<一>、細胞培養
實驗中所使用的細胞材料相同於第貳章之「二、材料與方法」中「細 胞培養」之方法。將細胞培養於 3.5 cm 圓形培養皿中，細胞密度為 9.6 × 105 cells/dish。於 5% CO2，37℃之恆溫培養箱中培養至十四天後即可供 實驗之用。
<二>、放射線[3H]分析法分析 IP3
1-1. 細胞膜的製備
用於結合 IP3 的細胞膜材料取自雄性 Sprague-Dawley 成鼠(體重約 200 克)之小腦。將清醒狀況下大鼠以極快之速度斷頭取出小腦部位，並 清除腦上之其它組織後，置入冰冷之三十倍體積之緩衝液 A註一中以均質 機均質(1500rpm)。將均質液以 13,000 rpm 之速度於 4℃下離心 15 分鐘，
倒去上清液，將沉澱再次懸浮於緩衝液 A 中，再離心，如此重復兩次後，
將最後之沉澱懸浮於十倍體積之緩衝液 A 中，即製成細胞膜懸浮液，分 裝並貯存於-70℃。
1-2. 細胞膜懸浮液之蛋白質含量測定
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進行放射線[3H]分析法前，試樣均先進行蛋白質含量(protein assay) 測定，以調整分析試樣時有一致含量之蛋白質(3 mg/ml)。根據 「Lowry method」，取 50 µl 試樣溶液置於 plastic curvette 中，加入 2.5 ml Bio-Rad 蛋白質染料試劑(dye reagent)，混合後靜置 30 分鐘呈色，於 595 nm 波長 下測其吸光值。蛋白質含量標準曲線由 Bovine Serum Albumin (BSA) 所 配製之標準溶液而得之。
2-1. 實驗方法及細胞內 IP3 之抽取
實驗當天吸去細胞培養液，以 PBS 溶液清洗細胞一次，全部實驗過 程均在 37℃之水浴槽下操作。吸乾細胞清洗液，加入 DMEM 含 glucose 不含 serum 之培養液，於 37℃之水浴槽靜置 4 分鐘，加入不同藥物與細 胞一同培養 (0, 5, 10, 30 sec)。時間到時，立即將細胞培養皿移至冰盤上 放置以終止反應，同時並吸乾培養液，隨即加入 0.5 ml 冰冷之 TCA 溶液
註二，細胞培養皿連同冰盤置入 4℃冰箱中靜置 60 min，以將細胞內 IP3 抽提至 TCA 溶液中。將 TCA 抽提液吸起置入塑膠試管內，而留在細胞 培養皿上之細胞則以蒸餾水浸洗兩次後留作蛋白質含量分析用(步驟 2-2)。TCA 抽提液必須以水飽合之 diethyl ether 註三浸洗過，以將 TCA 萃 取至 ether 溶液內，留下 IP3 於水層當中。加入兩倍體積之 diethyl ether 至試管內，振盪混合十秒後靜置使溶液分層，吸取上層 ether 溶液，再加
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入 diethyl ether 至試管內重覆浸洗四次，殘留之 ether 溶液可以氮氣在室 溫下吹乾。吸取剩留於試管內之水溶液，置於 eppendorf tube 中，加入十 分之一體積之 Tris-base 溶液(500 mM, pH=8.4)中和之，混合均勻後置入 -70℃中貯存。
2-2. 細胞之蛋白質含量測定
進行放射線[3H]分析前，細胞均先行進行蛋白質含量(protein assay) 測定，以調整分析結果有一致含量之蛋白質。將以 TCA 溶液抽提過 IP3 之細胞培養皿加入 0.5 ml 之 1N NaOH 溶液於 45℃下靜置 30 min，則附著 於細胞培養皿上之細胞會脫離培養皿而懸浮於 NaOH 溶液中，吸取所有 細胞溶液分別置入 eppendorff tube 中，於 60℃水浴槽內加熱 30 min，之 後待試樣冷卻則進行蛋白質含量(protein assay)測定。根據「Bio-Rad method」，取 50 µl 試樣溶液置於 plastic curvette 中，加入 2.5 ml Bio-Rad 蛋白質染料試劑 (dye reagent)，混合後靜置 30 分鐘呈色，於 595 nm 波 長下測其吸光值。蛋白質含量標準曲線由 Bovine Serum Albumin (BSA) 所配製之標準溶液 (0-0.6 mg/ml)而得之。
3. 放射線[3H]分析法分析 IP3
分析過程均於 4℃之冰盤上操作。準備 eppendorff tube，依序加入下
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列溶液：50 µl Buffer B, 100 µl 細胞試樣或標準 IP3註五溶液，30 µl 之[3H]
標誌 IP3 (11 nM)，95µl 之小腦細胞膜懸浮液 (60-100 µg protein) 而成反 應混合液。反應混合液於 4℃冰浴下反應 15 min，之後離心 (4℃, 14,000×g, 5 min)，吸去上清液，沉澱再次懸浮於 0.5 ml 之 1 N NaOH 溶液中，於 60
℃下消化 30 min，加入 0.1 ml 之 0.5 N HCl 溶液中和之；最後加入 5 ml 之訊號放大液 (scintillation fluid, amplified agent)，即可偵測試樣之放射 線強度。(Tri-carb 1500, Liguid Scintillation Analyser)
註一：緩衝液 A 之組成份為：50 mM Tris-HCl，1 mM EDTA, 1 mM 2-mercaptoethanol；
新鮮配製，酸鹼值調至 7.7。
註二： TCA 溶液濃度為 1 M，溶於滅菌蒸餾水中，並置於 4℃下避光貯存。
註三： ether 必須先以水飽合過，以避免處理過程 ether 會吸收細胞水份。
註四：Buffer B 組成份為：50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM 2-mercaptoethanol；
新鮮配製，酸鹼值調至 8.4。
註五：標準 IP3 溶液以 Buffer B 溶液配製，配製濃度為 0-1100 picoMolar。
<三>、藥物或化學物
Carbachol, glutamate, potassium chloride (KCl), trichloroacetic acid (TCA), Tris-base 購 自 Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO, USA).
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Potassium cyanide (KCN) 購自 Merk Chemicals (Darmstadt, Germany)。
Ins(1,4,5)P3購自 Calbiochem (San Diego, CA, USA)；[3H]Ins(1,4,5)IP3購自 England Nuclear (Boston, MA, USA)
<四>、統計分析
結果之表示以平均值加減標準誤差（mean±s.e.m.），並以細胞培養 之次數為平均。為單因子變異數分析時，統計上平均值之差異以 Student’s t-test 決定之。為多重因子變異數比較時，結果之分析以 one-way ANOVA 表示之。P 值小於 0.05 稱為有顯著統計上之差異。
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