四、血管內皮生長因子（VEGF）基因表現的分析：

(一) 藥物處理細胞：

經細胞計數之後的細胞總數，計算細胞數的濃度約每毫升10

⁵

至10

⁶

的細胞 數，平均種入12 well plate之中，然後以10％的胎牛血清，培養液總體積為1.5毫 升，在25℃、5％CO

2

的條件下培養三天。三天後將培養液抽出，以1XPBS將殘 餘培養液清洗乾淨，加入含有刺激VEGF或抑制VEGF的藥物的培養液（但是不 含血清），培養在25℃、5％CO

2

的培養箱之中，依照不同時間處理藥物後的細 胞，去抽取細胞的total RNAs。藥物處理分為：(1)含有0.1%血清下的鰻魚紅體細 胞，長期處理藥物六天（三天要換一次培養液），之後抽取細胞的RNA，製備 成cDNA後進行即時定量聚合酶連鎖反應（real-time PCR）。(2) 含有0.1%血清 下的鰻魚紅體細胞，長期處理藥物三天，抽取細胞的RNA，製備成cDNA後進行 即時定量聚合酶連鎖反應。(3)短期處理藥物，在不含血清的培養液培養0、0.5、

1、2、3至6小時等不同時間抽取細胞的RNA，製備成cDNA後進行即時定量聚合 酶連鎖反應。

(二) 抽取 total RNA：

將不同時間處理藥物後的細胞，利用Viogene公司的total RNA Mini kit抽取 total RNA。首先抽取出培養液，以PBS將殘餘的培養液洗淨，每個well加入 700μl 的RX buffer（每 1 毫升的RX buffer含有 10μl的β-mercaptoethanol），靜置 5 分鐘 後，然後將含有RNA的上清液（supernatant）取進微量離心管（已滅菌的 1.5 ml eppendorf，無RNase）中，加入與RX buffer等體積的 75%酒精（700 μl）並均勻 振盪混合後，再將混合後之液體取至Total RNA Mini column中，然後在室溫下離 心14000rpm、1 分鐘，使之通過Total RNA Mini column。將離下的液體丟棄，加 入0.5 毫升之WF buffer，在室溫下離心 14000 rpm、1 分鐘，使之通過column。

再將離下的液體丟棄、加入0.7 毫升之WS buffer，在室溫下離心 14000 rpm、1 分鐘，使之通過column。再將離下的液體丟棄、在室溫下離心 14000rpm、三分 鐘，目的在於去除酒精成分。離心後，將此column裝在RNase-free Elution tube中，

加入30μl的RNase-free ddH

2

O，盡量加到mini column filter的中間，靜置一分鐘。

室溫下離心9000rpm、2 分鐘。離心後，將流至微量離心管中的液體部分先儲存 在-70℃冰箱中備用（該液體為total RNAs）。

(三) cDNA 的製備（Revese Transcription，簡稱 RT）：

將抽出之total RNA，先測定吸光值取出2μl total RNA 加入98μl滅菌水中，以 OD

260

與OD

280

去偵測RNA吸光值進而去計算RNA濃度。RNA濃度=(RNA的吸光 值(OD

260

)×40×稀釋倍數)/1000。計算出的RNA濃度以含有1μg的RNA濃度，去製 備cDNA。利用SuperScript™ II RT的kit進行反轉錄合成cDNA，首先在無核酸酶

（nuclease-free）的微量離心管中，取1μg濃度的RNA，加入含有Oligo(dT)

15

primer、total RNA、dNTP Mix和滅菌水至其反應體積為13 µl。將其反應混合液

混和均勻後，在65℃加熱5分鐘後，快速置於冰上冷卻1分鐘。短暫離心後，加入 5X First-Strand Buffer、0.1M DTT、RNaseOUT

^TM

Recombinant Ribonuclease Inhibitor、SuperScript™ II RT，使總體積為20µl後混和混勻。在25℃下反應5分鐘，

50℃反應60分鐘，70°C 反應15分鐘，最後維持在4℃。cDNA保存於-20℃冰箱，

作為即時定量聚合酶連鎖反應（real-time PCR）與聚合酶連鎖反應（PCR）的模 板。

反應物 體積 Oligo (dT) 1μl

RNA (濃度 1μg)

10μM dNTP 1μl

ddH2O 其餘補水至 13μl

反應物 體積 5x First stand Buffer 4μl 0.1 DTT 1μl RNase out Recombinant RNase Inhibitor 1μl Super script^TM II RT 1μl 反應總體積 20μl

(四) 即時定量聚合酶連鎖反應（Real-time polymerase chain

reaction，簡稱Real-time PCR）

即時定量聚合酶連鎖反應（real-time PCR）其原理是：針對有特異性的核酸 設計探針（probe）、並在PCR反應中加入螢光染劑，利用螢光信號的累積即時 監測整個PCR過程，利用所偵測到的Ct值，去計算出起始的濃度。所謂的C代表 循環(Cycle)，T代表閾值(Threshold)，Ct值是指每個反應管內的螢光信號到達設 定的閾值時所經歷的循環數，每個樣本（sample）的Ct值與該cDNA起始濃度的 對數存在線性關係，起始濃度越多，Ct值越小，即Ct值與起始濃度成反比，利用 已知起始濃度的標準品可做出標準曲線，因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可

從標準曲線上計算出該樣本的起始濃度。

使用購自ABI公司（Applied Biosystems, USA）的SYBR Green PCR Master Mix，先將SYBR Green PCR Master Mix，實驗室設計的引子（VEGF的primer和 28S的primer）和滅菌過的蒸餾水配成stock混合液備用。先做標準曲線，標準曲

qVEGF-184R：GGTACTCCTGGTAGATGTCCACAA

28S primer的序列 q-28S-F：CCTGCGTTCCTCTCGTACT

q-28S-R：CCGTCGTGAGACAGGTTAGTTT

在文檔中 鰻魚紅體細胞細胞培養系統之建立與其血管內皮生成因子表現 (頁 30-34)