenesis）是指胚胎發育時，最初生成的新血管而言（Choi, 1998）。血管新生的特徵包括基底膜酵素的降解、血管內皮細胞的移行、增生和管狀形成（tube formation）（Klagsbrun and D’Amore, 1996）。「血管新生」在腫瘤的生長與糖尿病所引起的血管病變，是其病理過程重要特徵。因此、研究調控血管新生的機制成為目前研究特定疾病的重點課題。

刺激血管新生的因子非常多，目前被發現而且證實的刺激血管新生因子包括 FGF-1、FGF-2 、VEGF、TNFα、angiogenin、TGFα、TGFβ、PD-ECGF、IL-8，另外也有血管新生的抑制因子像是 thrombospondin、cartilage-derived inhibitor、 platelet-factor 4、angiostatin、interferons-α 和 interferons-β（見表二）（Klagsbrun and D’Amore, 1996；Ramesh and Ashok Shenoy, 2003）。

血管新生一詞最早是由Steiner 在西元 1900 年所提出，但是運用在癌症治療上卻是在西元1971 年時，由 Folkman 所提出的腫瘤需靠血管新生才能存活的理

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論，同時Folkman 也提出腫瘤會分泌某種物質去刺激血管新生，因此當時 Folkman 將此物質取名為腫瘤血管新生因子（Tumor angiogenesis factor，簡稱 TAF）（Folkman, 1971）。1977 年時 Dvorak 觀察到腫瘤會分泌一種物質讓腫瘤的血管通透性增加，纖維蛋白原（Fibrinogen）會從血管液滲漏到腫瘤組織中，因此當時 Dvorak 便命名此種物質為血管通透因子（Vascular permeability factor，簡稱 VPF）。直到 1989 年，由 Ferrara 純化出能促進血管新生的物質，並且命名為血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，簡稱 VEGF）（Ferrara and Henzel, 1989）。後來證明，不管是 Folkman、Dvorak 或是 Ferrara，他們所發現能促進血管新生的物質，都是同一種物質。而此物質也是能刺激血管新生的眾多物質中，除了纖維母細胞生長因子（fibroblast growth factor，簡稱 FGF）之外，刺激血管新生最重要的一個因子，此因子後來就稱為血管內皮生長因子（Ferrara and Henzel, 1989；Pepper et al., 1992）。

血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管內皮細胞生長和存活最重要的因子之一，是調控血管內皮細胞增生、血管新生、脈管生成和血管通透（permeability）最主要的一個調控因子。（Klagsbrun and D’Amore, 1996）。許多細胞均會分泌血管內皮生長因子，包括血管內皮細胞、腫瘤細胞、吞噬細胞、T 細胞、平滑肌細胞、腎臟細胞、間質細胞、角質細胞、星狀細胞、成骨母細胞等（Klagsbrun and D’Amore, 1996）。血管內皮生長因子家庭成員包含 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D 和 PIGF（placenta growth factor）。其分子結構是由單一VEGF 的基因（含有八個 exon）所組成，VEGF mRNA 會經由選擇性剪裁（alternative splicing），剪裁成多個不同長短之 mRNA，這些不同長短之mRNA 會編碼（encode）出不同長度 VEGF 的胺基酸序列，包含 VEGF121、 VEGF165、VEGF189 和 VEGF206（Tischer et al., 1991；Houck et al., 1991； Houck et al., 1992）。其中以VEGF165 的量最多，普遍存於各已研究生物之中（Zachary and Gliki, 2001）。這些大小不同的血管內皮生長因子主要的區別是在第六和第七個 exon 是否有與肝素(heparin)結合以及是否具有肝素-硫酸鹽基結合的功能區

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（heparan-sulfate binding domains）（Neufeld et al., 1996）。血管內皮細胞藉由與酪胺酸激酶受體(Tyrosine kinase receptor)的結合而具有活性，這些酪胺酸激酶受體包括像是KDR/Flk-1、Flt-1 和 Flt-4（Klagsbrun and D’Amore, 1996）。

因此，近年來陸續發現血管內皮生長因子和血管內皮生長因子接受器的結構和生物活性，在調控血管內皮生長因子的表現上非常重要，而且對於血管的生長扮演重要的角色。胚胎發育時血管的生成與血管內皮生長因子的量有很大的關係，研究指出，老鼠在胚胎時，兩條 VEGF 的對偶基因若其中一條 VEGF 的對偶基因缺失時，血管發育會產生異常，而且受精 11 天後胚胎便無法存活（Carmeliet et al., 1996），若老鼠的血管內皮生長因子受體（VEGF receptor）基因缺失也會造成懷孕早期的胚胎死亡。但是這樣並無法很精確解開或明瞭VEGF 經過VEGF receptor 之間信息傳遞（signal transduction）所造成血管內皮細胞的行為，因此Drake 等人利用雞的胚胎研究證實，VEGF 很顯著的增加血管內皮細胞突出的活動力（protrusive activity），VEGF 和 VEGF receptor 的信息傳遞調控血管內皮細胞突出的活動力，是決定血管形態改變的重要關鍵，並指出 VEGF 的功能是啟動血管形態改變的因子（Drake et al., 2000）。

四、影響 VEGF 表現的因子：

目前已知影響 VEGF 基因表現的因子有很多，可以歸成幾類，分別是缺氧（Hypoxia），細胞激素（cytokines）和生長因子（growth factors），細胞分化（differentiation）和細胞轉型（transformation），性類固醇（sex steroids）等（Ferrara and Davis-Smyth, 1997）。

(1) 缺氧（Hypoxia）

：

缺氧是調控VEGF 基因表現最主要的因子，不管在活體內（in vivo）或是活 體外（in vitro），缺氧都會增加 VEGF 基因的表現；許多證據指出，缺氧能增加 VEGF 的產生，Yoshino 等人（Yoshino et al., 2003）證實缺氧（hypoxia）是血管

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新生因子最主要的誘導者，它能誘導VEGF 和 interleukin-8 的增加；另外在猪卵巢濾泡的顆粒細胞（swine granulos cell）之中，缺氧也會造成 VEGF 的上升（Giuseppina et al., 2004）；也有報告指出，缺氧會誘發 VEGF mRNA 的轉錄作用，其中包括我們所知的特異性轉錄因子 (specific transcription factor)-HIF(hypoxia-inducible factor)(Wang et al., 1995)。

(2) 細胞激素（Cytokines）和生長因子（growth factors）

：

許多細胞激素或生長因子會誘發 VEGF 基因或 VEGF 蛋白質的表現。細胞激素是很類似荷爾蒙（hormone）的一種物質，不僅結構式像，連作用的方式也頗為相像；當血管內皮細胞受到傷害時，會分泌出細胞激素，這些細胞激素例如 tumor necrosis factor-α（TNF-α）、interleukin-1α（IL-1α）、interleukin-8（IL-8）等，因為白血球上有細胞激素的受體（receptors），因此白血球與細胞激素結合，引發一連串的發炎反應（Detmar et al., 1994；Rietschel et al., 1996）。很多生長因子會誘發 VEGF 基因或 VEGF 蛋白質的表現，例如血清（serum）、表皮生長因子（epidermal growth factor；EGF）和角質細胞生長因子（keratinocyte growth factor）都能誘發VEGF mRNA 表現（Ferrara and Davis-Smyth, 1997）。

(3) 細胞分化（differentiation）和細胞轉型（transformation）

：

細胞分化和細胞轉型在調控VEGF 基因表現時也扮演著重要角色，例如 3T3 細胞株從 preadipocytes 分化成 adipocytes 時，會誘發 VEGF 基因的表現；C2C12 細胞株分化時也會誘發VEGF 基因的表現，但是非癌化的 PC12 細胞株分化會抑制VEGF 基因的表現（Ferrara and Davis-Smyth, 1997）。

(4) 性類固醇（sex steroids）

：

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合成而來的，而主要的合成地點在腎上腺皮質和生殖腺，其中包含雌激素、黃體激素、雄性素等（Suzukiet al., 2003）。女性生殖器官包含卵巢、子宮和胎盤，這些是成人組織能中少數血管新生非常旺盛的部位，這些部位需要某些調控因子去調控，而VEGFs 和 FGFs 便是調控女性生殖器官血管新生最重要的因子（Reynoldset al., 2002）。性類固醇在血管新生功能上扮而演著多種角色，研究性類固醇影響血管方面的功能從1940年代就開始，例如在多種臨床上發現雌激素會有保護心血管功能的效果，然而性類固醇在血管各種功能上詳細的機制仍然還不是很清楚。性類固醇對血管內皮細胞的作用機制有兩種，一種是性類固醇進入到細胞質（cytoplasm），與細胞質中游離的受體結合，直接進入細胞核內去調控基因的表現；但是最近報告指出，性類固醇也會經由血管內皮細胞的細胞膜上特異性的受體（specific receptor）而作用（Suzuki et al., 2003），經由細胞膜上的受體引發一連串的信息傳遞（signal transduction），當性類固醇接合到受體上時，會活化G protein（GTP binding protein）並產生GTP，進行一連串的信息傳遞（Suzuki et al., 2003）。

VEGF是調控女性生殖器官血管新生最重要的因子之一，故性類固醇對於 VEGF基因表現的關聯應相當密切。事實上，利用雌二醇（estradiol）處理母鼠會讓母鼠子宮VEGF mRNA表現增加（Ma, et al., 2001）。

五、不同種類血管內皮細胞系統之介紹：

由於近年來細胞培養技術的進步，再加上各種內皮細胞表面抗原報告的發表，多種血管內皮細胞已經可以由不同種類生物的特定器官中分離出來培養，而這些血管內皮細胞也廣泛的被使用於實驗系統之中（表三）（Mombouli et al., 1999；Ferrari et al., 1998；Fajardo, 1989；Bachetti and Morbidelli, 2000）。其中人 類臍帶靜脈血管內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell；HUVEC)和牛主動脈血管內皮細胞(Bovine aortic endothelial cell；BAEC)為最常用的培養系統。

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人類臍帶靜脈血管內皮細胞是因為其組織來源之簡便以及與人類疾病直接相關之特性，而牛主動脈血管內皮細胞則是因為其易於分離與生長之特性，因此廣泛被利用。血管內皮細胞於培養狀況下會形成如碎石般緻密之單層狀況(cobble stone like monolayer)，與其於血管壁上之型態頗為相似，並保留了大部血管於體內之生理特性，包括對物質之選擇性滲透調控以及極緩慢之複製週期。

六、為什麼用鰻魚當作模型：

鰻魚屬於鰻鱺科(Anguillidae)，鰻屬(Anguillus)，是一種非常特殊的魚類，全世界總共有十八種(Castle and Williamson, 1974)。鰻魚因為奇特的生活史，一直以來對鰻魚的生態都是個謎，因此全世界對其研究從未間斷過；台灣地區鰻魚的種類有四種，最常見者為日本鰻( Anguilla japonica) 及鱸鰻(A. marmorata)；但是西里伯斯鰻(A. celebesensis) 及短鰭鰻(A. bicolor pacifica) 則比較罕見。鰻魚在演化上屬於非常原始的低等脊椎動物，其生長到不同時期時會有變態發生而改變外觀；跟鮭魚有著相反的生活史，鰻魚會在河川中長大、成熟後洄游到海洋中產卵，一生只產一次卵，產卵之後就死亡。鰻魚在卵孵化之後，最先形成柳葉鰻 (Letocephalus)、然後變態成玻璃鰻(glass eel)、再來是鰻線(elvers)、黃鰻(yellow eel) ，最後再變態成銀鰻(silver eel) 而成熟後降海產卵（Tzeng et al., 2000）。

就是因為這麼特殊的生活史和變態的產生，使鰻魚體型和外觀改變，而鰻魚的各項生理機能也隨之改變，最明顯的即是雌鰻魚卵巢發育，因為發育成銀鰻準備降海繁殖，因此卵巢也跟著發育成熟而長滿腹腔兩側，而且因為血管新生，可以觀察到鰻魚的卵巢裡佈滿微血管(Muller et al., 2004)。除了卵巢之外，另一個明顯變化的器官就是紅體(rete mirabile)，紅體位於魚鳔內，由很多動脈和靜脈的微血管網組成，調控魚類氣體分泌的一個器官；由於鰻魚成為銀鰻之前是在淡水中生活，但是要降海繁殖時，魚鰾必須變大來應付深海的環境，因此紅體內的微血管也會跟著增生，紅體也跟著變大(Yamada et al., 2001)。鰻魚卵巢是活體(in

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vivo)研究血管新生很好的一個模型，但是要在離體(in vitro)上取其血管內皮細胞 並不容易，然而紅體的微血管也是一個很好的研究模型，而且紅體上血管內皮細胞較易取得，因此紅體非常適合被選擇來當做研究的模型（Garrick, 2000）。

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實驗目的：

鰻魚在演化上是屬於非常原始的低等脊椎動物，但是在血管內皮細胞的研究中，使用低等脊椎動物卻非常的少，主要是因為所有血管內皮細胞的研究大部分都集中在與人類相關的哺乳類中；因此經過長時間的演化下，血管內皮細胞的生理功能是否有所改變，是很值得我們去探討的，從演化的層面來看，鰻魚的性腺成熟似乎意味著血管新生另一個模式與應用，但是要取鰻魚性腺上的血管內皮細胞有其技術上的困難，然而鰻魚紅體也會隨著鰻魚的成熟而變大，因此在富含微血管的鰻魚紅體也是值得研究的對象，可以取代鰻魚性腺血管內皮細胞的一個素材。本論文的目的就是要先建立一套能培養鰻魚血管內皮細胞的培養系統，並且以VEGF為主要的研究方向，去瞭解鰻魚血管內皮細胞對刺激因子處理的反應，藉此比較高等脊椎動物和低等脊椎動物血管內皮細胞表現VEGF相同或相異的地方，同時對於血管內皮細胞在演化上最原始但被忽略的一個環節上，能夠解開一些謎題，使其所扮演之角色漸漸清楚。

(23)

實驗材料

1.選用還是黃鰻時期的日本鰻（Anguilla japonica），而鰻魚購自高雄縣內湖鄉的 鰻魚養殖場，每隻鰻魚的大小約一台斤重（約600 公克）。

2.以下試劑購自 Promega 公司：

CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay.

3.以下試劑購自 ABI（Applied Biosystems）： SYBR Green PCR Master Mix.

4.以下材料購自 Nunc 公司：

75cm flask；25-T flask；12 well plate；24 well plate；48 well plate；96 well plate； 3cm dish；6cm dish. 5.以下材料購自 Top 公司： 30ml 針筒；1ml 針筒. 6.以下材料購自 Axygen 公司： Real-time PCR tube. 7. 以下材料購自 Invitrogen 公司：

SuperScriptTMⅢ RNase H- Reverse Transcriptase RNaseOUTTM Recombinant Inhibitor

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儀器：

1. U-2800 Spectrophotometer, HITACHI. 2. CO2 Water-Jacketed Incubator, NUAIRE. 3. LC-10, Wisoom.

4. PCR system（2400）, Applied Biosystem. 5. Laminar Flow, 造鑫公司.

6. Fluorescence Inverted Microscope, TE2000-U, Nikon. 7. iCycler Real-Time PCR Dection System, Bio-Rad. 8. Universal HOOD II, Bio-Rad.

9. MP-100, Major Science.

10. High Performance Ultraviolet Transilluminator, UVP. 11. Automatic Autoclave LS-2 Operating Instruction, HITACHI.

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實驗的方法

一、初代細胞培養（Primary cell culture）：

(一) 內皮細胞的取得：

在無菌操作台（Laminar flow）中無菌操作，以膠原蛋白酶（collagenase）（1.25μg/ml）、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）（1.25μg/ml）、中性蛋白酶（dispase）（10X）三種酵素溶於PBS中（Garrick, 2000），使總體積達到25 毫升後均勻混和，再經由 0.2μm的無菌過濾膜過濾至 50 毫升離心管中，置於冰上備用。其次，從鰻魚的體內取出紅體並去除膜和浮鰾，如前所述之膠原蛋白酶、中性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶混合液中，將滅菌解剖剪剪細的紅體（1mm3）放入，作用於 4℃下過夜（overnight）作用，並且於隔日在室溫中作用 1 小時，倒出膠原蛋白酶、中性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶混合液，並加入少量PBS清洗底部碎片，將PBS倒掉後再加入 5 毫升M199 的培養液，以針筒（1ml）將內皮細胞沖刷下來、再以濾網（0.5mm）過濾、反覆三次，離心 4500rpm、10 分鐘，倒出上清液，加入M199 培養液與10％血清於培養瓶（flask）中，培養在 25℃，5%CO2中。培養瓶於前一天就coating一層魚類皮膚的明膠（4%的gelatin），至少coating四小時以上，之後倒掉明膠，以滅菌水清洗兩次，待乾燥後即可使用。

(二) 細胞培養之培養液配製（culture medium）

：

將購自Gibco公司的medium 199（M199） powder先以 800 毫升的二次水配置，於室溫下攪拌待其溶解，加入 30 毫升（0.25%）的碳酸氫鈉（sodium biocarbonate, Gibco, USA），2.5 毫升的HEPES（Gibco, USA），和 12 毫升的抗生素（antibiotic mixture, Gibco, USA），以氫氯酸（HCl）將培養液的酸鹼值（PH 值）校正為 7.2，並補足二次水至總體積 1000 毫升，接著將培養液經由孔徑為 0.2μm的無菌過濾膜（Millipore）過濾，然後將細胞培養液儲存在 4℃中分裝備用。培養細胞前加入 10%的胎牛血清（fetal calf serum，FCS, Biological Industries,

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USA），所有培養器皿皆購自Nunc（USA）公司。

(三) 細胞數目的測定：

將培養在T-75型培養瓶（T-75Flask）中初代培養的細胞培養三天之後，先倒出培養液，以1X的PBS清洗兩次，將殘留的培養液洗淨，再加入5毫升含有1 mM EDTA 及0.25﹪胰蛋白酶之緩衝溶液（Trypsin-EDTA, Sigma, USA），於室溫中作用5分鐘。待細胞脫落，吸出細胞懸浮液至15毫升的離心管中（離心管置於冰上，在無菌操作台中操作），然後再加入5毫升1X的PBS於培養瓶中吸出殘餘的細胞置入於離心管中，連續兩次，盡量把細胞取出。接著在4℃下以4500rpm離心10分鐘，將細胞沉澱至離心管底部，倒去上清液，加入M199培養液，均勻打散細胞，取出100μl的細胞懸浮液與100μl的trypan blue均勻混合，取出混合後的細胞液10μl放入細胞計數器（hemacytometer）中，以顯微鏡來觀察細胞數目，並計算細胞計數器九宮格裡最外面四個大格的細胞數目。如果是死細胞會被trypan blue染成藍色，如果是活細胞則會不呈色，因此只要計算活細胞即可。細胞總數 =(細胞計數器上四大格的活細胞總數/4)×2×104×細胞懸浮液之總體積。

(四) 藥品的配置：

(1)雌二醇（Estradiol）的配製： 將雌二醇溶於100%的純酒精之中，濃度配置為0.01M，以0.2μm的無菌過濾膜過濾至微量離心管（1.5毫升的eppendorf）中，儲存4℃中備用。 (2) 睪固酮（Testosterone）的配製： 將睪固酮溶於100%的純酒精之中，濃度配置為0.01M，以0.2μm的無菌過濾膜過濾至微量離心管（1.5毫升的eppendorf）中，儲存4℃中備用。 (3)黃體激素（Progesterone）的配製： 將黃體激素溶於100%的純酒精之中，濃度配置為0.01M，以0.2μm的無菌過濾膜過濾至微量離心管（1.5毫升的eppendorf）中，儲存4℃中備用。

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(4) 人類絨毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin）的配製： 人類絨毛膜促性腺激素於要實驗時溶於M199中，濃度為1IU/1μl，以0.2μm 的無菌過濾膜過濾至15毫升的離心管中，短時間儲存於-20℃中備用。 (5) 氯化鈷（CoCl2）的配製： 氯化鈷於要實驗時溶於M199中，濃度為0.1M，以0.2μm的無菌過濾膜過濾至微量離心管（1.5毫升的eppendorf）中，短時間儲存於-20℃中備用。 (6) 多巴胺（Dopamine）的配製： 多巴胺於要實驗時溶於M199中，濃度為0.1M，以0.2μm的無菌過濾膜過濾至微量離心管（1.5毫升的eppendorf）中，短時間儲存於-20℃中備用。

(7) 鹼性纖維母細胞生長因子（basic Fibroblast growth factor）的配製：

鹼性纖維母細胞生長因子溶於滅菌過的二次水中，濃度為10-6M，儲存於 -20℃中備用。

二、內皮細胞的證明：

(一) DiI-AcLDL（Acetylated low-density lipoprotein）：

DiI-AcLDL（Acetylated low-density lipoprotein, Molecular Probes）是一種對細胞無害的脂類化學物質，因為血管內皮細胞的表面有專一性的LDL receptor，而DiI-AcLDL會經由血管內皮細胞的LDL receptor噬入細胞內，因此在螢光顯微鏡下會發出螢光（Voyta, et al., 1984）。由於血管中的外被細胞（pericytes）與血管平滑肌肉細胞（vascular smooth muscle cells）並不會噬入DiI-AcLDL，所以由此可以分辨出血管內皮細胞（Garrick, 2000；Voyta, et al., 1984）。先將24 well plate 放入經滅菌的玻璃片，然後 coating 一層明膠，之後以滅菌水清洗後，待乾燥後將適量的細胞種入有玻璃片的well中，以含10%血清的M199，25℃、5%CO2培養三天。之後選用Molecular probes公司的DiI-AcLDL，抽出先前的培養液，再以PBS 清洗後，在24 well plate 中加入 1 毫升的無血清 M199 培養液（含有 50μl 的

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DiI-AcLDL），在25℃、5%CO2培養overnight，之後將培養液抽出，玻璃片以PBS 清洗，滴上甘油，放在載玻片上，以螢光顯微鏡觀察，利用FRET（Fluorescence Resonance Energy-Transfer, TE2000-U, Nikon, Japan）系統偵測螢光。

(二) DAF（4,5-Diaminofluorescein）：

血管內皮細胞會產生出一氧化氮（NO），而DAF（4,5-Diaminofluorescein, Sigma, USA）能夠通過細胞膜去和NO結合發出螢光（Itoh, et al., 2000）。先將 24 well plate放入經火烤過滅菌的玻璃片，然後 coating 一層明膠，之後以滅菌水清洗後，待乾燥後將適量的細胞種入有玻璃片的well中，以含10%血清的 M199，25℃、5%CO2培養三天。抽出先前的培養液，再以PBS清洗後，在24 well plate中加入1毫升的無血清M199培養液（1毫升的培養液含有1μl的DAF，DAF購自Sigma），在25℃、5%CO2培養6小時，之後將培養液抽出，玻璃片以PBS清洗，滴上甘油，放在載玻片上，以螢光顯微鏡觀察，利用FRET系統偵測螢光。

(三) 聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)與定序：

將紅體的細胞先以含有10%血清的 M199 培養液培養在 T-25 培養瓶（flask）（先前已coating 明膠）中，之後從細胞中抽取出 RNA 反轉錄成 cDNA 後，以 cDNA 為模板，加入 VEGF primers（此 primers 由實驗室已經定序出的鰻魚 VEGF 序列所設計出來），做出PCR 產物，設定的反應條件為：94℃反應 5 分鐘；94℃ 反應30 秒，55℃反應 30 秒，72℃反應 30 秒，進行 35 個循環；72℃反應 7 分鐘，最後維持在4℃下。以 2％的 agarose gel 跑電泳，經 UV 照射後得到 VEGF 的條帶（band）。

VEGF 條帶經純化 DNA 後，利用載體（vector）接合（ligation）DNA 後，再轉型（transformation）到勝任細胞（competent cell）中，塗在培養皿（plate）上，37℃培養 16 小時之後，挑出 10 個可能含有重組載體的大腸桿菌菌落，並做

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大腸桿菌菌落聚合酶連鎖反應（E. coli colonies PCR）去做篩選（screening）， 並且利用 LB 培養液（含有 Ampicillin）去培養放大大腸桿菌菌落，抽取大腸桿菌菌落之質體（plasmid）。將質體送至成大醫院定序，定序之後的序列在 NCBI 用Blast 進行搜尋比對相關的基因序列（表四(A)），並搜尋相關氨基酸序列（表四(B)）。反應物體積 cDNA 2μl dNTP 1μl Taq polymerase 0.5μl 10X Buffer 2.5μl VEGF f1 (10μM) 0.3μl VEGF R340 (10μM) 0.3μl 滅菌水 4.9μl 反應總體積 25μl VEGF primer的序列 VEGF f1： ATGAACTTTGCTGCCAGCTT VEGF R340： AATTGTGTTGCGTCACATGC

(四)免疫染色法（Immunostaining）：

先將24 well plate放入經滅菌的玻璃片，然後 coating 一層明膠，之後以滅菌水清洗後，待乾燥後將適量的細胞種入有玻璃片的well中，以含10%血清的 M199，25℃、5%CO2培養三天。之後將玻璃片放入新鮮配製的3.7% 福馬林（Paraformaldehyde溶於PBS, Sigma, USA）中15分鐘固定細胞。以PBS搖晃洗滌三次，每次10分鐘後，以填塞緩衝液（Blocking buffer）(填塞緩衝液的配製為1 ％BSA、1％Triton X-100、兩者溶於PBS之中)blocking 30分鐘。加入一級抗體（用填塞緩衝液進行1:200稀釋），於室溫下搖晃反應一小時。以填塞緩衝液搖晃洗滌三次，每次10分鐘，加入二級抗體（用填塞緩衝液進行1:200稀釋），於室溫下搖擺反應30分鐘。再以PBS搖晃洗滌三次，每次10分鐘。最後利用HRP-TMB

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（Horseradish peroxidase-tetramethylbenzidine）系統於相位差顯微鏡中觀察染色情況，具VEGF的胞器呈藍色。

三、細胞對藥物處理後的生長代謝之測定：

CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay：

將培養在 96 well plate的血管內皮細胞，經藥物處理後的利用購自Promega （USA）公司的CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay之kit 來測定細胞增生代謝的情況。每次取 2ml的MTS solution，需加入 100μl的PMS solution，經由輕輕拍打混合均勻後，再以每 100μl培養液（M199）含有 20μl （MTS/PMS）混合液的比例去計算出所要的體積，之後在 96 well plate中各加入 100μl培養液 (含 20μl MTS /PMS)，將 96 well在 25℃，5% CO2培養4 小時後，再以ELISA-plate reader 的OD490 nm 測其吸光值。

四、血管內皮生長因子（VEGF）基因表現的分析：

(一) 藥物處理細胞：

經細胞計數之後的細胞總數，計算細胞數的濃度約每毫升105至106的細胞數，平均種入12 well plate之中，然後以10％的胎牛血清，培養液總體積為1.5毫升，在25℃、5％CO2的條件下培養三天。三天後將培養液抽出，以1XPBS將殘餘培養液清洗乾淨，加入含有刺激VEGF或抑制VEGF的藥物的培養液（但是不含血清），培養在25℃、5％CO2的培養箱之中，依照不同時間處理藥物後的細胞，去抽取細胞的total RNAs。藥物處理分為：(1)含有0.1%血清下的鰻魚紅體細胞，長期處理藥物六天（三天要換一次培養液），之後抽取細胞的RNA，製備成cDNA後進行即時定量聚合酶連鎖反應（real-time PCR）。(2) 含有0.1%血清下的鰻魚紅體細胞，長期處理藥物三天，抽取細胞的RNA，製備成cDNA後進行即時定量聚合酶連鎖反應。(3)短期處理藥物，在不含血清的培養液培養0、0.5、

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1、2、3至6小時等不同時間抽取細胞的RNA，製備成cDNA後進行即時定量聚合酶連鎖反應。

(二) 抽取 total RNA：

將不同時間處理藥物後的細胞，利用Viogene公司的total RNA Mini kit抽取 total RNA。首先抽取出培養液，以PBS將殘餘的培養液洗淨，每個well加入 700μl 的RX buffer（每 1 毫升的RX buffer含有 10μl的β-mercaptoethanol），靜置 5 分鐘後，然後將含有RNA的上清液（supernatant）取進微量離心管（已滅菌的 1.5 ml eppendorf，無RNase）中，加入與RX buffer等體積的 75%酒精（700 μl）並均勻振盪混合後，再將混合後之液體取至Total RNA Mini column中，然後在室溫下離心14000rpm、1 分鐘，使之通過Total RNA Mini column。將離下的液體丟棄，加入0.5 毫升之WF buffer，在室溫下離心 14000 rpm、1 分鐘，使之通過column。再將離下的液體丟棄、加入0.7 毫升之WS buffer，在室溫下離心 14000 rpm、1 分鐘，使之通過column。再將離下的液體丟棄、在室溫下離心 14000rpm、三分鐘，目的在於去除酒精成分。離心後，將此column裝在RNase-free Elution tube中，加入30μl的RNase-free ddH2O，盡量加到mini column filter的中間，靜置一分鐘。室溫下離心9000rpm、2 分鐘。離心後，將流至微量離心管中的液體部分先儲存在-70℃冰箱中備用（該液體為total RNAs）。

(三) cDNA 的製備（Revese Transcription，簡稱 RT）：

將抽出之total RNA，先測定吸光值取出2μl total RNA 加入98μl滅菌水中，以 OD260與OD280去偵測RNA吸光值進而去計算RNA濃度。RNA濃度=(RNA的吸光值(OD260)×40×稀釋倍數)/1000。計算出的RNA濃度以含有1μg的RNA濃度，去製備cDNA。利用SuperScript™ II RT的kit進行反轉錄合成cDNA，首先在無核酸酶（nuclease-free）的微量離心管中，取1μg濃度的RNA，加入含有Oligo(dT)15 primer、total RNA、dNTP Mix和滅菌水至其反應體積為13 µl。將其反應混合液

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混和均勻後，在65℃加熱5分鐘後，快速置於冰上冷卻1分鐘。短暫離心後，加入 5X First-Strand Buffer、0.1M DTT、RNaseOUTTM Recombinant Ribonuclease Inhibitor、SuperScript™ II RT，使總體積為20µl後混和混勻。在25℃下反應5分鐘， 50℃反應60分鐘，70°C 反應15分鐘，最後維持在4℃。cDNA保存於-20℃冰箱，作為即時定量聚合酶連鎖反應（real-time PCR）與聚合酶連鎖反應（PCR）的模板。反應物體積 Oligo (dT) 1μl RNA (濃度 1μg) 10μM dNTP 1μl ddH2O 其餘補水至 13μl 反應物體積 5x First stand Buffer 4μl 0.1 DTT 1μl RNase out Recombinant RNase Inhibitor 1μl Super scriptTM

II RT 1μl 反應總體積 20μl

(四) 即時定量聚合酶連鎖反應（Real-time polymerase chain

reaction，簡稱Real-time PCR）

即時定量聚合酶連鎖反應（real-time PCR）其原理是：針對有特異性的核酸設計探針（probe）、並在PCR反應中加入螢光染劑，利用螢光信號的累積即時監測整個PCR過程，利用所偵測到的Ct值，去計算出起始的濃度。所謂的C代表循環(Cycle)，T代表閾值(Threshold)，Ct值是指每個反應管內的螢光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數，每個樣本（sample）的Ct值與該cDNA起始濃度的對數存在線性關係，起始濃度越多，Ct值越小，即Ct值與起始濃度成反比，利用已知起始濃度的標準品可做出標準曲線，因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可

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從標準曲線上計算出該樣本的起始濃度。

使用購自ABI公司（Applied Biosystems, USA）的SYBR Green PCR Master Mix，先將SYBR Green PCR Master Mix，實驗室設計的引子（VEGF的primer和 28S的primer）和滅菌過的蒸餾水配成stock混合液備用。先做標準曲線，標準曲線的做法是將大量紅體細胞抽出的RNA製備成cDNA，再以cDNA為模板做PCR 的反應，將所夾到的VEGF或28S片段(340bp)利用接合酶（ligase）送到載體（vector）(yA&T system)，經定序後確認為VEGF或28S的基因序列，然後以此載體為PCR模板進行PCR反應，然後PCR的反應產物以連續10倍的稀釋做出標準曲線，之後將混合液與製備好的樣本之cDNA加至real-time PCR專用的離心管（8 連排的微量離心管）中，進行即時定量聚合酶連鎖反應。反應設定條件如下：首先使cDNA變性(denature)，(一)95℃反應5分鐘使雙股DNA解開為單股；(二)接著 95℃反應15秒使引子粘合(anneal)至解開的單股cDNA，(三)60℃反應1分鐘使 DNA進行擴增(elongation)，以上(二)(三)反應進行50個循環。反應物體積 SYBR Green PCR Master Mix 7.5μl 28S Forward primer(10μM) 0.3μl 28S Reverse primer(10μM) 0.3μl cDNA 2μl 滅菌水 4.9μl 反應總體積 15μl 反應物體積 SYBR Green PCR Master Mix 7.5μl VEGF Forward primer(10μM) 0.3μl VEGF Reverse primer(10μM) 0.3μl cDNA 2μl 滅菌水 4.9μl 反應總體積 15μl VEGF primer的序列 qVEGF-102F：TGACGTGGTCCCCTTTATGG

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qVEGF-184R：GGTACTCCTGGTAGATGTCCACAA 28S primer的序列 q-28S-F：CCTGCGTTCCTCTCGTACT q-28S-R：CCGTCGTGAGACAGGTTAGTTT

五、統計方法：

實驗數據計算的表現方式為平均值±平均標準誤差（mean±SEM），實驗數據結果以Student’s t-test 分析統計（SigmaPlot 2000, USA）。當 P <0.05（P value）時，視為有統計上的差異;若 P >0.05 時，則視為無統計上的差異。

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實驗結果

一、鰻魚紅體細胞培養系統的建立

所有離體細胞培養（in vitro cultured cells）都需要基質才能繼續生長分裂， 因此血管內皮細胞需要有適當基質的存在才能生長分裂，所以先選擇不同明膠（gelatin）當基質，實驗哺乳類或魚類的明膠當基質是否影響鰻魚紅體細胞生長？

(1) 猪皮膚之明膠（Gelatin from Porcine skin）當基質：

選擇哺乳類的明膠，以猪皮膚之明膠當基質。不同濃度（1%、0.5%、0.25%）猪皮膚的明膠和有（10%）無（0%）血清當實驗組，以不加血清和不coating猪皮膚的明膠當作對照組。細胞培養九天，之後抽取細胞的RNA，製備成cDNA後，進行即時定量聚合酶連鎖反應（real-time PCR），測定 28S核醣體蛋白質mRNA 含量。發現培養在未coating猪皮膚明膠且無血清的細胞無法生長而且死亡，但不同濃度的猪皮膚明膠在相同血清濃度下似乎並不影響鰻魚紅體細胞的生長分裂（圖一(A)）（P>0.05），添加 10% 血清的實驗組與對照組比較，血清影響鰻魚紅體細胞生長（圖一(B)）（P<0.05），所以推測血清是影響鰻魚紅體細胞生長的主要原因【實驗數據利用平均值+平均標準差（mean + SEM）（n=3），實驗組與對照組比較進行Students’s t-test的分析】。

(2)鮭魚皮膚之明膠（Gelatin from Cold fish skin）當基質：

不同濃度（1%、0.5%、0.25%）鮭魚皮膚的明膠當基質，實驗在相同血清濃度（10%）或無血清添加（0%）對細胞存活的影響，以不加血清和不coating鮭魚皮膚的明膠當作對照組。細胞培養九天，之後抽取細胞的RNA，製備成cDNA 後，進行即時定量聚合酶連鎖反應，測定28S核醣體蛋白質mRNA含量。發現不同濃度的鮭魚皮膚明膠並不影響鰻魚紅體細胞的生長分裂（圖二(A)）（P>0.05），

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添加10% 血清的實驗組與對照組比較，血清影響鰻魚紅體細胞生長（圖二(B)）（P<0.05），同樣的血清才是影響鰻魚紅體細胞生長的主要原因【實驗數據利用平均值+平均標準差（mean + SEM）（n=3），實驗組與對照組比較進行Students’s t-test的分析（P>0.05）】。 (3)猪皮膚明膠與鮭魚皮膚明膠對鰻魚紅體細胞生長的比較： 既然不同濃度之猪皮膚明膠和鮭魚皮膚明膠對鰻魚紅體細胞生長並不影響，那麼猪皮膚明膠和鮭魚皮膚明膠哪一種明膠對鰻魚紅體細胞生長比較好呢？因此在含有 10% 的血清下，分別比較coating不同濃度（1%、0.5%、0.25%）猪皮膚的明膠和coating不同濃度（1%、0.5%、0.25%）鮭魚皮膚的明膠，並且以含有 10% 的血清，未coating任何明膠當作對照組。細胞培養九天，之後抽取細胞的RNA，製備成cDNA後，進行即時定量聚合酶連鎖反應，測定 28S核醣體蛋白質mRNA含量。。發現猪皮膚的明膠和鮭魚皮膚的明膠之間比較對鰻魚紅體細胞生長並沒有多大的差別（圖三）【實驗數據利用平均值+平均標準差（mean + SEM）（n=3），實驗組與對照組比較進行Students’s t-test的分析（P>0.05）】。

二、血清對鰻魚紅體細胞存活的影響

既然血清是影響鰻魚的紅體細胞生長最主要的因素，所以利用細胞生長分析的方法和即時定量聚合酶連鎖反應來實驗血清對鰻魚紅體細胞存活的影響。 (1) 不同血清濃度對鰻魚紅體細胞的影響： 將鰻魚的紅體細胞以每毫升約105至106之間的數目，分別種於96 well plate 中，以不加血清的鰻魚紅體細胞當作對照組，而實驗組分別加入 0.1%、0.5%、 1%、5%和 10%各種不同濃度的血清培養三天和六天，再以CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit（Promega, USA）來測定細胞生長代

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謝的情況。發現細胞代謝率與血清濃度似乎呈正相關，其中在10% 血清培養時，鰻魚紅體細胞不管培養三天或培養六天，生長狀況良好（增加約1.5 至 2 倍分別與對照組比較）（圖四(A)三天、(B)六天）。而且10%的血清培養鰻魚紅體細胞時，與1%血清培養鰻魚紅體細胞做比較，第六天時細胞數目會複製一倍，顯微鏡觀察到添加不同血清濃度（0.1%、0.5%、1%、5%和 10%）的鰻魚紅體細胞，10% 的血清濃度跟對照組比較，鰻魚紅體細胞生長狀況良好。實驗觀察到 0.1%的血清培養可讓細胞處於停止生長狀態，而細胞並不會死亡，因此適合在長時間藥物處理培養時，做為血清濃度的選擇。 (2) 血清濃度對鰻魚紅體細胞 VEGF 表現的影響： 由細胞代謝的實驗可知，含有10% 血清有較佳的培養結果，但是血清濃度是否會影響到鰻魚紅體細胞 VEGF 的表現呢？以未經血清培養的鰻魚紅體細胞當作對照組，然後分別加入 0.1%、0.5%、1%、5%和 10%的血清為實驗組，培養六天後，再抽出細胞之RNA，製備成 cDNA 後，再去進行即時定量聚合酶連鎖反應（real-time PCR），比較其 VEGF 基因與 28S 基因的表現。發現血清濃度在細胞培養六天後，細胞28S 基因與 VEGF 基因表現與血清濃度呈正相關增加，但是其比值，即VEGF/28S 並無顯著正相關（圖五(A)和圖五(B)），推測血清濃度雖然增加會讓鰻魚紅體細胞生長良好，但是並不影響鰻魚紅體細胞的 VEGF 基因的表現。實驗觀察到 0.1%的血清培養可讓細胞處於停止生長狀態，而細胞並不會死亡，因此適合在長時間藥物處理培養時，做為血清濃度的選擇。 (3)VEGF 抗體對鰻魚紅體細胞代謝的影響： 兔子注射鰻魚 VEGF 重組蛋白而產生抗鰻魚 VEGF 血清，想要知道鰻魚紅體細胞的生長是否會受到抗鰻魚 VEGF 血清的影響，因此先取鰻魚的血清去培養鰻魚紅體細胞，再以不同稀釋濃度的抗鰻魚VEGF 血清（1/100、1/500、1/1000、 1/10000）處理鰻魚紅體細胞，以不含抗鰻魚 VEGF 血清的鰻魚紅體細胞做為對

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照組，培養三天和六天。由細胞生長的分析（CellTiter）初步結果顯示，兔子抗鰻魚VEGF 血清並不會影響鰻魚紅體細胞的代謝（圖六(A)、(B)）。

三、鰻魚紅體之血管內皮細胞的證明

那麼鰻魚紅體細胞到底是由那些細胞所組成的呢？報告指出鰻魚紅體細胞大部分為血管內皮細胞，其面積約佔紅體微血管的70-80%之間（Buchanan and Wagner, 1990），因此利用血管內皮細胞的特性去證明血管內皮細胞在鰻魚紅體細胞中所佔之比例。

(1) DiI-AcLDL（Acetylated low-density lipoprotein）：

血管內皮細胞的細胞膜上，會有專一性的低密度脂蛋白接受器（low-density lipoprotein receptor）的存在，因此利用DiI-AcLDL能經由此接受器而噬入細胞內，經由FRET系統而發出綠色螢光。鰻魚紅體細胞經由DiI-AcLDL在25℃、5%CO2培養overnight後，利用顯微鏡觀察，得到的結果如圖七(A)、(B)。圖七(A)是相位差顯微鏡，圖七(B)是螢光顯微鏡，(A)和(B)比較後，DiI-AcLDL的確有被鰻魚紅體細胞噬入而發出綠色螢光，可以由此判斷鰻魚紅體細胞中的血管內皮細胞數目，但是因為鰻魚紅體細胞所噬入的DiI-AcLDL螢光強度很弱，而且背景值也有螢光產生，因此無法算確切比例，只能在視野中看出大部分都有噬入DiI-AcLDL而發出螢光，推估染上 DiI-AcLDL的細胞大約是60%左右。 (2) DAF（4,5-Diaminofluorescein）： 血管內皮細胞會產生一氧化氮（NO），而DAF會通過細胞膜跟一氧化氮結合，經由FRET系統而發出綠色螢光。鰻魚紅體細胞以DAF處理，在 25℃、5%CO2 培養 6 小時，以顯微鏡觀察，得到的結果如圖八(A)、(B)。圖八(A)為相位差顯

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微鏡，圖八(B) 為螢光顯微鏡，圖八(A)和圖八(B)比較後，鰻魚的紅體細胞在螢光顯微鏡下發出綠色螢光。顯示出鰻魚的紅體細胞會有一氧化氮的產生，但是螢光很弱而且背景值也會有螢光的產生，因此很難算出發出螢光的比例。

(3) PCR 的證明：

血管內皮細胞會表現VEGF 的基因，因此從鰻魚紅體細胞中抽取出 RNA 反轉錄成cDNA 後，以 cDNA 為模板，加入由實驗室已經定序出的鰻魚 VEGF 基因序列所設計出來的VEGF 引子（primers），做出 PCR 產物，再以 2％的 agarose gel 跑電泳，經 UV 照射後得到 VEGF 的條帶（如圖九）。經由 PCR 進行電泳分析與核酸定序的結果發現符合實驗室所設計出的引子所夾出片段的大小為 340bp。 (4)免疫染色法（Immunostaining）： 經由鰻魚的 VEGF 序列去設計成重組蛋白後所產生的兔子抗鰻魚 VEGF 血清，由免疫染色法，可將會產生VEGF 蛋白質的胞器染成藍色（如圖十）。對照組為沒加抗鰻魚 VEGF 的一級抗體，只加二級抗體，有部分細胞被染上微弱顏色（圖十(A)），為非特異性反應，視為背景值；實驗組為加抗鰻魚 VEGF 的一級抗體與二級抗體，利用相位差顯微鏡可以看出會產生 VEGF 蛋白質的細胞被染成藍色（圖十(B)）。但結果顯示出鰻魚紅體細胞並不是全部會和抗鰻魚VEGF 抗體反應。而且在相位差顯微鏡的視野底下去計算有被染成藍色的細胞或是完全沒有被染成藍色的細胞，將實驗組中顯微鏡視野所見全部的細胞去除以染成藍色的細胞，計算出百分比；將對照組中顯微鏡視野所見全部的細胞去除以染成藍色的細胞，計算出百分比，之後將實驗組百分比扣除對照組百分比，大約可得到 60%-80%左右的鰻魚紅體細胞有 VEGF 蛋白質的產生（表五）。由以上四種分析方法證明鰻魚的紅體細胞絕大部分（60%-80%）都是血管內皮細胞。

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(5) 即時定量聚合酶連鎖反應 VEGF 和 28S 的標準曲線： 標準曲線是將含有VEGF和 28S基因的質體（plasmid）為PCR的模板，進行 PCR反應，將得到的PCR的反應產物以連續 10 倍的稀釋進行即時定量聚合酶連鎖反應，將反應得到的VEGF和 28S的Ct值，取對數（log）與稀釋濃度做圖，在稀釋濃度 10-3M到 10-7M之間為標準曲線的直線區，樣本的濃度在此區間才具有意義（圖十一（A）、（B））。

四、刺激因子對鰻魚紅體細胞生長的影響：

女性生殖器官包含卵巢、子宮和胎盤，這些是成人組織中少數血管新生非常旺盛的部位，這些部位需要某些調控因子去調控，而VEGF便是調控女性生殖器官血管新生最重要的因子（Reynoldset al., 2002）。因此對於刺激因子刺激VEGF 的表現便是首要研究目標，而且性類固醇（sex steroids）是女性生殖器官成熟時所必須的賀爾蒙，因為性類固醇讓女性生殖器官成熟，而女性生殖器官成熟伴隨著血管新生，VEGF又是調控血管新生最重要的因子，因此性類固醇對於VEGF 的關係值得探討。首先，本實驗利用性類固醇刺激鰻魚紅體細胞，瞭解鰻魚紅體細胞受性類固醇刺激後VEGF基因表現的情形。

(一) 性類固醇（Sex steroids）對鰻魚紅體細胞的 VEGF 基因表現之影響：

(1) 雌二醇（Estradiol，簡稱 E2）的處理：

在長時間（六天）雌二醇的處理上，在含有 0.1%的血清下，用不同濃度的雌二醇處理鰻魚紅體細胞，分別為10-5M、10-7M、10-9M和 10-11M的雌二醇做為實驗組培養六天，以不含雌二醇的鰻魚紅體細胞做為對照組，然後培養六天，抽取細胞的RNA，製備成cDNA後，去做即時定量聚合酶連鎖反應。發現在長時間

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處理雌二醇下，對於各個濃度比較對照組似乎並無顯著的差異，但是在10-9M雌二醇似乎會刺激鰻魚紅體細胞的VEGF基因表現（圖十二），除此之外，對鰻魚紅體細胞的VEGF基因表現並無差異，此結果需進一步實驗確認。另外在短時間處理雌二醇上，在不含血清下、利用10-7M雌二醇處理鰻魚紅體細胞，以0 小時為對照組，0.5 小時、1 小時、2 小時、3 小時和 6 小時為實驗組，抽取細胞的RNA，製備成cDNA後，去做即時定量聚合酶連鎖反應，發現雌二醇在2 至 3 小時開始促進鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現（圖十三(A)、(B)）。在不含血清下，利用雌二醇的抑制劑泰莫西芬（Tamoxifen）來處理有雌二醇處理過的鰻魚紅體細胞，以不含雌二醇和Tamoxifen的鰻魚紅體細胞當作對照組，分別以10-7M雌二醇加 10-8M Tamoxifen，10-7M雌二醇加 10-7M Tamoxifen， 10-7M雌二醇加 10-6M Tamoxifen當實驗組，培養三小時，抽取細胞的RNA，製備成cDNA後，去做即時定量聚合酶連鎖反應，可以發現Tamoxifen似乎會抑制由雌二醇引起的鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現（圖十四(A)、(B)）。 (2) 睪固酮（Testosterone，簡稱 T）的處理： 在長時間睪固酮處理上，在含有 0.1%的血清下，利用不同濃度睪固酮處理鰻魚紅體細胞，分別為10-5M、10-7M、10-9M和 10-11M的睪固酮處理鰻魚紅體細胞當作實驗組，未處理睪固酮的鰻魚紅體細胞當作對照組，培養六天，抽取細胞的RNA，製備成cDNA後，去做即時定量聚合酶連鎖反應。發現在長時間處理睪固酮下，10-5M、10-7M抑制VEGF表現，但是在 10-9M睪固酮會刺激鰻魚紅體細胞的VEGF基因表現（圖十五(A)、(B)）。另外在短時間處理睪固酮上，在不含血清下，利用 10-7M睪固酮處理， 0.5 小時、1 小時、2 小時、3 小時和 6 小時為實驗組，未處理睪固酮的鰻魚紅體細胞培養6 小時為對照組，抽取細胞的RNA，製備成cDNA後，去做即時定量聚合酶連鎖反應。以發現睪固酮在2 至 3 小時促進鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現，但在6 小時呈抑制效果（圖十六(A)、(B)）。

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(3) 黃體激素（Progesterone，簡稱P4）的處理： 在短時間處理黃體激素上，在不含血清下，利用 10-7M黃體激素處理， 0.5 小時、1 小時、2 小時、3 小時和 6 小時為實驗組處理黃體激素，未處理黃體激素的鰻魚紅體細胞培養6 小時為對照組，之後抽取細胞的RNA，製備成cDNA後，去做即時定量聚合酶連鎖反應，發現黃體激素在1 至 2 小時開始促進鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現，隨後恢復原來水平（圖十七(A)、(B)）。

(二) 人類絨毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin，簡稱 hCG）：

(1) 人類絨毛膜促性腺激素對鰻魚紅體細胞代謝的影響： 哺乳動物懷孕時，胎盤會產生hCG 幫助子宮內膜增厚，因此血管大量生長，但是 hCG 在其他組織是否也具同樣的功能幫助血管新生，促使血管內皮細胞生長。所以在含有0.1%血清下，鰻魚紅體細胞處理不同濃度的 hCG（0.1IU、0.5IU、 1IU、10IU、100IU）當作實驗組，未處理 hCG 的鰻魚紅體細胞當作對照組，培養三天和六天。利用細胞生長的分析（CellTiter），發現培養三天時，高濃度的 hCG（10IU、100IU）會讓細胞大量死亡（圖十八(A)）；培養至第六天時，高濃度的 hCG 的細胞幾乎死亡殆盡，而較低濃度的 hCG（0.5IU、1IU）也會造成部分細胞死亡（圖十八(B)）。由此可知，hCG 會使鰻魚紅體細胞死亡，且濃度越高，反應越強烈。以細胞生長分析（CellTiter）做標準曲線，分析細胞是否死亡，在含有 0.1% 血清下，分別在96 well中種入 10 倍稀釋的鰻魚紅體細胞（106 、105 、104 、103）並且處理 10IU的hCG當作實驗組，未處理hCG的鰻魚紅體細胞（106的細胞數）當作對照組，培養一天，測其OD490nm的析光值（圖十九（A））。在含有 1%血清下，分別在96 well中種入 10 倍稀釋的鰻魚紅體細胞（106、105、104、103）並且處理1IU的hCG當作實驗組，未處理hCG的鰻魚紅體細胞（106的細胞數）當作對照組，培養一天，測其OD490nm的析光值（圖十九（B））。

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(2) 人類絨毛膜促性腺激素對鰻魚紅體細胞的 VEGF 基因表現之影響： 在長時間（三天）hCG 處理上，在含有 0.1%的血清下，用 10IU 的 hCG 處理鰻魚紅體細胞。以未經 hCG 處理的鰻魚紅體細胞為對照組，而第一天、第二天和第三天的hCG 處理為實驗組，然後抽取細胞的 RNA，製備成 cDNA 後，去做即時定量聚合酶連鎖反應。發現在第一天之後 hCG 很明顯的抑制鰻魚紅體細胞 VEGF 基因的表現（圖二十(A)、(B)）。另外，在不含血清下，以 0 小時為對照組，0.5 小時、1 小時、2 小時、3 小時和 6 小時為實驗組處理 10IU 的 hCG，之後抽取細胞的RNA，製備成 cDNA 後，去做即時定量聚合酶連鎖反應，發現經10IUhCG 處理後，鰻魚紅體細胞 VEGF 基因的表現受到抑制（圖二十一 (A)、 (B)）。另外再做含有 1%的血清，1IU 的 hCG 處理鰻魚紅體細胞，以 0 小時為對照組，0.5 小時、1 小時、2 小時、3 小時和 6 小時為實驗組處理 1IU 的 hCG，培養三天，抽取細胞的RNA，製備成 cDNA 後，去做即時定量聚合酶連鎖反應。發現 hCG 的抑制效果降低，並且似乎有促進的情況產生，在 0.5 小時鰻魚紅體細胞 VEGF 基因的表現升高，但之後似乎又降低，此結果仍須要進一步的實驗證實（圖二十二(A)、(B)）。 (三) 缺氧對鰻魚紅體細胞之影響： 本實驗以氯化鈷作為缺氧因子處理鰻魚紅體細胞，並觀察實驗結果是否與哺乳類細胞（經氯化鈷處理）反應是否一致。 (1) 氯化鈷（CoCl2）對鰻魚紅體細胞代謝的影響： 氯化鈷（CoCl2）可以模擬細胞缺氧，利用氯化鈷來處理鰻魚紅體細胞後，利用CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay來測定鰻魚紅體細胞生長的情況。在含有0.1%的血清下，經不同濃度的氯化鈷（10-5M、10-6M、 10-7M、10-8M、10-9M）處理後的鰻魚紅體細胞做為實驗組與無氯化鈷處理之鰻魚紅體細胞為對照組互相比較，在培養三天和六天後由細胞生長的分析可以得