二、研究方法

1. 外部形態

觀察記錄新鮮材料和臘葉標本之外部形態特徵、採集地點及生育環境，

細微構造以解剖顯微鏡觀察，並拍照或繪圖記錄之。由於乾燥的臘葉標本可 能隱蔽或失去某些特徵，因此外部形態觀察以新鮮材料為主，以臘葉標本和 浸液標本為輔。

2. 葉片橫切面解剖構造

取新鮮葉片，對葉片最寬處使用徒手切片進行橫切(cross section, c. s.)，

再將切下之材料放置於載玻片上函數滴清水後蓋上蓋玻片製為玻片標本以 光學顯微鏡檢視並拍照記錄。

3. 葉面氣孔觀察

取新鮮葉片或臘葉標本之葉片，使用指甲油對葉片表面進行拓印，待指 甲油乾燥成形後將拓印標本撕下後放置於載玻片上，函一滴清水後蓋上蓋玻 片製成玻片標本，以光學顯微鏡觀察，並拍照記錄葉片氣孔的分布和葉片表 皮細胞、氣孔之保衛細胞和副細胞等形態。

4. 照片處理

以光學顯微鏡和解剖顯微鏡觀察外部形態之部分照片以 Helicon Focus 5.1 軟體進行疊圖處理，將連續不等焦拍攝之照片疊合，使照片更為清楚。

5. 微細形態(以掃描式電子顯微鏡觀察之材料處理) (1)葉片：

a. 以 70%、85%、95%、99.5%酒精和丙酮進行序列脫水。

b. 將序列脫水後的樣本以臨界點乾燥法(critical point drying)處理。

c. 將完全乾燥的樣本放置於鋁台(stub)之上，將外表鍍金(coating)後再以

約 44 個分類群(其中 4 個為外群)，其中 34 條序列是由 NCBI 的資料庫 Viogene® Plant Genomic DNA Miniprep System Kit 萃取去氧核醣核酸 (DNA)。

c. 聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)：使用 PCR 擴增兩 個基因片段，分別為核基因的 internal transcribed spacer 1、5.8 S ribosomal gene 到 internal transcribed spacer 2 片段(簡稱 ITS 片段) 和葉綠體基因的 tRNA-Leu (trnL) gene 到 trnL-trnF intergenic spacer 片段(簡稱 trnL-F 片段)，使用的引子(primer)皆為本研究重新設計，如

d. 定序、序列排序(sequence alignment)與 indel 處理：將使用 PCR 擴增 過後的樣本交與基龍米克斯生物科技有限公司(®Genomics) 進行定序 作業。所得序列資料由 Sequencher® 4.7 軟體進行人工判讀。以 BioEdit 軟體中內建的 Clustal W 方法進行序列排序，再以手動調整和處理 indel。

e. 資料分析及親緣關係的重建：使用 MEGA 4 軟體進行資料的分析，並以

50%則認為不具支持度而不顯示於親緣關係樹上。

f. 合併序列資料：以統計方式計算資料間的一致性可用的方法雖然很多，

但很多 時候 一致 性檢 測僅能 提供 參考 ，例 如 incongruence length difference (ILD) test (Mikevich & Farris, 1981)雖然被廣泛的應用，但越 來越多證據顯示這個測詴在生物性因子的限制下並不是準確的指標 (Dolphin et al., 2000; Barker & Lutzoni, 2002; Darlu & Lecointre, 2002)。

參考 Monro (2006)的方法和結果，本研究直接檢視兩組資料所獲得的樹 形和支持度後，決定是否合併兩組資料進行分析。

表三、本研究聚合酶鏈鎖反應(PCR)所使用之引子序列。

片段 引子 引子序列

5’端至 3’端

trnL-F trnL-F (f) CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG trnL-F (r) GGG GAT AGA GGG ACT TGA AC trnF (r) CGC ATC ATC CTA ATT TTC AT

ITS

pITS-r ATG CTT AAA TTC AGC GGG TAA