(一) 缺氧（Hypoxia）對鰻魚紅體細胞 VEGF 的影響：
缺氧（hypoxia）是誘發 VEGF 的產生的一個重要因子（Ladoux and Frelin, 1993）；一般實驗利用氯化鈷（cobalt chloride）模擬缺氧的情況，其原理是血管 內皮細胞上具有 HIF（hypoxia-inducible factor）（Yuan et al., 2003；Ratcliffe, 2002）。HIF 是位在核膜上的蛋白質，本身具有受體的功用。在有氧存在的情況 下，HIF 會經由氫氧化作用（Hydroxylation）而使 HIF 本身不活化，失去活性的 HIF 進一步會被蛋白酶體複合物（proteasome complex）降解（degradation）。相 反的，缺氧會活化HIF，而氯化鈷有類似缺氧的功能，能抑制氫氧化作用，活化 HIF，被活化的 HIF 進一步誘發 VEGF 基因的表現（Yuan et al., 2003；Ratcliffe, 2002）。同時，缺氧會幫助 VEGF mRNA 的穩定，而其中一個幫助 VEGF mRNA 穩定的因子就是轉錄因子（transcription factor）AP-1， VEGF mRNA 的 promoter 上有一個 AP-1 結合區（binding site），當缺氧發生時會誘發 VEGF 基因表現，
VEGF 基因表現時會藉由 AP-1 的活化去調控 VEGF posttranscription 的表現，因 此幫助VEGF mRNA 的穩定（Finkenzeller et al., 1995）。
以不同濃度（10
-5
M-10-9
M）氯化鈷處理鰻魚紅體細胞去培養三天和六天，想觀察氯化鈷是否會對細胞代謝產生影響，結果發現氯化鈷對於鰻魚紅體細胞的 代謝並無影響（如圖二十二所示）。
不同濃度氯化鈷（10
-5
M至 10-9
M）去處理鰻魚紅體細胞，氯化鈷濃度在 10-7
M、10-8
M會刺激鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現（如圖二十四所示）。另外以10
-7
M的氯化鈷處理鰻魚紅體細胞，在 0.5 小時即會刺激VEGF基因的表現，到第 6 小時VEGF基因表現降低（如圖二十五所示）。雖然說氯化鈷會誘發鰻魚紅體細胞 VEGF 基因的表現，但是氯化鈷對鰻魚 紅體細胞之代謝情況並無顯著影響，可能是鰻魚紅體細胞所產生的 VEGF 的量 並不足以讓鰻魚紅體細胞增生。氯化鈷和抗鰻魚 VEGF 的兔子血清都不影響鰻 魚紅體細胞的代謝，由此推估鰻魚紅體細胞所產生的 VEGF 蛋白質表現量非常 低，並不足以影響鰻魚紅體細胞生長代謝，事實上，我們實驗室另外有做酵素免 疫分析法（ELISA）和西方點墨法（Western bloting）來偵測鰻魚紅體細胞所產 生的VEGF，發現無法偵測到鰻魚紅體細胞所產生的 VEGF。由此可知在正常生 理狀態下，雖然 VEGF 對血管內皮細胞很重要，而且影響非常大，但是血管內 皮細胞產生VEGF 的量並無法促進細胞的生長或代謝。
(二) 性類固醇對鰻魚紅體細胞 VEGF 的影響：
性類固醇對於不同組織之血管內皮細胞，有不同的刺激作用，例如雌二醇注 射到母鼠時會刺激子宮VEGF 的產生（Ma et al., 2001），但是卻會降低下視丘室 旁核（Nucleus paraventricularis）VEGF 的表現（Sivug et al., 2002）。性類固醇對 血管內皮細胞的作用機制有兩種，一種是性類固醇進入到細胞質（cytoplasm）
與細胞質中游離的受體結合，直接進入細胞核內去調控基因的表現；但是近年來 有報告指出，性類固醇也會經由血管內皮細胞的細胞膜上特異性的受體（specific receptor ） 而 作 用 ， 經 由 細 胞 膜 上 的 受 體 引 發 一 連 串 的 信 息 傳 遞 （ signal transduction）來作用，當性類固醇接合到受體上時，會活化 G protein（GTP binding protein）並產生 GTP，這時有活性的 G protein 解離成兩部分，一小部份與鄰近 的酵素結合並活化之，使得ATP 轉變成 cAMP，進行一連串的信息傳遞（Suzuki
et al., 2003）
。(1) 雌二醇對鰻魚紅體細胞 VEGF 的影響：
在活體內的部分，將雌二醇注射至老鼠，觀察雌二醇對子宮 VEGF 的表現 情況，發現在第 2-4 小時之間，VEGF 的表現量達到最高峰，而在第 24 小時以 後VEGF 的表現則漸漸有衰退到最低的情況（Ma et al., 2001）。在離體部分，人 類 MCF-7 細胞株是對雌二醇敏感的乳癌細胞，經由雌二醇處理後會刺激 VEGF 的表現(Ruohola et al., 1999）。
本研究以不同濃度雌二醇（10
-5
M-10-11
M）處理鰻魚紅體細胞培養六天，雌 二醇對刺激鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現並沒有顯著的影響（如圖十一所 示）。另外10-7
M雌二醇處理鰻魚紅體細胞（0.5 小時、1 小時、2 小時、3 小時和 6 小時），發現雌二醇在2 至 3 小時開始促進鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現（如 圖十二所示）。鰻魚紅體細胞經雌二醇長期（六天）處理對鰻魚紅體細胞VEGF 的表現除 10-9
M雌二醇外，其它無顯著刺激作用，但 10-7
M雌二醇短時間卻可以 刺激鰻魚紅體細胞VEGF基因表現，雌二醇經受體刺激鰻魚紅體細胞VEGF基因 的表現是時間很短暫，無法長期持續刺激鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現。而且 鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現與活體內雌二醇注射至老鼠子宮的情形類似（Maet al., 2001）
，雌二醇注射老鼠在2-4 小時子宮VEGF表現最高，而雌二醇處理鰻 魚紅體細胞，鰻魚紅體細胞VEGF基因表現 2-3 小時表現最高；至於高濃度雌二 醇是否會抑制鰻魚紅體細胞VEGF的表現，還不能確定，需進一步研究。在脊椎動物性類固醇的受體與性類固醇作用通常並不是長時間持續作用，而 是短時間作用，短暫作用後恢復原來的狀態後再繼續作用，如此有週期性的連續 反 覆 作 用 ； 但 是 若 是 長 時 間 持 續 作 用 ， 性 類 固 醇 受 體 會 有 去 敏 感 性 作 用
（desensitization），因此造成性類固醇作用降低，甚至無法作用，例如LHRH
（luteinizing hormone-releasing hormone）長時間（連續30天）注射母鼠，發現LHRH 受體基因表現降低（Horvath et al., 2002），高濃度的黃體激素（Progesterone）會 降低下視丘黃體激素受體（hypothalamic progestin receptors）的敏感性（Blaustein,
1982）。由此可知，若是性類固醇受體去敏感性作用發生，會導致性類固醇無法 作用，而雌二醇也有可能長時間（六天）處理鰻魚紅體細胞導致雌二醇性類固醇 受體去敏感性作用，使鰻魚紅體細胞VEGF基因表現降低。
雌二醇的生理濃度在脊椎動物中約為 10
-7
M，所以利用 10-7
M雌二醇處理鰻 魚紅體細胞；但是長時間雌二醇處理鰻魚紅體細胞在10-9
M雌二醇有刺激鰻魚紅 體細胞VEGF的表現而不是 10-7
M雌二醇，可能的原因是因為鰻魚個體上的差 異，活體外（in vitro）培養可能會造成與生理值不同的情況，另一個可能的原因 是雌二醇刺激鰻魚紅體細胞VEGF的表現是非常短暫的（幾小時之內）。但事實 上，鰻魚特殊的生理狀態跟一般的脊椎動物的生理狀態不同，雌二醇的生理濃度 在鰻魚之中即使是在銀鰻階段 其體內雌二醇的生理濃度也只有 10-9
M左右（0.7 + 0.07 nM至 9.04 + 0.81 nM）（Querat et al., 1987），故長時間雌二醇處理鰻魚紅 體細胞在10-9
M雌二醇有刺激鰻魚紅體細胞VEGF的表現而不是 10-7
M雌二醇。(2) 睪固酮對鰻魚紅體細胞 VEGF 的影響：
老鼠S115細胞株是對睪固酮敏感的老鼠乳癌細胞，經由睪固酮處理S115，
結果發現S115在睪固酮處理24小時以後，VEGF的表現才開始增加(Ruohola et al., 1999）。人類臍帶靜脈血管內皮細胞以睪固酮處理後，發現睪固酮會促進人類臍 帶靜脈血管內皮細胞產生細胞凋亡（apoptosis）；此外，也發現用睪固酮處理人 類臍帶靜脈血管內皮細胞後，在早期會誘發人類臍帶靜脈血管內皮細胞的生長
（數小時），但是到了晚期（數天）時會誘發細胞凋亡（Ling et al., 2002）；至 於為何會造成血管內皮細胞細胞凋亡，有報告指出，血管內皮細胞上的VEGF受 體如果被抑制，VEGF無法和VEGF受體結合，會造成血管內皮細胞誘發細胞凋 亡（Hamada et al., 2005）。但是睪固酮是否經由抑制VEGF受體而誘發細胞凋亡，
目前仍無報告指出，需進一步研究。
使用人類表皮細胞株PNT1，以二氫睪酮DHT（Dihydrotestosterone）處理PNT1
後4 小時， 發現二氫睪酮會刺激PNT1 的VEGF mRNA表現並持續表現到 24 小 時，而在24 小時以後VEGF mRNA表現量則有下降的趨勢；此外，利用不同濃 度二氫睪酮（10
-7
-10-11
M）處理PNT1 三天後，發現二氫睪酮濃度與VEGF表現情 況成正相關，當二氫睪酮濃度增高時，VEGF表現量也隨之增加（Sordeallo et al., 1998）。以睪固酮注射至成鼠體內會發現VEGF表現情況與老鼠前列腺側葉（ventral lobe）重量成正相關，當VEGF表現增加時，老鼠前列腺側葉重量因血 管新生而隨之增加（Sordeallo et al., 1998）。
本實驗以不同濃度睪固酮（10
-5
M-10-11
M）處理鰻魚紅體細胞培養六天，睪 固酮對刺激鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現並沒有顯著的影響（如圖十四所 示）。另外10-7
M睪固酮處理鰻魚紅體細胞（0.5 小時、1 小時、2 小時、3 小時和 6 小時），發現睪固酮在2 至 3 小時開始促進鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現（如 圖十五所示）。長時間處理睪固酮對於鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現並無顯著 影響，但是短期處理睪固酮會刺激鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現，推測睪固酮 刺激鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現是短暫即消失，無法長期累積的。睪固酮並 無造成鰻魚紅體細胞產生細胞凋亡的現象，鰻魚紅體細胞VEGF基因的表現與雌 二醇類似。睪固酮的生理濃度在脊椎動物中為 10
-7
M，所以利用 10-7
M睪固酮去處理鰻 魚紅體細胞；但是長時間睪固酮處理鰻魚紅體細胞在10-9
M睪固酮有刺激鰻魚紅 體細胞VEGF的表現而不是 10-7
M睪固酮，可能的原因是因為鰻魚個體上的差 異，活體外（in vitro）培養也可能會造成與生理值不同的情況，另一個可能的原 因是睪固酮刺激鰻魚紅體細胞VEGF的表現是非常短暫的。但是鰻魚特殊的生理 狀態與脊椎動物的生理狀態不同，即使鰻魚在銀鰻的階段，其體內睪固酮也只有 10-9
M左右 （0.7 + 0.07 nM至 9.04 + 0.81 nM）（Querat et al., 1987），故長時間睪 固酮處理鰻魚紅體細胞在 10-9
M睪固酮有刺激鰻魚紅體細胞VEGF的表現而不是 10-7
M睪固酮。(3) 黃體激素對鰻魚紅體細胞 VEGF 的影響：
利用黃體激素處理牛視網膜色素表皮細胞（bovune retinal pigment epithelial cells，簡稱 RPE），能刺激 VEGF 的增加，而且黃體激素濃度比雌二醇濃度低即 可刺激牛視網膜色素表皮細胞VEGF 蛋白質的產生（Sone et al., 1996）。利用黃 體激素注射至老鼠，發現VEGF 表現至第 6 小時開始增加，直至第 12 小時表現
利用黃體激素處理牛視網膜色素表皮細胞（bovune retinal pigment epithelial cells，簡稱 RPE），能刺激 VEGF 的增加，而且黃體激素濃度比雌二醇濃度低即 可刺激牛視網膜色素表皮細胞VEGF 蛋白質的產生（Sone et al., 1996）。利用黃 體激素注射至老鼠，發現VEGF 表現至第 6 小時開始增加，直至第 12 小時表現