第二部份實驗

3.5 第二部份實驗 3.5.1 動物分組

將 18 隻雄性 SD 大鼠隨機分成三組，每組 6 隻，如下：

(1)假手術組（sham）：將SD 大鼠兩側總頸動脈和右側中大腦動脈暴露，

但不阻斷血流。

(2)控制組（control）：阻斷兩側總頸動脈及右中大腦動脈血流 90 min，

之後再灌流24 h，不施予任何藥物治療。

(3)P-20 組：方法同(2)控制組，但在血流阻斷前 20 min 從股靜脈注射丹 皮酚（20 mg/Kg）。

再灌流24 h 之後，將大鼠犧牲取腦並分離出四個部份，依序是右大 腦皮質、左大腦皮質等兩部份，然後依下列步驟：測量腦重量（gm）並

加入等倍buffer A mix（10 x buffer A，100 mM DTT，100 x protease inhibitor mixture，100 % IGEPAL (NP-40)，DDW)，然後將檢體均質，離 心（UBOTA6900，UBOTA Co.，Japan）30 min（4 ℃），測量底層沉澱 物重量（克），並加入等倍的low salt buffer(1x Buffer H，20 % Glycerol，

1 mM DTT，1 x Protease inhibitor mixture，1 x Phosphate inhibitor mixture DDW)，並將檢體予以 Vortex，然後加入總克數乘以 0.72 的 high salt buffer

（1 x Buffer H，1 M KCl，20 %Glycerol，1 mM DTT，1 x Protease inhibitor mixture，1 x Phosphate inhibitor mixture DDW），將加入 high salt buffer 的檢體，置於4 ℃下，並 rotate 1 hr，待 1 hr 後將其置於 4 ℃下並高速 離心12000 rpm 20 min，取上清液分裝並儲存在 -80 ℃中 ^55,56。

3.5.2 檢體的收集與標定

將離心後底層的沈澱物分裝，取出 5 μl 做 OD 值檢測，分別測量 蛋白質濃度，並依不同蛋白質濃度做標定。

3.5.3 NF-κB 和 AP-1 活性的測定

本研究 NF-κB 和 AP-1 活性的測定是使用 electrophoretic mobility shift assay（EMSA）⁵⁷法，首先組 PAGE (miui-protein Ⅱ)，接著泡 gel (acrylamide，10 X TBE，DDW，10%APS，TEMED)，灌膠至全滿，插 上梳子並且靜置20~30 分，緊接著泡製檢體，操作順序都在冰上製作，

先泡製Pre-mixer（1 μlg/μl Poly dIdC，3 μl 5 x shift buffer，1.5 μl 10

x phosphatase inhibitor，1 μl NF-KB DNA（10 ng/ul））或 AP-1，分裝 6.5μl 至各管 tube，NF-κB 與 AP-1 DNA 序列分別為 biotin-AGTTGAG GGGACTTTCCCAGGC'、biotin-CGCTTGATGACTCAGCC GGAA 各管 補DDW，最後加上各管的 protein，然後 spin down，接著將 sample 置 入水浴鍋中（25.2 ℃，30 min），然後待 gel 完成後拔掉梳子，以針頭清 well，吸出多餘的膠，此外將 sample 起鍋，加上 6 x loading dye 3μl /tube，

加上sample 12μl，正式跑膠 0.25 TBE，30 V，2 h 30 min，4 ℃。待跑 膠完成，拆開灌膠的玻璃，用刀將牙齒切除並刮除，放上 3 M paper，用 20 ml 玻璃 tip 輕輕滾過以排除氣泡，緊接著利用乾的 3M paper 將 gel 扯離玻璃，並放在大玻璃中央，在gel 上放一張 nylon membrane，並用 20 ml 玻璃 tip 輕輕滾過以排除氣泡，再壓上兩張 3 M paper 並且再滾過 以移除氣泡，再覆蓋上大玻璃，並以重物壓製保存在室溫中1 h，然後 用95%酒精消毒過的平鑷將 nylon membrane 夾起，放入鋪有紙張的保鮮 盒中，並用95%酒精消毒過(去除油脂)的鉛筆做記號，將保鮮盒移入 37℃

的incubator，10 min，照 UV（120 MJ/cm²，波長254 nM），待曝光結束 後，於保鮮盒內倒入50 Ml wash buffer（100 ml 10 X maleic acid，3 ml Tween 20，DDW），120 rpm，2 min，接著泡製 1 X blocking buffer（6.5 ml/

片，13 ml 10 X maleic acid，100 ml DDW，13 ml 10 blocking solution )，

將50 ml blocking buffer 倒入保鮮盒內，室溫下 120 rpm，30 min，然後 泡製antibody solution10 ml/片(blocking buffer 10 ml，1μl streptavidin)，

加入antibody solution10ml，室溫下 120 rpm，30 min，然後倒入 50 ml wash buffer，室溫下 120 rpm，15 min 2 次，之後倒 detection buffer 10ml/片，

室溫下120 rpm，5 min，然後在避光過程中，操作螢光物質，首先泡製

（CSPD 742.5μl dectection buffer 泡 CSPD 7.5μl)，將 membrane 移至塑 膠袋中，並在membrane 正面平行滴下 CSPD，闔上塑膠袋，並以 20 ml 玻璃tip 平行滾過 membrane 以趕走氣泡，並用錫箔紙將塑膠袋裹平放置 5 min，將多餘的 CSPD 移除，並再用玻璃 tip 將氣泡趕走，用錫箔紙將 塑膠袋包裹，移至37 ℃ incubator 靜置 10 min，之後將塑膠袋四角固定 於片夾之中，並再將氣泡趕出，將membrane 帶至暗房壓片。將底片沖 洗後，以電腦做optical density 分析彼此間的差異度。

待底片清洗晾乾後，接著使用 PhotoImpact 10 掃描所壓製的圖，緊 接著用掃描軟體Gel-Pro-Analyzer 做圖片分析，並加以計算，DNA+dye 的吸光值(optical density)。