一、 緒言
氰化物中毒會造成細胞外麩氨酸的積聚（Persson, 1985; Patel, 1991; Jose, 1988）。腦部星狀膠細胞含有兩個特殊的酵素-麩胺合成脢（glutamine synthetase; GS）及麩胺酸脫氫脢（glutamate dehydrogenase; GDH），專責 代謝腦部最豐富的興奮性氨基酸-麩氨酸（glutamate） （Hardia, 1997;
Shimizu, 1997; Shashidharan, 1997）。麩胺合成脢專門存在於星狀細胞內，
負責將麩胺酸代謝成麩胺，麩胺經傳送至神經元內再轉化成為麩胺酸
（ Nicholls,1990; Yudkoff, 1993 ） 。 細 胞 外 的 麩 胺 酸 經 由 轉 胺 作 用
（transamination）及麩胺酸脫氫脢（glutamate dehydrogenase; GDH）的 作用進入星狀膠細胞內的三羧酸循環（TCA cycle）（Mckenna,1996）。
葡 萄 糖 的 代 謝 是 成 熟 腦 細 胞 產 生 能 量 的 主 要 途 徑 （ Sokoloff, 1977;
Schwartz, 1979），神經膠細胞接受葡萄糖並將其轉化成為能量物質以供 神經元利用 (Tsacopoulos, 1997), 而位於神經膠細胞上的葡萄糖轉送接 受體-1 (glucose transporter-1; GLUT-1) 專門負責促進葡萄糖通過細胞膜 的速度。因此，對神經元來說，神經膠細胞上的葡萄糖轉送接受體之功 能就顯得尤其重要。本章重點是，麩胺酸的代謝過程及神經膠細胞對葡
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萄糖的利用效率，在缺氧性神經傷害方面扮演了極重要的角色。本章繼 續探討厚朴酚對細胞的保護作用是否經由對細胞代謝過程的調節以對抗 氰化鉀對細胞的代謝性傷害。
二、材料與方法
<九> 細胞培養
方法同第貳章之「二、材料與方法」中「細胞培養」之方法。將細 胞培養於 10 cm 圓形培養皿中，細胞密度為 78.5 × 105 cells/dish。於 5%
CO2，37℃之恆溫培養箱中培養至十四天後即可供實驗之用。
<十> 細胞毒性分析---乳酸脫氫脢 (LDH) 之測定
細胞毒性的分析方法同第貳章之「細胞毒性分析」。取實驗完成之 細胞上清液，分析其中乳酸脫氫脢之活性，以比較細胞受損之程度。
<十一> 酵素分析法測定細胞外乳酸 (lactate) 濃度
利用「酵素分析法」測定細胞外乳酸濃度，其實驗步驟為實驗室自 行根據麩胺酸之分析方法改變而來。對細胞分別處理 0.5 mM KCN 及 100 µM magnolol 60 分鐘，取其細胞培養液，以 14,000 rpm 之速度離心 五分鐘，取細胞上清液。以酵素分析法測定乳酸時，取 10 µl 細胞上清液
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置於 96 孔洞之微量分析平盤中，加入 180 µl 之 TEA 混合溶液註一，酵素 反應於加入 10 µl 乳酸脫氫脢 (lactate dehydrogenase; LDH) 後立即開始 反應註二。反應於 37℃，避光下呈色 10 分鐘，於 490 nm 波長下測其吸光 值，參考波長為 630 nm。試樣之結果由標準 lactate dehydrogenase 試藥 (Sigma, USA) 以蒸餾水稀釋之標準濃度標定之。
註一：TEA 混合溶液組成份為 80 mM triethanolamine; 20 mM potassium phosphate;
79.3 µM INT; 0.60 mM NAD+; 0.08 U/ml diaphorase。PH 值調至 8.6。
註二：乳酸脫氫脢濃度為 50,000 U
<十二> 酵素分析法測定細胞外麩胺酸 (glutamate) 濃度
利用「酵素分析法」測定細胞外麩胺酸濃度(Beutler & Michal, 1974;
Oiani & Fontana, 1994; Klegeris-A, 1997)。對細胞分別處理 0.5 mM KCN 及 100 µM magnolol 60 分鐘，取其細胞培養液，以 14,000 rpm 之速度離 心五分鐘，取細胞上清液。以酵素分析法測定麩胺酸時，取 10 µl 細胞上 清液置於 96 孔洞之微量分析平盤中，加入 180 µl 之 TEA 混合溶液註一， 酵素反應於加入 10 µl 麩胺酸脫氫脢 (glutamate dehydrogenase; GDH) 後 立即開始反應註二。反應於 37℃，避光下呈色 60 分鐘，於 490 nm 波長下 測其吸光值，參考波長為 630 nm。試樣之結果由標準 L-glutamate 試藥
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(Sigma, USA)以蒸餾水稀釋之標準濃度標定之。
註一：TEA 混合溶液組成份為 80 mM triethanolamine; 20 mM potassium phosphate;
79.3 M INT; 0.44 mM NAD+; 0.25 U/ml diaphorase。PH 值調至 8.6。
註二：麩胺酸脫氫脢濃度為 9 U/ml
<十三> 、酵素分析法測定細胞外葡萄糖 (glucose) 濃度
利用「酵素分析法」測定細胞外葡萄糖濃度 (Trinder-P, 1969)。對 細胞分別處理 0.5 mM KCN 及 100 µM magnolol 60 分鐘，取其細胞培養 液，以 14,000 rpm 之速度離心五分鐘，取細胞上清液。以酵素分析法測 定葡萄糖時，取 10 µl 細胞上清液置於 96 孔洞之微量分析平盤中，加入 200 µl 之 Trinder 葡萄糖混合試劑註一，酵素反應於 37℃下 10 分鐘形成 quinoeimine dye 呈色。於 505 nm 波長下測其吸光值。試樣之結果由標 準D-(+)-glucose (Sigma, USA) 試藥以蒸餾水稀釋之標準濃度標定之。
註 一 ： Trinder 葡 萄 糖 混 合 試 劑 組 成 份 為 0.5 mM 4-aminoantipyrine, 20 mM p-hydroxybenzene sulfonate, 15,000 U/L glucose oxidase (Aspergillus niger),
10,000 U/L peroxidase (Horseradish) 。PH 值調至 7.0。購自 Sigma (USA)。
<十四> 、北方墨點法 (Western Blot method)測定神經膠細胞酸性纖維蛋 白(GFAP)，微管相聯性蛋白(MAP-2)，麩胺合成脢(GS)，麩胺酸脫
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氫脢(GDH)，葡萄糖傳送接受體-1(GLUT-1)
1. 細胞前處理
實驗處理方法同前。實驗結束時，將培養皿內液體吸乾，立即將培養皿 移至冰上操作，以 0.1 M PBS buffer 浸洗兩次後吸乾液體，加入 800 µl 0.1 M PBS buffer，以細胞刮杓 (cell scrapter) 輕輕刮下培養皿表面附著之細 胞，並將細胞置入 1.5 ml 之微量離心管中，以 1500 rpm 之速度於 4℃下 離心 5 分鐘，吸掉細胞上清液，再加入 800 µl 0.1 M PBS buffer，以 200 µl 微量吸管尖(micropippet tip)反覆抽吸數次後再次離心，吸掉細胞上清 液，取其細胞沉澱部份，加入細胞分解緩衝溶液(lysis buffer)註一，以 200 µl 微量吸管尖反覆抽吸數次後，於冰上震盪 20 分鐘，將細胞均質液 (homogenate)以 12000 rpm 之速度於 4℃下離心 5 分鐘，收集細胞上清液 作為試樣溶液分析蛋白質含量及作 Western blot 分析。
註一：lysis buffer 組成份為 100 mM NaCl；20 mM Tris-HCl (pH=8.0)；1 mM EDTA；
1% NP-40；0.5% sodium deoxycholate；0.05% SDS；5 µg/ml proteinase inhibitors (aprotinin and leupeptin)
2. 蛋白質含量測定
進行 Western blot 方法前，試樣均先行進行蛋白質含量(protein assay)
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測定，以調整分析試樣時有一致含量之蛋白質。根據「Bio-Rad method」，
取 10 µl 試樣溶液置於 96 孔洞之微量分析平盤中，加入 200 µl Bio-Rad 蛋 白質染料試劑(dye reagent)，混合後靜置 30 分鐘呈色，於 595 nm 波長下 測其吸光值。蛋白質含量標準曲線由 Bovine Serum Albumin (BSA) 所配 製之標準溶液而得之。
3. Western blot 方法分離蛋白質
(1) Seperating gel (分離膠)
蛋白質之分離利用 SDS-page。GFAP (molecular weight:50 kd)，GS (molecular weight:45 kg) 及 GLUT-1(molecular weight:45 kd) 為 12.5 % SDS-page；MAP-2 (molecular weight:300 kd)及 GDH (molecular weight:350 kd)為 4 % SDS-page註一。膠上層預先以水飽和之正丁醇(n-butanol)壓平，
凝膠時間為室溫下 40 分鐘。Seperating gel 之配製方法如下表：
% of acrylamide 4 % 12.5 %
4× Lower buffer註二 5 ml 5 ml
30% polyacrylamide 2.8 ml 8.4 ml
dd H2O 12.13 ml 6.6 ml
APS 60 µl 60 µl
TEMED 10 µl 10 µl
Total 20 ml 20 ml
註一：% of polyacryamide VS. Protein molecular weight
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% of acrylamide 5% 7.5% 10% 15%
Mw 57-212 36-94 16-68 12-43
註二：4×Lower buffer：Tris-HCl 90.85g; SDS 2g in 500 ml H2O, pH 8.8
(2) Stacking gel (置留膠)
倒掉 seperating gel 上層之正丁醇，並以蒸餾水灌洗後吸乾水份，緩 慢將 stacking gel 滴在 seperating gel 之上層，並插上 spacer，留意氣泡的 產生。凝膠時間為室溫下 30 分鐘。Stacking gel 之配製方法如下表：
reagents one gel volume 4× upper buffer註一 0.26 ml 30% polyacrylamide 0.22 ml
glycerol 0.1 ml
dd H2O 1.5 ml
APS 15 µl
TEMED 2 µl
Total 2 ml
註一：4×upper buffer：Tris-HCl 30.3g; SDS 2g in 500 ml H2O, pH 6.8
(3) Loading sample (載入試樣)
加入 sample buffer註一以稀釋每一試樣至蛋白質之含量為一致，保持 於冰上操作。均勻混合 sample buffer 與試樣後，置於 94℃之熱浴槽下加 熱 5 分鐘，以打斷蛋白質結構使成為直鏈構造，加熱完畢立即移置冰上
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（4℃）置放，以防蛋白質之結構恢復。將試樣載入 stacking gel 之 space 內，完成後將整組電泳膠放入電泳槽內進行電泳分離蛋白質之過程。
註一：sample buffer：(SDS reducing buffer) in RT
reagent 4×upper
buffer
glycerol 2β-mercaptoethanol 20 % SDS 0.05 %(w/v) BPB
H2O total
volume 2.5 ml 2 ml 1 ml 3 ml 0.4 ml 1.1 ml 10 ml
(4) Run the gel (跑膠)
電泳槽內先倒入 1×running buffer 註一，連接電泳槽之電源，以 100 mV 之電壓跑膠約 2 小時，直至 sample buffer 內染料 (Bromophenol blue;
BPB) 之深藍色帶降至 seperating gel 之底部為止。
註一：4×running buffer：Tris-HCl 12 g; glycine 57.6 g; SDS 4g in 1000ml H2O, pH 8.4
(5) Transfer (轉漬)
利用半乾式 (semi-dry) 轉漬法將膠上已被分離出之蛋白質轉漬至硝 化木纖膜 nitrocellulose membrane (NC paper)。NC paper 需先浸於甲醇中 以脫脂，再用蒸餾水浸泡約 2 分鐘後轉浸於 Anode II buffer 內。轉漬時間 為 0.2 安培，1 小時。轉漬法之組合如下：
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transfer upper panel (H2O)— filter 1 (Anode I buffer 註一)--filter 2 (Anode I buffer)— filter3 (Anode II buffer 註二)— NC paper (Anode II buffer)— gel (Cathode buffer 註 三 )— Filter 4(Cathode buffer)— Filter 5(Cathode buffer)--Filter 6(Cathode buffer)
註一：Anode buffer I：0.3 M Tris-HCl; 10 % methanol, pH 10.4
註二：Anode buffer II：25 mM Tris-HCl; 10% methanol, pH 10.4
註三：Cathode buffer：25 mM Tris-HCl; 40 mM glycine, 10% methanol, pH 9.4
(6) NC paper 之 Immunoblot
轉漬後之 NC paper 將進行免疫化學步驟，以專一性抗體將欲分析 之蛋白質標識出來，其步驟及方法如下：
A. 將 NC paper 浸於 5 % 脫脂牛奶 (溶於 0.05 M TBST) 中，室溫下 30 分鐘，以阻斷一些非專一性抗原的鍵結。
B. 以 0.05 M TBST 溶液浸洗 NC paper 兩次，每次 5 分鐘。
C. 倒掉 TBST，加入一次抗體 (primary antibody) 註一 溶液，於 4℃下置 放過夜。
D. 倒掉一次抗體溶液，以 0.05 M TBST 溶液浸洗 NC paper 三次，每次
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E. 倒掉 TBST，加入二次抗體 (secondary antibody) 註二 溶液，於室溫下 置放 1 小時。
F. 倒掉二次抗體溶液，以 0.05 M TBST 溶液浸洗 NC paper 三次，每次 10 分鐘。
註一：一次抗體之來源及效價，各抗體有所不同，以 0.05 M TBST 稀釋。
GFAP mouse anti-mouse glial fibrillary acidic protein；1:2000 GS mouse anti-mouse glutamine synthetase; 1:1000
MAP-2 mouse anti-mouse microtubule associated protein; 1:2000 GDH rabbit anti-mouse glutamate dehydrogenase；1:1000 GLUT-1 rabbit anti-mouse glucose transporter-1; 1:2000
註二：二次抗體之效價為 1:20000，稀釋於 0.05 M TBST。其來源依一次抗體之寄主 (host) 而定。
(7) 冷光呈色 (ECL fluororescence development)
分析結果以冷光分析法呈現之。將 NC paper 浸於 ECL 測定試劑中 70 秒，再以 X 光片壓片曝光顯現之。壓片時間依待測試樣強度而定。
(8) 結果分析
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X 光片結果之分析，利用 ISO-1000 膠片及影像分析系統 (Alpha Innotech Corporation, USA) 照相並定量之。
<十五> 、藥物或化學物
DMSO, N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (Hepes), D-(L)-glucose, GFAP, MAP-2, boric acid, 3,3'-diamidinobenzidine tetrahydrochloride (DAB), penicillin, streptomycin, L-glutamic acid (glutamate), bovine serum albumin (BSA) 購自Sigma Chemicals Co (St.
Louis, MO, USA); 酵素分析法中使用之特殊化學物購自Sigma者有 diaphorase (EC 1.8.1.4 from Clostridium kluyveri, 5.8 U/mg solid), p-iodonitrotetrazolium violet (INT), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)。 L-glutamaic dehydrogenase (EC 1.4.1.3 from bovine liver, 30 U/mg solid) and lactate dehydrogenase (from Porcine Heart, 50,000 unit fluid) 購 自 Calbiochem (Calbiochem, California, USA) 。 Dulbecco's modified Eagle's (DME) medium, neurobasal, B27 supplement 購 自 GibcoBRL (Grand Island, NY, USA)。lactate dehydrogenase (LDH) assay kit 購 自 Boehringer Mannheim (Germany) 。 potassium cyanide (KCN), triethanolamine (TEA), potassium phosphate, 2-mercaptoethanol 購 自 Merk Chemicals (Darmstadt, Germany) 。ABC kit 購自Vector (Vector, Burlingame, CA, USA) 。 sodium dodecyl sulphate (SDS) 購 自 BDH.
Primary antibody ： GDH 購自Biogenesis (Biogenesis, England, UK) ； GLUT-1 購 自 Chemicon (Chemicon, Temecula, CA) ； GS 購 自 Transduction laboratories company (Lexington, KY)。
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<十六> 、統計分析
結果之表示以平均值加減標準誤差（mean±s.e.m.），並以細胞培養 之次數為平均。為單因子變異數分析時，統計上平均值之差異以 Student’s t-test 決定之。為多重因子變異數比較時，結果之分析以 one-way ANOVA 表示之。P 值小於 0.05 稱為有顯著統計上之差異。
91 三、結果
<十一>、 神經元標誌性蛋白質(MAP-2)的變化
圖 1 對細胞處理氰化鉀或厚朴酚培養60分鐘發現，經氰化鉀處理之細胞 MAP-2 蛋白質強度會較控制組減少24% (p<0.001)，而經厚朴酚併用氰化 鉀處理之細胞 MAP-2 蛋白質強度會較氰化鉀組增加34% (p<0.05)。此結 果指出厚朴酚能有效防止神經元受到化學性缺氧的損害。
<十二>、 神經膠細胞酸性纖維蛋白(GFAP)的變化
圖 2 對細胞處理氰化鉀或厚朴酚培養 60 分鐘發現，經氰化鉀處理之細胞 GFAP 蛋白質強度會較控制組減少 45% (p<0.01)，而經厚朴酚併用氰化鉀 處理之細胞 GFAP 蛋白質強度會較控制組減少 36% (p<0.05)。此結果指 出厚朴酚對神經元的保護性作用非經由提高受氰化鉀抑制之神經膠細胞 酸性纖維蛋白活性
<十三>、 細胞外乳酸脫氫脢(LDH)之濃度變化
圖 3 對細胞處理氰化鉀或厚朴酚培養 60 分鐘發現，經氰化鉀處理之細 胞 LDH 會較控制組增加 207% (p<0.05)，而經厚朴酚併用氰化鉀處理之 細胞 LDH 會較氰化鉀組減少 40% (p<0.01)。此結果指出厚朴酚能有效保 護細胞免於受到化學性缺氧的傷害。
圖 3 對細胞處理氰化鉀或厚朴酚培養 60 分鐘發現，經氰化鉀處理之細 胞 LDH 會較控制組增加 207% (p<0.05)，而經厚朴酚併用氰化鉀處理之 細胞 LDH 會較氰化鉀組減少 40% (p<0.01)。此結果指出厚朴酚能有效保 護細胞免於受到化學性缺氧的傷害。