1.1 引言
根據衛生署統計，2004年腦血管疾病仍為十大死因的第三位1，推 論腦血管疾病是目前仍然威脅國人健康的重要慢性疾病。腦血管疾病俗 稱腦中風，臨床上可分為梗塞性腦中風和出血性腦中風兩大類，梗塞性 腦中風約佔 80%，而出血性腦中風則約佔 20%。造成梗塞性腦中風的 原因有動脈斑塊剝離或因動脈硬化造成血管狹窄甚至阻塞，即所謂的血 栓，或因其他器官的斑塊如心臟造成腦血管的栓塞。
當腦梗塞發生後，梗塞區核心之神經細胞會造成死亡而導致永久性 傷害，但離梗塞核心周圍之半陰影區(penumbra)2,3，因具有豐富的側枝 循環若治療得當是一個可以恢復（reversible）的區域，許多研究腦中風 的重點如藥物的臨床試驗等都針對此區域如何來減少神經損傷。若未對 penumbra 區域做適當的治療則神經細胞會漸漸死亡而出現如同梗塞核 心區一般的病理變化。
1.2 中風的治療
臨床上將腦中風分為出血性或梗塞性腦中風，一般而言出血性腦中 風以降低腦壓或手術治療為主，而對於梗塞性腦中風的治療，美國國家 衛生研究院（National Institute of Neurological Disorders and Stroke，
NINDS)建議在腦梗塞發生後三小時內，用 alteplase （0.9 mg/kg up to 90
mg）靜脈注射治療，據統計有 35%的腦中風患者獲得緩解，若腦梗塞發 病超過三個小時，則以保守療法為主，藥物治療著重於中風再發的預防 和後遺症的復健，因此本研究的目的於腦梗塞發生前後不同時間點給予 丹皮酚觀察對於腦梗塞的效用，尋找治療腦中風最佳的時間窗口。
1.3 腦梗塞的神經損傷
梗塞性腦中風為腦血管壁的硬化、狹窄甚至阻塞不通導致所支配區 域產生低灌流或無灌流現象。由於腦組織灌流不足，氧氣的供應逐漸減 少，細胞開始利用無氧呼吸來維持運作，但隨著氧氣耗盡，血糖亦隨著 逐漸耗竭，ATP 的製造來源不足，影響到需能量的傳輸蛋白 Na+-K+ ATPase 無法充分運作，導致胞內的鈉離子上升，胞外鉀離子無法交換進 入胞內，胞內的鈣離子無法進入細胞外，而使水分往胞內移動，造成細 胞腫脹，細胞被脹破瓦解。此外，由於胞內鈣離子上升，細胞被去極化。
並且在缺血期突觸前神經大量釋放出glutamate，並減少回收 glutamate 而大量結合在突觸後細胞，亦造成鉀離子外流鈉鈣離子內流，又稱為 excitotoxicity，同樣造成造成水腫及神經衝動的發生4。神經衝動活化了 體內酵素增加，如phospholipase C 及 phospholipase A2，及 cycloo xygenase-2 的上升，而 phospholipase C 及 phospholipase A2 更近一步產 生MAP kinase（mitogen activated protein kinase）， 其會造成 lipid peroxidation，而 cyclooxygenase-2 會誘發氧自由基的產生，對細胞產生 攻擊，使細胞死亡，而釋放出的氧自由基、鈣離子、及iNOS，會進一
步促進發炎反應。星狀細胞（astroglia）、小神經膠質細胞（microglia）、
內皮細胞(endothelial cell)、淋巴細胞等，會釋放出細胞激素（cytokines）
及趨化酵素（chemokines），造成發炎細胞的聚集，並且吞噬受傷的組織
5,6。Microglia 平時存於神經組織中，大多處在休息狀態（resting），構成 了5%~20%的 glial cell，是最早針對神經損傷做出緊急反應的免疫細 胞，有研究發現microglia 與巨噬細胞（macrophage），是分泌發炎介質 tumor necrosis factor-α（TNF-α）、interleukin-1ß（IL-1β）、tumor growth factor(TGF-β)的重要來源。此外，白血球（leukocyte），是比較晚期聚集 的免疫細胞，經由細胞激素所誘發，並且在梗塞後灌流期，會造成細胞 發炎且水腫，所以在灌流時期，會造成神經細胞的二次傷害。
1.4 梗塞後的發炎反應
腦梗塞後引發了後續的發炎反應，如白血球、巨噬細胞的浸潤等，
其中白血球的浸潤關係到許多血管內皮分泌因子，例如p-selectin,、
intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）、vascular adhension molecule-1
（VAM-1）。並且在發炎反應的過程中，microglia 不僅會分泌細胞激素 變成巨噬細胞，將死掉的細胞與碎片吞噬7，並且會刺激Nuclear factor -κB (NF-κB)的活化。NF-κB 是ㄧ種 DNA binding protein，主要做為 transcription factors 用來調節許多基因的表現，如發炎、細胞凋亡等 8, 9。 NF-κB 主要由 p65（RelA），RelB，c-Pel，p50 及 p52 所組成，活化方
式藉由磷酸化其抑制蛋白IκB（IκBα、IκBβ、IκBε)。當細胞遭受 如TNF-α、IL-1、lipopolysaccharide 刺激後，會促使 IκB 產生磷酸化，
並使NF-κB 進入細胞核中，經由轉錄轉譯，產生大量的細胞激素。此 外，細胞受傷後會活化許多因子如NF-κB、hypoxia inducible factor 1
（Hif-1）10、Prostaglandin E2（PG- E2）、interferon regulatory factor-1
（IRF-1）。NF-κB 經由磷酸化 p56 使 NF-κB 進入細胞核，結合於 DNA 上，轉譯出更多細胞激素，如TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6 等，而 Hif-110 則會促進vascular endothelial cell derived growth factor （VEGF），造成 blood brain barrier（BBB）的 leakage，甚至是水腫。IRF-1 則會產生 γ-interferon，刺激 macrophage 的吞噬，受到趨化因子的影響在梗塞後 48-72 小時達到最大量的浸潤。TNF-α是多形性的細胞激素（pleiotrophic cytokine），在腦組織損傷與修復過程中，扮演發炎反應與免疫反應的多 重功能，其可以藉由分泌 ICAM-1 誘發白血球附著於血管壁上，亦可促 使巨噬細胞的活化與分泌，在梗塞發生後的1.5 h 會逐漸上升，並且在 6-24 h 後逐漸下降11。IL-1β主要是由 microglia、astrocyte、寡樹突細胞
（oligodendrocyte）分泌 12。IL-1β是一種發炎的前驅物質（proinflmmatory substance），作用於血管內皮，促使血管內皮分泌 E-selectin、VAM-1、
ICAM-1 等因子13，以上物質會吸引白血球附著於血管壁上，然後穿透 進入梗塞區域，吞噬死掉的細胞和造成發炎、水腫的現象6,13,14。
1.5 NF-κB 與腦缺血的關係
NF-κB 是一種 DNA 結合蛋白，凡發炎、免疫反應、細胞凋亡、細 胞的存活和分化等都與NF-κB 有關。NF-κB 的組成蛋白有 p65（Rel A）、RelB、c-Rel、p50 及 p52 等五種，彼此間可以結合成異構物，NF-κB 平時為不活化狀態，但當組織遭受刺激，其抑制蛋白IκB（IκBα、IκB β、IκBε）被磷酸化後，會促使 NF-κB 成為活化狀態進入細胞核中 與DNA 結合，產生調控接著轉錄轉譯出一些激素與酵素如 proinflamm atory cytokines，chemokines，cell adhesion molecules 等物質，進一步產 生灌流後之發炎反應15.。在腦缺血─再灌流損傷中，能夠活化 NF-κB 的物質很多，如 TNF-α、IL-1β16、hydrogen peroxide、reactive oxygen species 17、increased intracellular calcium18 及 glutamate19等。有研究顯示 在腦缺血後NF-κB 會被活化並且上升 13, 20, 21，經由抑制NF-κB 的活化 可以減少再灌流後的損傷22。有研究認為aspirin 治療中風是因 aspirin 能減少NF-κB 的活化而產生抗炎作用 23。但另有研究發現NF-κB 的 產生可以減緩神經細胞的退化24，也有抗細胞凋亡25，以及保護神經細 胞的損傷等的作用26,27。事實上NF-κB 究竟扮演促進或抑制胞凋亡，
需是其刺激方式和NF-κB 作用時間的長短而定。，
1.6 AP-1 對於腦缺血的角色
Activator protein-1（AP-1）是一種 Fos（c-Fos，FosB，Fra-1，and Fra-2）
與Jun（c-Jun，JunB，JunD）的聚合物，又稱為 Immediate early genes
（IEGs），是一種轉錄調節蛋白，其會接合在某一段的 DNA motif 上而 誘發下游的一連串基因表現，在缺血後幾個小時內AP-1 上升29。在 middle cerebral artery occlusion（MCA）的動物實驗發現 AP-1 出現在大 腦皮質（cerebral cortex）、海馬（hippocampus）、視丘（thalamus）等區 域。AP-1 主要的產生原因是來自於廣泛的梗塞後去極化 30,31。有研究顯 示AP-1 對梗塞後的腦組織有保護作用 31，亦即對其Fos 的產生拮抗反 應導致組織傷害更明顯，但有研究發現癲癇發作、腦缺血發生後，會誘 發Fos，c-Jun，JunB 等基因的快速上升32,33。AP-1 活化主要是在於 c-Jun 之N-terminal 端的磷酸化，一但被磷酸化後，AP-1 的活性會上升並引發 一連串細胞分化作用34。缺血性腦梗塞發生後，導致大量c-Jun 基因片 段表現，這些表現集中在非梗塞區亦即在周邊反應(region surrounding the ischemic cortex)而非梗塞區 35。
1.7 研究目的
我們實驗室先前的研究結果已知丹皮酚前治療可以減少腦梗塞面 積和神經缺損等級，因此本研究的目的是進一步探討丹皮酚對腦梗塞效 用與給藥時間點的關係，同時也觀察丹皮酚效用與Nuclear factor-κB 和 AP-1 的關係。