酵素鏈結免疫吸附法 (Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)為現今最 廣泛使用於例行測定及篩選食品過敏原的分析技術。大體上 ELISA 可依偵測原 理為三明治或競爭法分為兩種形式。三明治式 ELISA (sandwich ELISA; s-ELISA) 利用對目標蛋白(過敏原或食品標記)專一的固定式抗體來捕捉目標分析物，目標
分析物則再被另一抗原專一並帶有酵素標記的抗體辨認，形成「三明治」。於偵
測步驟時此標記於抗體之酵素與特定基質反應產生有顏色之產物，有顏色之產物 之吸光值與分析物之濃度成直接的比例關係。而在三明治法因抗原必須要有一個 以上之抗原決定位，此方法只能應用於大分子像是蛋白質。因此 s-ELISA 為最常 見的食品過敏原免疫偵測法[58]。
儘管 ELISA 具高靈敏性且專一性並能夠產出定量結果[56]，但是 ELISA 法 具下述缺點。
(1) 可偵測之過敏原目標受限制
雖然八大過敏原中大多數皆有可利用的 ELISA 套組，但多數的套組只針對 來自單一食品中的單一過敏原，舉例來說，牛奶過敏原之商業 ELISA 套組之偵 測目標僅包含酪蛋白 (casein)、β-乳球蛋白 (β-lactoglobulin)及總過敏原含量 (酪
蛋白及β-乳球蛋白)，而其他牛奶中已知的過敏原像是同為主要過敏原的 α-乳球
蛋白 (α-lactoglobulin) 則無被列為目標。
(2) 對抗體暸解程度不足
抗體為主之方法需有單株亦或多株抗體，多數抗體為商業可及，但多數抗體 之特性尚未被清楚了解。使用抗體為主之方法時可能會產生交叉反應，造成潛在 偽陽性結果。複雜之基質可能會包含影響物質像是多酚類或單寧，可能會與蛋白 質或抗體反應或結合。此外食品加工或樣品準備過程可能會修飾過敏原，造成無 法被目標抗體辨認產生潛在偽陰性結果。食品之熱加工過程可能會破壞或創造結 構性抗原決定位，造成抗體辨認上之錯誤[59]。
(3) 不同套組結果差異大
文獻[60-62]比較不同 ELISA 套組間之分析結果，其準確度、精密度甚至適 用範圍皆有明顯缺陷。因缺乏通用之標準品或參考物質，故不同 ELISA 套組間 相比較非常困難。
(4) 不具指紋不能夠鑑定
ELISA 套組針對特定過敏原目標進行偵測或定量，然而受限於其抗體與過 敏原抗原決定位的專一性，其對非目標之蛋白不具分辨性，故 ELISA 法不能用 做鑑定過敏原之方法。
這些不足之處明顯表明了於食品過敏原分析定量方法上需要其他方法之迫 切需求[57]。
以核酸為基礎之食品過敏原分析方法
聚合酶連鎖反應 (PCR)用於擴增一小段已知的 DNA 片段，可能是單個基因，
或僅是某個基因的一部分。一般的聚合酶連鎖反應由 20 到 35 個循環組成，每個 循環包括以下 3 個步驟：
(1) 變性
利用高溫（93-98℃）使雙鏈 DNA 分離。高溫將連接兩條 DNA 鏈的氫鍵打斷。
在第一個循環之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物完全分離，僅以單鏈 形式存在。該步驟時間 1-2 分鐘，接下來機器就控制溫度進入循環階段。
(2) 接合
在 DNA 雙鏈分離後，降低溫度使得引物可以結合於單鏈 DNA 上。此階段的溫 度通常低於引子熔點 5℃。
(3) 延伸
DNA 聚合酶由降溫時結合上的引子開始沿著 DNA 鏈合成互補鏈。此階段的溫 度依賴於 DNA 聚合酶。該步驟時間依賴於聚合酶以及需要合成的 DNA 片斷長 度。
即 時 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (quantitative real time polymerase chain reaction;
qPCR/qrt-PCR) 是一種在 DNA 擴增反應中，以螢光染劑偵測每次聚合酶鏈鎖反 應（PCR）循環後產物總量的方法，其偵測範圍廣、靈敏度高、準確、專一及快 速。
qPCR 與 ELISA 法相比因多數情況下 DNA 比起蛋白質較不易受到熱變性影 響，因此偽陰性結果可被避免。然而與蛋白質相同，食品原料可能會與 DNA 反 應並影響 PCR 反應的進行。然而此方法並無法提供蛋白質含量的直接資訊，因 其仍缺乏校正參數來將 DNA 的重量、濃度或套數 (copy number)轉換為蛋白質
[59]。
以質譜為基礎之食品過敏原分析方法
以質譜系統為基礎之食品過敏原分析方法於近年快速且蓬勃發展。質譜儀 (mass spectrometry, MS)主要由三個部分組成：離子源、質量分析器以及偵測器。
最 為 常 見 之 兩 種 離 子 源 為 基 質 輔 助 雷 射 脫 附 電 離 (Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)及電灑游離 (electrospray ionization, ESI)。質量分析 器於蛋白質體學最常見的為飛行時間(time of flight, TOF)及離子阱 (ion trap, IT)，
於定量上則以三重四極柱(triple quadruples, TQ/QQQ)最為廣泛利用。通常會再搭 配 樣 品 分 離 方 法 像 是 高 / 極 效 液 相 層 析 (High/Ultra performance liquid chromatography, HPLC/UPLC) 或是氣相層析 (gas chromatography, GC)，於分析 食品過敏原通常使用極效液相層析。組合不同之層析法、離子源與質量分析器可 得混和式的質譜儀系統，像是 UPLC-ESI-qTOF、MALDI-TOF、UPLC-ESI-IT、
UPLC-ESI-TQ 等系統[59]。
蛋白質體學於質譜儀分析蛋白質時，需一系列的方法步驟包含以蛋白酶消化 蛋白質來產生胜肽並將其引導至質譜儀中進行分析。接著利用生物資訊工具及蛋 白質資料庫來分析質譜圖。藉由荷質比確認胜肽序列，而過敏原蛋白可利用其衍 生之胜肽序列與已知的蛋白相比對而確認。蛋白質定量分析時之步驟將於後面章 節詳細說明。
質譜儀系統具有許多優點，像是簡單的樣品準備方法、快速的分析時間及能 夠同時分析多個過敏原。質譜儀與其他同樣擁有低偵測極限 (limit of detection, LOD)與定量極限 (limit of quantification, LOQ)的方法相比較為強大且穩定，並能 夠簡單的自動化及標準化。另一優點是擁有更明確的標準，使得比較方法間與實 驗室間的結果更為容易。食品熱加工所產生之後轉譯修飾、蛋白質立體結構破壞
可能會影響 ELISA 法的靈敏性與專一性，而質譜法則受影響程度較小，因其偵 測較穩定之蛋白質一級結構。質譜法更能夠提供過敏原的胺基酸序列，並辨認後 轉譯修飾以及蛋白質亞型 (protein isoform)。總結來說，質譜儀系統於近幾年被 應用於開發食品過敏原之分析方法，其能夠解決現在已開發之方法的主要缺點，
如非特異性抗體-抗原反應與未知修飾的問題[59]。