實驗結果 - 鰻魚紅體細胞細胞培養系統之建立與其血管內皮生成因子表現

一、鰻魚紅體細胞培養系統的建立

所有離體細胞培養（in vitro cultured cells）都需要基質才能繼續生長分裂，

因此血管內皮細胞需要有適當基質的存在才能生長分裂，所以先選擇不同明膠

（gelatin）當基質，實驗哺乳類或魚類的明膠當基質是否影響鰻魚紅體細胞生長？

(1) 猪皮膚之明膠（Gelatin from Porcine skin）當基質：

選擇哺乳類的明膠，以猪皮膚之明膠當基質。不同濃度（1%、0.5%、0.25%）

猪皮膚的明膠和有（10%）無（0%）血清當實驗組，以不加血清和不coating猪皮膚的明膠當作對照組。細胞培養九天，之後抽取細胞的RNA，製備成cDNA後，

進行即時定量聚合酶連鎖反應（real-time PCR），測定 28S核醣體蛋白質mRNA 含量。發現培養在未coating猪皮膚明膠且無血清的細胞無法生長而且死亡，但不同濃度的猪皮膚明膠在相同血清濃度下似乎並不影響鰻魚紅體細胞的生長分裂

（圖一(A)）（P>0.05），添加 10% 血清的實驗組與對照組比較，血清影響鰻魚紅體細胞生長（圖一(B)）（P<0.05），所以推測血清是影響鰻魚紅體細胞生長的主要原因【實驗數據利用平均值+平均標準差（mean + SEM）（n=3），實驗組與對照組比較進行Students’s t-test的分析】。

(2)鮭魚皮膚之明膠（Gelatin from Cold fish skin）當基質：

不同濃度（1%、0.5%、0.25%）鮭魚皮膚的明膠當基質，實驗在相同血清濃度（10%）或無血清添加（0%）對細胞存活的影響，以不加血清和不coating鮭魚皮膚的明膠當作對照組。細胞培養九天，之後抽取細胞的RNA，製備成cDNA 後，進行即時定量聚合酶連鎖反應，測定28S核醣體蛋白質mRNA含量。發現不同濃度的鮭魚皮膚明膠並不影響鰻魚紅體細胞的生長分裂（圖二(A)）（P>0.05），

添加10% 血清的實驗組與對照組比較，血清影響鰻魚紅體細胞生長（圖二(B)）

（P<0.05），同樣的血清才是影響鰻魚紅體細胞生長的主要原因【實驗數據利用平均值+平均標準差（mean + SEM）（n=3），實驗組與對照組比較進行Students’s t-test的分析（P>0.05）】。

(3)猪皮膚明膠與鮭魚皮膚明膠對鰻魚紅體細胞生長的比較：

既然不同濃度之猪皮膚明膠和鮭魚皮膚明膠對鰻魚紅體細胞生長並不影響，那麼猪皮膚明膠和鮭魚皮膚明膠哪一種明膠對鰻魚紅體細胞生長比較好呢？

因此在含有 10% 的血清下，分別比較coating不同濃度（1%、0.5%、0.25%）猪皮膚的明膠和coating不同濃度（1%、0.5%、0.25%）鮭魚皮膚的明膠，並且以含有 10% 的血清，未coating任何明膠當作對照組。細胞培養九天，之後抽取細胞的RNA，製備成cDNA後，進行即時定量聚合酶連鎖反應，測定 28S核醣體蛋白質mRNA含量。。發現猪皮膚的明膠和鮭魚皮膚的明膠之間比較對鰻魚紅體細胞生長並沒有多大的差別（圖三）【實驗數據利用平均值+平均標準差（mean + SEM）

（n=3），實驗組與對照組比較進行Students’s t-test的分析（P>0.05）】。

二、血清對鰻魚紅體細胞存活的影響

既然血清是影響鰻魚的紅體細胞生長最主要的因素，所以利用細胞生長分析的方法和即時定量聚合酶連鎖反應來實驗血清對鰻魚紅體細胞存活的影響。

(1) 不同血清濃度對鰻魚紅體細胞的影響：

將鰻魚的紅體細胞以每毫升約10

⁵

至10

⁶

之間的數目，分別種於96 well plate 中，以不加血清的鰻魚紅體細胞當作對照組，而實驗組分別加入 0.1%、0.5%、

1%、5%和 10%各種不同濃度的血清培養三天和六天，再以CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit（Promega, USA）來測定細胞生長代

謝的情況。發現細胞代謝率與血清濃度似乎呈正相關，其中在10% 血清培養時，

鰻魚紅體細胞不管培養三天或培養六天，生長狀況良好（增加約1.5 至 2 倍分別與對照組比較）（圖四(A)三天、(B)六天）。而且10%的血清培養鰻魚紅體細胞時，

與1%血清培養鰻魚紅體細胞做比較，第六天時細胞數目會複製一倍，顯微鏡觀察到添加不同血清濃度（0.1%、0.5%、1%、5%和 10%）的鰻魚紅體細胞，10%

的血清濃度跟對照組比較，鰻魚紅體細胞生長狀況良好。實驗觀察到 0.1%的血清培養可讓細胞處於停止生長狀態，而細胞並不會死亡，因此適合在長時間藥物處理培養時，做為血清濃度的選擇。

(2) 血清濃度對鰻魚紅體細胞 VEGF 表現的影響：

由細胞代謝的實驗可知，含有10% 血清有較佳的培養結果，但是血清濃度是否會影響到鰻魚紅體細胞 VEGF 的表現呢？以未經血清培養的鰻魚紅體細胞當作對照組，然後分別加入 0.1%、0.5%、1%、5%和 10%的血清為實驗組，培養六天後，再抽出細胞之RNA，製備成 cDNA 後，再去進行即時定量聚合酶連鎖反應（real-time PCR），比較其 VEGF 基因與 28S 基因的表現。發現血清濃度在細胞培養六天後，細胞28S 基因與 VEGF 基因表現與血清濃度呈正相關增加，

但是其比值，即VEGF/28S 並無顯著正相關（圖五(A)和圖五(B)），推測血清濃度雖然增加會讓鰻魚紅體細胞生長良好，但是並不影響鰻魚紅體細胞的 VEGF 基因的表現。實驗觀察到 0.1%的血清培養可讓細胞處於停止生長狀態，而細胞並不會死亡，因此適合在長時間藥物處理培養時，做為血清濃度的選擇。

(3)VEGF 抗體對鰻魚紅體細胞代謝的影響：

兔子注射鰻魚 VEGF 重組蛋白而產生抗鰻魚 VEGF 血清，想要知道鰻魚紅體細胞的生長是否會受到抗鰻魚 VEGF 血清的影響，因此先取鰻魚的血清去培養鰻魚紅體細胞，再以不同稀釋濃度的抗鰻魚VEGF 血清（1/100、1/500、1/1000、

1/10000）處理鰻魚紅體細胞，以不含抗鰻魚 VEGF 血清的鰻魚紅體細胞做為對

照組，培養三天和六天。由細胞生長的分析（CellTiter）初步結果顯示，兔子抗鰻魚VEGF 血清並不會影響鰻魚紅體細胞的代謝（圖六(A)、(B)）。

三、鰻魚紅體之血管內皮細胞的證明

那麼鰻魚紅體細胞到底是由那些細胞所組成的呢？報告指出鰻魚紅體細胞大部分為血管內皮細胞，其面積約佔紅體微血管的70-80%之間（Buchanan and Wagner, 1990），因此利用血管內皮細胞的特性去證明血管內皮細胞在鰻魚紅體細胞中所佔之比例。

(1) DiI-AcLDL（Acetylated low-density lipoprotein）：

血管內皮細胞的細胞膜上，會有專一性的低密度脂蛋白接受器（low-density lipoprotein receptor）的存在，因此利用DiI-AcLDL能經由此接受器而噬入細胞內，經由FRET系統而發出綠色螢光。

鰻魚紅體細胞經由DiI-AcLDL在25℃、5%CO

2

培養overnight後，利用顯微鏡觀察，得到的結果如圖七(A)、(B)。圖七(A)是相位差顯微鏡，圖七(B)是螢光顯微鏡，(A)和(B)比較後，DiI-AcLDL的確有被鰻魚紅體細胞噬入而發出綠色螢光，

可以由此判斷鰻魚紅體細胞中的血管內皮細胞數目，但是因為鰻魚紅體細胞所噬入的DiI-AcLDL螢光強度很弱，而且背景值也有螢光產生，因此無法算確切比例，只能在視野中看出大部分都有噬入DiI-AcLDL而發出螢光，推估染上 DiI-AcLDL的細胞大約是60%左右。

(2) DAF（4,5-Diaminofluorescein）：

血管內皮細胞會產生一氧化氮（NO），而DAF會通過細胞膜跟一氧化氮結合，經由FRET系統而發出綠色螢光。鰻魚紅體細胞以DAF處理，在 25℃、5%CO

2

培養 6 小時，以顯微鏡觀察，得到的結果如圖八(A)、(B)。圖八(A)為相位差顯

微鏡，圖八(B) 為螢光顯微鏡，圖八(A)和圖八(B)比較後，鰻魚的紅體細胞在螢光顯微鏡下發出綠色螢光。顯示出鰻魚的紅體細胞會有一氧化氮的產生，但是螢光很弱而且背景值也會有螢光的產生，因此很難算出發出螢光的比例。

(3) PCR 的證明：

血管內皮細胞會表現VEGF 的基因，因此從鰻魚紅體細胞中抽取出 RNA 反轉錄成cDNA 後，以 cDNA 為模板，加入由實驗室已經定序出的鰻魚 VEGF 基因序列所設計出來的VEGF 引子（primers），做出 PCR 產物，再以 2％的 agarose gel 跑電泳，經 UV 照射後得到 VEGF 的條帶（如圖九）。經由 PCR 進行電泳分析與核酸定序的結果發現符合實驗室所設計出的引子所夾出片段的大小為 340bp。

(4)免疫染色法（Immunostaining）：

經由鰻魚的 VEGF 序列去設計成重組蛋白後所產生的兔子抗鰻魚 VEGF 血清，由免疫染色法，可將會產生VEGF 蛋白質的胞器染成藍色（如圖十）。對照組為沒加抗鰻魚 VEGF 的一級抗體，只加二級抗體，有部分細胞被染上微弱顏色（圖十(A)），為非特異性反應，視為背景值；實驗組為加抗鰻魚 VEGF 的一級抗體與二級抗體，利用相位差顯微鏡可以看出會產生 VEGF 蛋白質的細胞被染成藍色（圖十(B)）。但結果顯示出鰻魚紅體細胞並不是全部會和抗鰻魚VEGF 抗體反應。而且在相位差顯微鏡的視野底下去計算有被染成藍色的細胞或是完全沒有被染成藍色的細胞，將實驗組中顯微鏡視野所見全部的細胞去除以染成藍色的細胞，計算出百分比；將對照組中顯微鏡視野所見全部的細胞去除以染成藍色的細胞，計算出百分比，之後將實驗組百分比扣除對照組百分比，大約可得到 60%-80%左右的鰻魚紅體細胞有 VEGF 蛋白質的產生（表五）。

由以上四種分析方法證明鰻魚的紅體細胞絕大部分（60%-80%）都是血管內皮細胞。

(5) 即時定量聚合酶連鎖反應 VEGF 和 28S 的標準曲線：

標準曲線是將含有VEGF和 28S基因的質體（plasmid）為PCR的模板，進行 PCR反應，將得到的PCR的反應產物以連續 10 倍的稀釋進行即時定量聚合酶連鎖反應，將反應得到的VEGF和 28S的Ct值，取對數（log）與稀釋濃度做圖，在稀釋濃度 10

^-3

M到 10

^-7

M之間為標準曲線的直線區，樣本的濃度在此區間才具有意義（圖十一（A）、（B））。

四、刺激因子對鰻魚紅體細胞生長的影響：

女性生殖器官包含卵巢、子宮和胎盤，這些是成人組織中少數血管新生非常旺盛的部位，這些部位需要某些調控因子去調控，而VEGF便是調控女性生殖器官血管新生最重要的因子（Reynoldset al., 2002）。因此對於刺激因子刺激VEGF 的表現便是首要研究目標，而且性類固醇（sex steroids）是女性生殖器官成熟時所必須的賀爾蒙，因為性類固醇讓女性生殖器官成熟，而女性生殖器官成熟伴隨著血管新生，VEGF又是調控血管新生最重要的因子，因此性類固醇對於VEGF

在文檔中鰻魚紅體細胞細胞培養系統之建立與其血管內皮生成因子表現 (頁 35-47)