一、緒言
經由缺氧或缺血產生的神經變性機轉，大致包含下列情形一鈣離子的 衡定、神經傳遞物質的釋放、缺氧性壓力以及發炎反應。化學性缺氧模 式對於探討神經變性的分子機轉是相當便利且有效的（Gibson et al., 1991）氰化鉀會干擾電子鏈的傳遞而阻斷呼吸作用（Jones et al., 1984）
已知對神經元會造成不可逆的改變，而此種改變與缺氧之結果極為相 似。因此，施以氰化物常被使用為模擬化學性缺氧的模式。為了研究細 胞因缺氧而導致傷害或死亡，以氰化鉀引發細胞類似缺氧之功能性傷害 是一個便利的方法。（Gibson, 1991; Golberg, 1989; Lee, 1998）
在花生四烯酸之各種代謝產物中，PGE2在產生腦部或神經元傷害的 發炎性反應過程中扮演重要環節，在化學性缺氧（ Yang, 1994）、缺血性 缺氧（Yoshida, 1980; Abe, 1988; Ellis, 1981）及細菌性脂多醣體（LPS）
引發的炎性反應中亦同。除 PGE2外，一氧化氮（NO）在炎性反應的過 程中亦扮演指標性角色（Boneh, 1997; Molina, 1995）。
在體內實驗的結果顯示，厚朴酚能減少因缺血後再灌流（reperfusion）
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引起的大鼠心臟部位梗塞壞死面積（Hong-CY, 1996）。在體外實驗中，
厚朴酚能保護大鼠心臟細胞，提升細胞內粒腺體對抗脂質過氧化的作用
（Lo-YC, 1994）。此外，皮下注射厚朴酚能降低前列腺素 E2（PGE2）及 白三烯素（LTB4）含量而減少因 A23187 所引起之大鼠後蹠浮腫程度
（Wang-JP, 1995）。而本次研究結果顯示厚朴酚能降低化學性缺氧對於 體外培養之大鼠大腦皮質神元膠質細胞之傷害，因此本次實驗接下來要 探討厚朴酚是否係經由對抗缺氧引發之發炎介質 PGE2及 NO 的釋放而 保護神經細胞避免傷害。
二、材料與方法
<一>、細胞培養
實驗中所使用的細胞材料相同於第貳章之「材料與方法」內「細胞 培養」中所述。
<二>、細胞釋放前列腺素 E2之測定
前列腺素 E2之測定乃是使用商業製劑免疫分析系統 （immuno assay kit）（R&D system）。將培養至 14 日齡，平貼於培養皿之細胞自培養箱 取出，置放於水浴恒溫槽內（37℃）以 DMEM 含 20mM Hepes 之培養液 潤洗兩次後，分別加入 0.5mM KCN, 100ng/ml LPS 或 100µM magnolol，
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實驗用藥之配製溶液均使用 DMEM 含 20mM Hepes 之培養液。細胞加入 藥物後於 37℃水浴槽分別放置 30，60，120 分鐘。培養時間到時，吸取 培養皿內之培養液至 ependorff tube 內，以冷凍離心機於 4℃，14,000×g 的速度下離心 5 分鐘。取出細胞上清液，保存於-70℃冷凍櫃中，直至分 析實驗開始。作 PGE2之分析時，取出細胞上清液 100µl 置於 kit 內預備 好之微量滴盤之孔槽內，PGE2標準曲線與實驗同步進行。反應最後呈色 之吸光值，以光譜計（spectrophotometer）（MRX, Dynateek Laboratories）
在 405nm 下測其吸光值，參考波長（reference wavelength）為 630nm。
實驗結果數值由 PGE2標準曲線換算得知。結果以 pg/ml 表示之。
<三>、細胞生成一氧化氮之測定
一氧化氮之測定乃是使用硝酸鹽/亞硝酸鹽製劑分析系統（Cayman’s Nitrate/Nitrite assay Kit）（Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI USA.）（Nitrite 靈敏度大於 1.0 µM）當神經元或神經膠細胞受到發炎刺 激或細胞恒穩狀態受到破壞時，會產生極少量之一氧化氮，因此極難即 時偵測。而經過細胞內的反應，一氧化氮的最終產物為硝酸鹽及亞硝酸 鹽。但轉變成硝酸鹽或亞硝酸鹽之比例是無法預測的，因兩者彼此可互 相轉化。因此，測定一氧化氮總產量的方法必須是一併計算硝酸鹽及亞 硝酸鹽的總量。首先，使用硝酸還原脢（Nitrate reductase）將 Nitrate 還
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原成 Nitrite，其次，加入呈色試劑（Griess Reagent）使 Nitrite 與之形成 一深紫色沉澱（azo compound）。由呈色反應在 540nm 之吸光值可精確 測定 Nitrite 之含量。
分析實驗開始時，取 80µl 細胞上清液（實驗方法同（三）PGE2
之測定）置於 96 孔洞之微滴平盤中，接著加入 10 µl 之硝酸還原脢及 10 µl 之輔脢（co-factor），混合後於室溫下反應二小時。之後加入 Griess Reagent 後隨即呈色。在 540nm 下測吸光值。而標準曲線由已知亞硝酸鹽濃度測 其吸光值而得到，濃度結果以 micromolar（µM）表示之。
<四>、藥物或化學物
DMSO, CaCl2, EDTA, papain, deoxyribonuclease I (DNas I), Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), cysteine, poly-D-lysine, N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (Hepes), Lipopolysaccharide (LPS), D-(+)-glucose, boric acid, penicillin, streptomycin, NG-nitro-L-arginine methl ester dihydrochloride (L-NAME) 購自Sigma Chemicals Co (St. Louis, MO, USA)。horse serum 購自 Hyclone (Logan, Utah, USA) 。 Dulbecco's modified Eagle's (DME) medium, neurobasal, B27 supplement 購自GibcoBRL (Grand Island, NY, USA)。
lactate dehydrogenase (LDH) assay kit 購 自 Boehringer Mannheim
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(Germany)。potassium cyanide (KCN) 購自 Merk Chemicals (Darmstadt, Germany)。
<五>、統計分析
結果之表示以平均值加減標準誤差（mean±s.e.m.），並以細胞培養 之次數為平均。為單因子變異數分析時，統計上平均值之差異以 Student’s t-test 決定之。為多重因子變異數比較時，結果之分析以 one-way ANOVA 表示之。P 值小於 0.05 稱為有顯著統計上之差異。
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三、結果
<一>、在含糖培養液情況下，乳酸脫氫脢與細胞生成之前列腺素 E2 的變 化
圖 1 為了研究是否化學性缺氧的傷害會造成細胞膜完整性的改變並且影 響前列腺素的代謝產物(炎性反應)，我們分析了處理後細胞培養液中乳 酸脫氫脢 (LDH) 的活性及前列腺素 E2 (PGE2) 的變化，並比較含糖培養 液能否影響其作用。對細胞處理 KCN 或 magnolol 培養 60 分鐘發現，經 KCN 處理之細胞 LDH 及 PGE2 會分別較控制組增加 25% (p<0.01) 及 41
﹪(p<0.05)，而經 magnolol 併用 KCN 處理之細胞 LDH 及 PGE2 會分別較 KCN 組減少 27% (p<0.05) 及 42﹪(p<0.001)。此結果指出即使在含糖培養 液下 KCN 仍然會造成細胞缺氧性的傷害，包括 LDH 及 PGE2 的合成增 加，magnolol 能有效保護細胞減少此類物質之產生。
<二>、在不含糖培養液情況下，細胞生成之乳酸脫氫脢的變化
圖2 為了比較細胞在缺糖狀況下的反應，在不含糖培養液情況下我們分析 細胞生成之LDH，並且使用炎性反應之刺激物LPS，以了解炎性刺激是否 會加重KCN引起的細胞損傷。對細胞處理0.5 mM KCN或100ng/ml LPS或 100µM magnolol或10 µM L-NAME培養30, 60, 120分鐘發現，經藥物處理30
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分鐘時並無明顯變化。而在60, 120分鐘時，KCN處理之細胞LDH會分別較 控制組增加32% (p<0.01) 及8﹪(p<0.01)；而經LPS單獨處理之細胞LDH反 而會分別較控制組減少19% (p<0.01)及3﹪(p>0.05)；若LPS併用KCN，則 細胞LDH增加之程度與單獨使用KCN時相近；經magnolol併用氰化鉀處理 之 細 胞 LDH會 分 別 較 KCN 組 減 少 35% (p<0.01) 及 16 ﹪ (p<0.001) ；若 magnolol併用LPS及KCN，細胞LDH會分別較LPS併用KCN組減少30%
(p<0.001)及11﹪(p<0.01)。為了了解NO的產生是否包括在LPS併用KCN引 起的細胞損傷當中，實驗中在變化最明顯的60分鐘時加入NO合成抑制劑 L-NAME，結果發現L-NAME併用LPS及KCN並不會減少LPS併用KCN所產 生之LDH。
<三>、在不含糖培養液情況下，細胞生成之前列腺素 E2 的變化
圖3 對細胞處理0.5 mM KCN或100ng/ml LPS或100µM magnolol或10 µM L-NAME培養30, 60, 120分鐘發現，經藥物處理30分鐘時並無明顯變化。而 在60, 120分鐘時，KCN處理之細胞PGE2會分別較控制組增加13% (p<0.05) 及4﹪(p>0.05)；而經LPS單獨處理之細胞PGE2並無明顯變化反而會分別較 控制組減少19% (p<0.01)及3﹪(p>0.05)；若LPS併用KCN，則LPS會加重 KCN引起之PGE2的程度(21% 對 12% 及 19% 對6%，分別比較於單獨 使用KCN及LPS)；經magnolol併用氰化鉀處理之細胞PGE2會分別較KCN
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組減少26% (p<0.001)及57﹪(p<0.01)；若magnolol併用LPS及KCN，細胞 PGE2會分別較LPS併用KCN組減少40% (p<0.001)及58﹪(p<0.01)。為了了 解NO的產生是否包括在LPS併用KCN引起的細胞炎性反應當中，實驗中 在變化最明顯的60分鐘時加入NO合成抑制劑L-NAME，結果發現L-NAME 併用LPS及KCN並不會減少LPS併用KCN所產生之PGE2。由圖1、圖2及圖 3的結果比較來看，缺糖培養液(hypoglycemia)確實會加重缺氧(hypoxia)引 起的炎性反應(inflammation)，而由LDH及PGE2的平行反應來看，PGE2的 產生應該與細胞裂解(cell lysis)有關。由圖2及圖3的結果來看，控制組之 LDH及PGE2 釋放量隨時間而增加，可見在缺糖培養液的情況下，細胞也 有炎性反應。而我們也注意到，在 120分鐘的PGE2釋放量，於控制組、KCN 組及KCN併用LPS組之間並無顯著差異；此一結果指出，在120分鐘的時 後，PGE2的產生主要在影響缺糖(hypoglycemia)的效果。因此，magnolol 在 120分鐘時顯著地阻斷KCN或KCN併用LPS引起的PGE2產生，也暗示了 magnolol對缺糖引起的PGE2產生也有阻斷的效果。
<四>、在缺糖情況下，細胞生成之一氧化氮的變化
圖 4 為了研究是否一氧化氮路徑包括在 KCN 或媒介 LPS 刺激引起的發 炎反應並且與 magnolol的保護作用有否關聯，我們測量了細胞外液中 NO 的總產量(結果以終產物 nitrite 的含表示之)。對細胞處理 0.5 mM KCN 或
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100ng/ml LPS 或 100µM magnolol 或 10 µM L-NAME 培養 30, 60, 120 分鐘 發現，單獨處理 KCN 或 LPS 直至 120 分鐘都沒有刺激 NO 的產生，然而，
若合併 KCN 及 LPS 同時處理 30, 60, 120 分鐘可引起 NO 的增加分別為 99%, 70% and 87% (與 KCN 處理相比)，以及 62%, 63%, 77% (與 LPS 處 理相比)。這些結果指出 KCN 以及 LPS 之間的交互作用可能在加強 NO 的生成上扮演了某些角色。此外，KCN 媒介 LPS 刺激引起 NO 的增加可 被 magnolol 或 L-NAME 減弱。值得注意的是，雖然 L-NAME 可抑制 NO 的增加，但對 LDH 以及 PGE2的釋放卻無法影響。
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圖1
LDH release ( mU/ml)
0
PGE 2 concentration ( pg/ml)
0
Fig. 1 Effect of magnolol (mag) on KCN-induced cell cytotoxicity and arachidonate cascades as indicated by LDH and PGE2 releases, respectively, in the DMEM media which contained of glucose (normal glycemia). Bars indicate LDH and PGE2 values (mean ± S.E.M., n=8) in DMEM media at 0 time (basal); after 60 min without treatment (con); with KCN; and magnolol plus KCN. Asterisks indicate statistically significant (*P<0.05, **P<0.01,
***P<0.001 by Student's t-test following one-way ANOVA).
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Fig. 2. Effects of magnolol treatment on LDH release induced by LPS + KCN in glucose-free culture media. Bars indicate mean ± S.E.M. (n=8). *P<0.05,
**P<0.01, ***P<0.001 by Student's t-test following one-way ANOVA