代表胜肽，標記後對 QqQ MS 進行子離子選擇與參數設定。利用標記合成胜肽 進行定量與定性子離子之選擇；而設定之參數包含進樣錐電壓 (con voltage, CV)、碰撞室電壓 (collision energy, CE)、定量與定性子離子之躍遷 (transition) 設定。最後再建立 LC 方法梯度圖，以獲得快速、高分離效率、低殘留之 LC 方 法。再利用氫標記合成胜肽作為外標準品，利用氘標記合成胜肽作為內標準品，
進行標準曲線之繪製，定義出方法之線性範圍。
2. 方法確效依 ICH 之文件執行，以三個目標物各五個不同濃度三重複對重複 性、準確性與定量範圍進行方法確效。
第三部分：不同加工處理對奇異果過敏原之影響
1. 以常見之七種加工法 (果醬、熱風乾燥果乾、冷凍乾燥果乾、熱殺菌果泥、
高靜水壓處理果泥、熱殺菌果汁、高靜水壓處理果汁) 自行製備奇異果產品，
並以本研究開發之分析法對其過敏原進行含量消長之研究，探討不同加工處理 對於過敏原含量之影響。
貳、 材料與方法
藥品
液相層析使用之移動相皆為 LC-MS 級
1. 硫酸銨 (ammonium sulfate) 購自台灣肥料股份有限公司，新竹市，台灣 2. APS、Dye reagent、TEMED、Polyacrylamide 購自 Bio-Rad Laboratories, Inc.,
USA
3. Acetonitrile、Coomassie Brilliant Blue、Methanol、Tris-base 購自 Mallinckredt Baker, Kentucky, USA
4. Pierce Trypsin Protease, MS grade 購自 Thermo Fisher Scientific Inc., USA 5. Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN), 95% purity 購自 Alfa Aesar, Haverhill,
Massachusetts, USA
6. Urea 購自 VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA 7. 其他藥品購自 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
器材
1. 低溫離心機 AllegraTM XR Centrifuge 購自 Beckman Coulter, Inc., CA, USA 2. Vortex-Genie 2 購自 Scientific Industries, Inc., USA
3. PB-10 pH meter 購自 Satorious, Goettingen, Germany
4. 恆溫水浴機 Water beths 購自 TKS, Genmedika Biotechnology Corp., Taiwan 5. Mini-protein 蛋白電泳系統購自 Bio-Rad Laboratories, Inc., USA
6. 果汁機 Water blender 購自 Royal Dutch Philips Electronics Ltd., Amsterdam, Holland
7. Waters Synapt G2 HDMS (Waters Q-ToF system, hybrid quadrupole- time of flight mass spectrometry)，由臺灣大學化學系蛋白質體質譜核心實驗室提供 8. ELISA reader EnSpire 2300 Multilabel Reader 購自 Perkin Elmer Inc., USA
9. Waters ACQUITY UPLC-Quattro Premier XE MS (MLtraperformance Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Mass Spectrometer)，由臺灣大學公衛學院 環境暨職業衛生研究中心提供
實驗方法
奇異果產品製作法 (1) 果醬
挑選 4 顆成熟奇異果，將其洗淨、去皮、切丁後以果汁機破碎成果泥。加入等重 之水，加熱至重量減少三分之一。以檸檬酸 (citric acid) 調整酸度至 pH 落於 2~3 間，加入蔗糖使最終總固形物含量為 65°Brix，加入 1.5%之高甲氧基果膠，煮至 沸騰後即關火裝罐。
(2) 果乾
挑選 5 顆成熟奇異果，將其洗淨、去皮後，切成 1 cm3之方塊。將奇異果方塊分 成 200 g 兩組，分別以熱風乾燥 (60℃，850 mins) 處理與冷凍乾燥處理，乾燥 後置於乾燥處保存。
(3) 果泥、果汁、鮮果
挑選 8 顆成熟奇異果，將奇異果洗淨、去皮、切丁後以果汁機破碎成果泥，取出 適量果泥作為鮮果組接續進行後續蛋白質萃取。高靜水壓處理 (HPP) 果泥：取 150 g 果泥裝入真空袋中真空密封，進行高靜水壓處理 (500 MPa，持壓 3 分鐘)，
將完成 HPP 處理之果泥袋放入-20℃冰箱保存至進行後續蛋白質萃取；熱殺菌處 理果泥：取 150 g 果泥裝入血清瓶中以水浴機進行熱殺菌處理 (65℃，30 分鐘)，
將完成熱殺菌處理之果泥放入-20℃冰箱保存至進行後續蛋白質萃取；果汁：將 果泥以絹網過濾出果汁，其 HPP 處理與熱殺菌處理步驟與果泥之方法條件相同。
奇異果蛋白質萃取法
(1) 苯酚蛋白質萃取法 (phenol protein extraction)
苯酚蛋白質萃取法參考文獻[238]並稍作調整。奇異果果肉切丁以果汁機打成果
泥後，取 1.5 g 果泥至 15 mL 離心管。於離心管加入 10 mL 萃取液 (0.9M Sucrose, 100 mM Tris–base, pH 8.0, 10 mM EDTA, 0.4% (v/v) β-mercaptoethanol 50% (v/v) phenol)，於均質震盪 20s 後，於 4℃下以混合機混和 30 mins。離心 (3,900 g, 15 mins, 4℃) 後取苯酚層至新的 50 mL 離心管。於離心管中加入 5 倍體積 (30 mL) 0.1 M ammonium acetate/100% methanol，震盪後在 -20℃下過夜 (至少 16 hrs)。
離心 (3,900 g, 10 mins, 4℃) 後去除上清。分別加入 20 mL 之-20℃, 0.1 M ammonium acetate/ 100% methanol、80% acetone 及 70% ethanol 各洗一次。以 70%
ethanol 轉移沉澱物至 1.5 mL 微量離心管中，將微量離心管冷卻至 -20℃後離心 (21,100 g, 15 mins, -9℃)，去除上清。重複至沉澱全部轉移。以真空乾燥機將沉澱 表面抽乾。加入 1 mL 回溶溶液 (9M Urea pH8.0)。
(2) 優化之苯酚蛋白質萃取法 (optimized phenol protein extraction, OPE) 奇異果果肉切丁以果汁機打成果泥後，加入液態氮研磨三次，取 1.5 g 研磨後之 果泥至 15 mL 離心管，於離心管加入 10 mL 萃取液 (0.9M Sucrose, 120 mM Tris–
base, pH 8.0, 12 mM EDTA, 0.48% (v/v) β-mercaptoethanol, 50% (v/v) phenol)，於 室溫下震盪 20 mins。離心 (3,900 g, 15 mins, 25℃) 後取 phenol 層至新的 50 mL 離心管。重複萃取步驟兩次，於步驟間加入 0.2 g Sucrose 以穩定分層，共得到每 樣品共三管萃取物。於離心管中加入 5 倍體積 (30 mL) 0.1 M ammonium acetate/100% methanol，震盪後在 -20℃下過夜(至少 16 hrs)。取第一次萃取物離 心 (3,900 g, 10 mins, 4℃) 後去除上清，於同管加入第二次萃取物離心後去除上 清，於同管加入第三次萃取物後離心去除上清，將三次萃取物合併為同一管。分 別加入 20 mL 之-20℃, 0.1 M ammonium acetate/ 100% methanol 、80% acetone 及 70% ethanol 各洗一次。加入 0.1 M ammonium acetate/ 100% methanol 時可先潤洗 第二、三次萃取物之離心管後倒入第一管中以減少損耗。以 70% ethanol 轉移沉 澱物至 1.5 mL 微量離心管中，將微量離心管冷卻至 -20℃後離心 (21,100 g, 15 mins, -9℃)，去除上清。重複至沉澱全部轉移。以真空乾燥機將沉澱表面抽乾，
加入 0.5 mL 回溶溶液 (9M Urea pH8.0)，待其回溶後以 1 mL 定量瓶加入回溶溶 液定量至 1 mL 後取回原微量離心管。
(3) 微量苯酚蛋白質萃取法 (micro phenol protein extraction, MPE)
若樣品為鮮果：取兩顆奇異果去皮、果肉切丁以果汁機打成果泥；果醬：取 100 g 之果醬以果汁機均質化；果乾：取 25g 果乾加入 75 g Milli-Q water 以果汁機 均質化；果泥：取 100 g 之果泥以果汁機均質化；果汁：取 100 g 之果汁。將前 步驟之樣品 (除了果汁之外) 加入液態氮研磨三次，取約 0.07 g 樣品至 1.5 mL 微量離心管。於離心管加入 70 μL 緩衝液 (1.8M Sucrose, 240mM Tris-base, pH 8.0, 24mM EDTA, 0.96% (v/v) β-mercaptoethanol) 及加入 100 μL 飽和蔗糖苯酚溶 液，vortex 使其混和均勻。並於 40℃下超音波震盪 20 mins，結束後 vortex 使其 混和均勻。離心 (3,900 g, 15 mins, 25℃) 後取 phenol 層至新的 1.5 mL 離心管。
重複萃取步驟兩次，唯於加入飽和蔗糖苯酚溶液體積為70 μL，將三次萃取物合
併 於 同 一 管 。 於 離 心 管 中 加 入 約 5 倍 體 積 (1100 μL) 0.1 M ammonium acetate/100% methanol，震盪後在-20℃下靜置 4 小時。將萃取物離心 (21,100g, 10 mins, -9 ℃) 後去除上清。分別加入 800 μL 之-20℃,0.1 M ammonium acetate/ 100%
methanol、80% acetone 及 70% ethanol 各洗沉澱表面一次，加入時手持輕微搖晃，
離心 (21,100g, 15 mins, 4℃) 後去除上清後換下一溶劑。以真空乾燥機真空乾燥 30 分鐘將沉澱表面殘留溶劑抽乾。
(4) 三氯乙酸蛋白質沉澱法 (trichloroacetic acid protein precipitation, TCA) 以果汁機將切丁之奇異果可食部位均質化，全程需保持在低溫 (4℃) 下。取足夠 量之果泥至研砵中加入液態氮研磨。取 4 g 之果泥置於 50 mL 離心管中並加入 25 mL TCA 萃取緩衝液。於-20℃冰箱靜置 1 小時以上。蛋白應呈現白色雪花狀沈 澱。以 5,000g 4℃之條件離心 30 分鐘，去除上清液。加入 10 ml 冰丙酮以清洗 蛋白沈澱團塊，5,000g 4℃ 10 分鐘離心去除上清，重複此步驟兩次。以真空乾燥 法去除殘留丙酮。將蛋白回溶於 15 mL 之 tank buffer 中，5,000g 4℃ 10 分鐘離
心後將上清轉移至新的離心管中保存。
(5) 硫酸銨蛋白質沉澱法 (ammonium sulfate protein precipitation, AmSulf) 將 250 g 奇異果可食部位與 250 mL 萃取緩衝液 (100mM Tris-HCl, 2 mM NaCl and 10 mM EDTA) 以果汁機均質化。以絹網過濾之濾液離心後 (4,500 rpm, 15 mins, 25℃) 取上清。加入硫酸銨 （ammonium sulfate）至飽和。硫酸銨加入量以 網 路 上 之 軟 體 ammonium sulfate calculator (http://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm) 計算，於 4℃靜置過夜。離心 (9299 g, 15 mins, 4℃) 收集沈澱物於 50 mL 離心管中。將沈澱之蛋白團塊與適量 透析液 (200mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, 2 mM NaCl, 0.8% (v/v) β-mercaptoethanol) 均質後加入透析袋 (3 kDa) 中透析，透析液更換約 5-6 次每次間隔至少 4 小時 以上。將蛋白液分裝為 1 mL 量儲存於-80℃保存。
(6) 蛋白質鹽萃取法 (salt protein extraction method)
方 法 參 考 [249] 將 0.7g 冷 凍 之 奇 異 果 可 食 部 位 果 肉 與 0.07 mg polyvinylpolypyrolidone 一同以液態氮於研砵中研磨。加入 1 mL 之萃取液 (0.5M NaCl, 10 mM DTT, 以 NaOH 調整至 pH 8.3) 置冰靜置 1 小時並離心 (16 000g, 4
°C, 10 min)取上清，於-20℃保存。
蛋白質定量法
(1) Bradford 蛋白質定量法
將 Bio-Rad Protein assay dye concentrate 以水稀釋 5 倍。配製標準品使濃度落於 0.05 - 0.5 mg/mL 範圍。將樣品稀釋至 0.05 - 0.5 mg/mL 範圍。將 10 μL 樣品及 標準品載入 96 孔盤中，加入 200 μL 稀釋過之 Bio-Rad Protein assay dye concentrate，
靜置 5 分鐘，測定波長 595 nm 吸光值。
蛋白質定性法 (1) SDS-PAGE
變性膠體製備：鑄膠玻片以 75% 酒精清潔並擦拭乾淨，置於固定架上夾緊，確
保不會漏液。配製 12% running gel 後注入玻片間，輕敲去除氣泡，於上方加入 methanol 將溶液壓平。待凝膠完成，倒除 methanol，將 4% stacking gel 注入玻 片間，插入齒梳，靜置等待凝膠。凝膠完成，將齒梳拔除，即可進行膠體電泳分 析。膠體電泳、染色與退染：將鑄好之膠片置於電泳槽中，倒入 tank buffer，注 入樣品，蓋上電泳槽上蓋，連接電源供應器，以固定電壓 60 V 進行電泳。待樣 品之 sample dye 通過 stacking gel 跑至 running gel 上緣，則可更改電壓為 130 V 繼續進行電泳。電泳完成後，將膠體自玻片取下，於染色盒中以 CBR stain solution 進行染色。當染色完成後倒除染劑，再以 Milli-Q water 或 destain solution 退染直至背景呈透明，即可用照膠系統保存影像。
蛋白質消化法
(1) 尿素基質前處理方法
a 優化尿素基質溶液內胰蛋白酶蛋白質消化法 (optimized urea based in-solution trypsin digestion method, Urea digestion)
於苯酚法萃取之蛋白樣品中加入 0.5 mL 回溶溶液 (9M Urea 1M TEAB pH8.0)，
待其回溶後以 1 mL 定量瓶加入回溶溶液定量至 1 mL 後取回原微量離心管。將 蛋白質溶液以 9M Urea 1M TEAB 緩衝液稀釋使蛋白質濃度落於 1.5 - 2.4 μg/μL 之間。取10 μL 之蛋白質溶液於微量離心管中。於管中加入 0.6 μL 之 100 mM DTT 至管中濃度達約 5 mM，置於室溫下 30 分鐘以還原雙硫鍵。加入 0.9 μL 500 mM iodoacetamide 溶液至最終濃度達到 35 mM 混合均勻後置於室溫暗處 30 分 鐘以烷基化半胱胺酸。加入4 μL 之 100 mM DTT 至最終濃度達 25 mM 並置於 室溫下 10 分鐘以終止烷基化反應。將溶液加入 182 μL Milli-Q water 將 urea 濃 度稀釋至 1 M 以下來避免胰蛋白酶變性失活。加入 2.5 μL 胰蛋白酶溶液，蛋白 與蛋白酶比例應落於 20~200 之間。置於 37˚C 下以 300 rpm 震盪混合進行消化 16 小時。
b 尿素基質二甲基標記法
消化後接續二甲基標記步驟，加入8 μL 之 4% (v/v)甲醛 (CH2O)，再加入 8 μL 之 0.6 M 氰硼氫化鈉 (NaBH3CN)，置於 20 ˚C 下以 300 rpm 震盪混合 1 小時。加入 32 μL 之 1% (v/v) 氨水終止標記反應，加入 16 μL 之甲酸中和氨水並酸化樣品 以進行後續質譜分析。取8 μL 之樣品溶液至新的微量離心管中，加入 4 μL 之三 種濃度為25 μg/mL 之內標準品 (AD1D、AD5D、AD11D)，最終得 20 μL 樣品體 積。
c 尿素基質樣品除鹽法
分別利用 100% 乙腈與 0.1%甲酸水溶液平衡 zip tip，吸取 10 μL 之前述溶液並 排至廢液三次。以 zip tip 吸排樣品溶液 30 次以裝載樣品至管柱上。以 0.1%甲酸 水溶液洗出 zip tip 中鹽類，吸取並排至廢液六次。於預先分裝至微量離心管之 20 µl 60%乙腈 0.1%甲酸水溶液中吸排 20 次，以流洗出胜肽。加入 180 µl Milli-Q water，儲藏於 -20 ˚C 待後續分析。
分別利用 100% 乙腈與 0.1%甲酸水溶液平衡 zip tip，吸取 10 μL 之前述溶液並 排至廢液三次。以 zip tip 吸排樣品溶液 30 次以裝載樣品至管柱上。以 0.1%甲酸 水溶液洗出 zip tip 中鹽類，吸取並排至廢液六次。於預先分裝至微量離心管之 20 µl 60%乙腈 0.1%甲酸水溶液中吸排 20 次，以流洗出胜肽。加入 180 µl Milli-Q water，儲藏於 -20 ˚C 待後續分析。