第參章 厚朴酚對氰化鉀引起細胞損傷影響之初探
二、 材料與方法
<一>、細胞培養
實驗中所使用的細胞材料相同於第貳章之「材料與方法」內「細胞
34 培養」中所述。
<二>、細胞免疫化學染色法與細胞形態
接種於 4 孔槽平盤培養皿並培養 14 天之細胞先吸去培養液，以 PBS
註1緩衝溶液洗 2 次，然後加入 4% paraformaldehyde註2固定 10 min。再次 以 PBS 緩衝溶液洗 2 次之後加入 3% H2O2和 10% methanol 溶於 0.1 M PBS 之混合溶液行過氧化作用 15 min。然後將細胞浸於 5% 脫脂奶粉(skim milk)溶於 0.05M TBS 註3的溶液中 30 min 當作 blocking buffer，填補抗原 沒有吸附到的孔槽空隙，以避免非專一性的吸附。接著以 0.05 M TBST註
4浸洗細胞，吸乾液體，加入對特殊細胞具特異性之單株抗體(monoclonal antibody)，並在 4℃下培養過夜。神經元細胞(neuron)的形態(morphology) 染 色 使 用 的 抗 體 為 微 管 相 聯 性 蛋 白 質 -2 (microtubule associated protein-2)，濃度為 1:400；星狀神經膠細胞(astrocyte)的抗體為神經膠細 胞酸性纖維蛋白質(glial fibrillary acidic protein)，濃度為 1:500。之後用 0.05 M TBST 浸洗細胞，吸乾液體，加入二次抗體(secondary antibody) 註5於 室溫下培養 2 小時。再次用 TBST 浸洗後，培育於 avidin-biotinated horse-radish peroxidase 中 30 min，並接著使用 DAB 呈色 15 min 及 hematoxylin 作背景染色。
註 1：PBS 組成為 0.1 M Na2HPO4, 0.1M NaH2PO4, 0.9 % NaCl，酸鹼度調至 pH＝7.4
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註 2：paraformaldehyde 溶於 0.1 M PB 緩衝溶液中，0.1 M PB 組成為 0.1 M Na2HPO4, 0.1M NaH2PO4
註 3：0.05 M TBS 組成為 0.05 M Tris [hydroxymethyl]amino-methane 加入 0.9 % NaCl，
酸鹼度調至 pH＝7.6
註 4：0.05 M TBST 組成為 TBS 加入 0.02 % Tween-20
註 5：實驗中使用之二次抗體為 horse anti-mouse IgG，濃度為 1:25，稀釋於 0.05 M TBS
<三>、螢光染色分析與細胞核變化
接種於 4 孔槽平盤培養皿並培養 14 天之細胞先吸去培養液，以 PBS註
1緩衝溶液洗 2 次，然後加入 4% paraformaldehyde註2固定 10 min。再次以 PBS 緩衝溶液洗 2 次之後加入濃度 1:1000 的螢光染色劑 DAPI (稀釋於 100
﹪methanol)，其能與細胞核中的 DNA 鍵結，培育 10 min 作細胞核染色。
於螢光顯微鏡下觀察比較細胞核有無分裂或縮小情況，並計算完整細胞核 的數目有無變化。
1、細胞計數
細胞經免疫化學染色後，經顯微鏡(Olympus)放大 200 倍取景照相，
底片為 35 mm Kodak VX-100 彩色負片。沖洗出 3×5 吋彩色相片，以相 片分別計算出神經元細胞及神經膠細胞之總數，並利用墨汁點去已算過
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的細胞以為記號。細胞計數採兩次實驗之結果，每兩個孔槽取十處景並 平均計算之。
<四>、細胞毒性分析---乳酸脫氫脢 (LDH) 之測定
相同於第貳章之「材料與方法」內「細胞毒性分析---乳酸脫氫脢 (LDH) 之測定」中所述。
<五>、細胞生存力的分析---粒腺體琥珀酸脫氫脢 (MTT) 之測定
使用 MTT 來作定量測定細胞增生(cell proliferation) 及活化之程度 (Denizot-F, 1986)。此項分析基礎在於存活細胞中含有粒線體琥珀酸脫氫 脢 (mitochondrial succinate dehydrogenase)，可以將黃色 tetrazolium salt (MTT) 轉換成紫色 formazan 結晶，此紫色 formazan 結晶為可溶性並且 形成有顏色之溶液，藉由測定其於 570 nm 波長下之吸光值，對照細胞數 目所得到之標準曲線，可得到實驗結果，參考波長為 630 nm。
<六>、藥物或化學物
D-(L)-glucose; N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (Hepes); D-(L)-glucose; glial fibrillary acidic protein (GFAP); (microtubule associated protein-2) MAP-2; 4,6-diamidino-2-phenylindole; dihydrochloride (DAPI); 3,3'-diamidinobenzidine tetrahydrochloride (DAB) 購 自 Sigma
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Chemicals Co (St. Louis, MO, USA).
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 及 lactate dehydrogenase (LDH) kit 購自 Boehringer Mannheim (Germany).
Potassium cyanide (KCN)購自 Merk Chemicals (Darmstadt, Germany) and ABC kit 購自 Vector (Vector, Burlingame, CA, USA).
<七>、統計分析
結果之表示以平均值加減標準誤差（mean±s.e.m.），並以細胞培養 之次數為平均。為單因子變異數分析時，統計上平均值之差異以 Student’s t-test 決定之。為多重因子變異數比較時，結果之分析以 one-way ANOVA 表示之。P 值小於 0.05 稱為有顯著統計上之差異。
38 三、
結果
<一>、神經元及神經膠細胞形態的改變
圖1 由免疫化學細胞染色法可看出，鼠腦皮質細胞受到氰化鉀的傷害，
神經元(neuronal cells)會發生形態上之改變，但神經膠細胞(glial cells)則 無。培養14天之成熟細胞，經細胞計數後結果約有30﹪為神經膠細胞，70
﹪為神經元細胞。而在無糖的實驗情況下，氰化鉀引起之神經毒性會造 成神經元細胞數目減少及網狀結構形成之損害 (impairment of network formation)。
<二>、細胞乳酸脫氫脢 (LDH) 釋放量的影響
圖 2 對細胞處理氰化鉀並培養於含糖或不含糖之培養液中 30, 60, 120 分 鐘發現，在含糖之培養液中 60, 120 分鐘後，細胞外 LDH 分別較控制組 增加 50﹪及 30﹪；而在不含糖之培養液中 60, 120 分鐘後，細胞外 LDH 分別較控制組增加 63﹪及 20﹪。由結果比較得知，缺氧並且缺糖(含 KCN，不含 glucose)的情況下培養 60, 120 分鐘後，細胞外 LDH 分別較缺 氧不缺糖組(含 KCN，含 glucose)增加 156﹪及 179﹪。此一結果明顯指 出，細胞缺糖的結果會加重化學性缺氧造成之神經細胞毒性。
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<三>、細胞生存力的影響
圖 3 細胞處理方法同結果<二>，存活細胞數目之測定利用 MTT 之分析。
在含糖之培養液中 30, 60, 120 分鐘後，存活細胞數目均較控制組減少約 20﹪；在不含糖之培養液中 30, 60 分鐘後，存活細胞數目分別較控制組 減少 9﹪及 37﹪，而 120 分鐘後，存活細胞數目幾乎無法測得。由結果 比較得知，缺氧並且缺糖(含 KCN，不含 glucose)的情況下培養 30, 60 分 鐘後，存活細胞數分別較缺氧不缺糖組(含 KCN，含 glucose) 減少 17﹪
及 66﹪。此一結果可以看出，KCN 對細胞生存力的影響與細胞乳酸脫氫 脢的影響相同。
<四>、厚朴酚對細胞乳酸脫氫脢的影響
圖 4 為了研究厚朴酚對化學性缺氧引起細胞傷害的保護作用，對細胞處 理氰化鉀並且併用不同濃度厚朴酚，分析培養液中 LDH 含量。結果發現 厚朴酚對 KCN 引起的 LDH 有濃度依存性的減少作用，厚朴酚在 10 µM 及 100µM 濃度時分別較 KCN 組減少 17﹪及 36﹪；然而，750µM 濃度厚 朴酚不但未減少 LDH，反而引發較 KCN 組更大量之 LDH。由此結果可 得知，100µM 濃度厚朴酚最能有效減少 KCN 造成之神經細胞毒性，而過 量之厚朴酚反而對細胞有害。
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<五>、厚朴酚對細胞核的影響
圖 5 為了研究 KCN 造成的神經細胞死亡方式為凋零死(apoptosis)亦或 壞死(necrosis)，我們利用螢光染色劑 DAPI 觀察比較細胞核有無分裂或 縮小情況，並計算完整細胞核的數目有無變化。缺氧(hypoxia：含 KCN，
不含 glucose)及厚朴酚對神經元及神經膠細胞細胞核的影響則同時分別 使用 MAP-2 及 GFAP 作免疫染色法標識。由染色結果可看出，GFAP 標 識之細胞無外形或細胞核上的變化，而 MAP-2 標識細胞之細胞核數目減 少，但沒有細胞核萎縮(condensation)的現象，此一結果可以說明細胞的 死亡應該是經由 necrosic 的過程，而非 apoptotic。厚朴酚對於細胞的保 護作用，則利用計算完整細胞核的數目有無變化，結果發現 KCN 培養 60, 120 分鐘後，細胞核的數目分別較控制組減少 57﹪及 51﹪，此一結果 與經 MAP-2 免疫標識的細胞減少數目相同。另一方面，於培養 60, 120 分鐘後，100µM 厚朴酚則增加細胞核的數目分別較 KCN 組高 50﹪及 121
﹪。由此可見，厚朴酚保護細胞免於 KCN 的毒性作用與細胞乳酸脫氫脢 的結果一致。
<六>、厚朴酚對神經元細胞數目的影響
圖 6 對細胞處理氰化鉀並培養於不含糖之培養液中 120 分鐘後，神經元
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細胞使用 MAP-2 作免疫染色法標識，明顯發現神經元細胞數目減少而且 神經結構受損，此氰化鉀引起之神經毒性可被厚朴酚所減弱。
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圖 1
Fig.1. Neuron toxicity in mixed cortical cultures following chemical hypoxia treatment. Fixed 14-day-old MAP-2-positive neurons (A) and GFAP-positive astrocytes (B) were treated with glucose-free vehicle media (C for MAP-2-positive and D for GFAP-positive) or KCN for 2 hr (E for MAP-2-positive and F for GFAP-positive). Scale bar = 50 µm.
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圖2
LDH content ( % of control)
0
Fig.2. Effect of glucose and KCN on cell viability by extracellular LDH activity. Primary mixed cultures were grown as described in Materials and Methods. On the day of the experiment, the media were removed, and the cultured cells were treated with KCN (0.5 mM) in glucose-free DMEM for the indicated times (30, 60 and 120 min). The release of LDH activity in the culture medium was determined and expressed as a percentage of vehicle (mean±S.E.M., n=10). Asterisks indicate statistically significant increase in KCN-induced LDH release (**P<0.01 vs. glucose(-) and KCN(-); ##P<0.01,
###P<0.001 vs. glucose(+) and KCN(-)).
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圖 3
T im e(m in)
MTT level (% of control)
0
Fig.3. Effect of glucose and KCN on cell viability by MTT reduction. Primary mixed cultures were grown as described in Materials and Methods. On the day of the experiment, the media were removed, and the cultured cells were treated with KCN (0.5 mM) in glucose-free DMEM for the indicated times (30, 60 and 120 min). The amount of MTT formazan produced was expressed as a percentage of vehicle (mean±S.E.M., n=9). Asterisks indicate statistically significant reduction of KCN-induced formazan . [**P<0.01, ***P<0.001 vs.
glucose(-) and KCN(-); #P<0.01, ##P<0.001 vs. glucose(+) and KCN(-)].
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圖 4
LDH content ( % of control)
# # #
Fig.4 Effect of magnolol (mag) on KCN-induced release of LDH in mixed cultured cells. Magnolol was dissolved in DMEM without glucose but with 0.1
% DMSO. Data were expressed as a percentage of vehicle (mean ±S.E.M.) from two separate experiments, each performed using five dishes (n=10).
Asterisks indicate statistically significant increase in KCN-induced LDH release and significant decrease in LDH release in the presence of magnolol [###P<0.001 vs. glucose(-) and KCN(-), *P<0.05, ***P<0.001 vs. glucose(-) and KCN(+)].
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圖 5-1
Fig. 5-2 The total numbers of fluorescent DAPI-stained nuclei following KCN or magnolol (Mag) treatment for 2 hr. Cells were seeded onto a 4-well chamber slide at 2×105 cells/well for 14 days, then treated with 0.5 mM KCN, 100 µM magnolol or a combination of the two for 1 and 2 hr. The number of cells counted by DAPI-staining in (A) and (B) for vehicle, (C) and (D) for KCN-treatment, and (E) and (F) for KCN combined with magnolol.
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圖 5-2
Fig. 5-2 The total numbers of fluorescent DAPI-stained nuclei following KCN or magnolol (Mag) treatment for 2 hr. Cells were seeded onto a 4-well chamber slide at 2×105 cells/well for 14 days, then treated with 0.5 mM KCN, 100 M magnolol or a combination of the two for 1 and 2 hr. Data expressed as a percentage of vehicle (mean S.E.M.) from two separate experiments, each performed using five wells (n=10). Asterisks indicate statistically significant difference when compared with control groups [**P<0.001 vs.
glucose(-) and KCN(-); #P<0.01,##P<0.001 vs. glucose(-) and KCN(+)].
60 min 120 min
cell nuclei number ( % of control)
0