國際醫藥法規協和會 (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, ICH)在 Q2(R1)文件討論四種最 常見的分析方法之確效，分別為鑑別試驗 (identification tests)、不純物定量試驗 (quantitative tests for impurities' content)、不純物限量試驗 (limit tests for the control of impurities)、藥品中主成分之定量試驗 (quantitative tests of the active moiety in samples of drug substance or drug product or other selected component(s) in the drug product)。
(1) 鑑別試驗 (identification tests)：
鑑別試驗目的為確認樣品中分析物之身份。通常藉由比較樣品與標準品之性 質 (質譜圖、層析特性、化學反應等)來達成。
(2) 不純物定量與限量試驗 (quantitative tests and limit tests for impurities
content)：
對樣品中不純物之測試可能為定量試驗或限量試驗。任一種試驗皆欲精準表 現樣品純度性質。兩種試驗間所需之確效特性相異。
(3) 藥品中主成分之定量試驗：
方法步驟之目的為量測樣品中分析物的存在，於此文件，方法代表藥物基質 中之主成分的定量量測。在藥物產品中，相似的確效特性同時也適用於其活性成 分或其他選擇之成分。相同的確效特性也適用於相關分析步驟之方法，如溶解步 驟。
分析方法之確效方法
根據我國衛生福利部食品藥物管理屬之規定，實驗室使用修飾之衛生福利部 公告方法、衛生福利部公布之建議方法或其他國際認可方法，以執行食品衛生相 關檢驗，為證實檢驗方法之適用性及分析結果之正確性，該檢驗方法需經確效 (validation)後使用。執行方法如下
(1) 適用範圍
檢驗方法適用不同類別檢體，應就各類檢體選出至少一種代表性基質進行檢 驗方法確效。ICH Q2(R1)文件建議方法範圍應考量目標物之性質，如若為藥物或 最終產品之方法，方法範圍應涵蓋最終偵測濃度之 80% ~ 120%。
(2) 專一性 (specificity)
專一性為能夠在預期出現物的存在下明確評估分析物之能力，這些預期出現 物可能包括不純物、分解物、基質等。以含類似樣品基質之空白樣品進行試驗，
若無空白樣品，則執行試劑空白試驗。依檢驗方法步驟進行空白樣品或試劑空白 試驗，需無干擾待測現象，必要時添加可能之干擾物質以測試方法之專一性。
(3) 檢量線 (calibration curve)
應描述檢量線之數學方程式及線性範圍，一般至少包括 5 種不同濃度(不包 括空白)，線性回歸方程式之相關係數不應低於 0.99。檢液中待測物濃度應在檢
量線之線性範圍內。
(4) 準確度 (accuracy)
分析步驟之精準度代表得到之值與傳統認可的真值 (true value)或被接受的 參考值之間的相近程度。準確度有時也被稱作真實性 (trueness)。
i. 將適量之待測物標準品添加於類似樣品基質之空白樣品中，計算其回收率
(%)。添加量包括定量極限及定量極限 2～10 倍(或待測物之管制值)至少 2 種濃度，依檢驗方法分析步驟，各進行 5 重複之檢測。而 ICH Q2(R1)文件 建議準確度之評估，應涵蓋方法範圍最少 3 個不同濃度及最少 9 個偵測值 (例如：3 個濃度各 3 重複)。
ii. 依樣品所含待測物之濃度，其回收率(%)規範如下表：
(5) 精密度 (precision)
精密度代表在規定的條件下對同質樣品的多次採樣所取得之一連串測量值 之間的相近程度。精密度應使用同質且真實之樣品，若無法取得同質樣品可以使 用人工準備之樣品或樣品溶液。精密度通常以一系列測量之變異數 (variance)、
標準差 (standard deviation)或變異係數 (coefficient of variation)來表示。
精密度之評估包括重複性(repeatability)、中間精密度(intermediate precision)及再 現性(reproducibility)，依必要性選擇執行。
a 重複性 (repeatability)
重複性代表在短時間內於相同的操作條件下之精密度。重複性也被稱為測定內精
密度 (intra-assay precision)。重複性係以同一實驗室於同一批次執行該檢驗方法，
所得之結果予以評估。
b 中間精密度 (intermediate precision)
中間精密度代表實驗室內精密度，係以同一實驗室執行該檢驗方法，於不同 分析日期、分析人員、分析設備等，所得之結果予以評估。
c 再現性 (reproducibility)
再現性代表實驗室間精密度，係以不同實驗室執行該檢驗方法，所得之結果 予以評估。
將適量之待測物標準品添加於類似樣品基質之空白樣品中，或選取合適濃度之驗 證參考物質(certified reference material, CRM)進行 5 重複之檢測。添加量包括定 量極限及定量極限 2～10 倍(或待測物之管制值)至少 2 種濃度，依檢驗方法分 析步驟，各進行 5 重複之檢測。而 ICH Q2(R1)文件建議重複性之評估，應涵蓋 方法範圍最少 3 個不同濃度及最少 9 個偵測值(例如：3 個濃度各 3 重複)或於試 驗濃度之 100%進行 6 重複測定。依樣品所含待測物之濃度，其變異係數 (CV, %) 規範如下表：
(6) 定量極限 (Limit of Quantification, LOQ)
定量極限為分析物在方法中可被定量且具適當的準確度與精密度之最低量。
定量極限為低含量物質定量方法的參數，特別像是於不純物或降解產物中。可採 以下方法：
i. 量測適當數目(n≧7)的空白樣品或低濃度樣品(約偵測極限之 1-5 倍)之感應
值，再計算其感應值之標準差(s)。
LOQ = 10 s/m； m：檢量線之斜率 ii. 訊號/雜訊比(signal/noise ratio, S/N ratio)
含有已知量待測物之低濃度樣品，經前處理後層析圖中待測物波峰之訊 號/雜訊比≧10。
iii. 評估含有已知量待測物之低濃度樣品，其回收率及重複性符合要求。
研究動機與目的
食品過敏症為食品安全上重要的議題，輕微之症狀包含皮膚起疹紅腫、消化 道發炎、呼吸道發炎、呼吸不適等，在某些特定族群(尤其是幼童)中，嚴重者可 能產生全身過敏性休克反應造成生命危險。目前我國及世界各國法律要求食品製 造者標示食品中可能含有之過敏原，然而若缺乏精確且強大的分析方法支持，法 律將無法有效地運作與被執行，於未來亦無法建立食品過敏原的閾值以強化食品 安全的管理，因此食品過敏原分析方法的研究具其迫切性與重要性。
目前食品過敏原的分析以免疫化學法之 ELISA 法最為普遍，雖然其商用套 組已相當普及與廣泛，但因 ELISA 法立基於抗體與抗原決定位之結合反應，但 在使用上發現以下缺點：一、容易產生不準確之結果，受限於抗體特異性，可能 於不同過敏原間產生交叉反應，造成偽陽性結果或因加工過程造成過敏原結構改 變抗原決定位消失，產生偽陰性結果，使得法律裁定上出現模糊地帶。二、可定 量之過敏原種類受限於套組內提供之抗體種類，多偵測一種過敏原便需多一個抗 體。三、因對於抗體之熟悉度不足，使得各套組中抗體歧異度大，造成其產生之 結果差異大。
近年以質譜為主之過敏原分析法日漸成熟，其於專一性、靈敏性皆已與 ELISA 法相當甚至更高，質譜法具有同時分析多個過敏原之能力，並擁有較低廉 之開發費用，同時其分析時間也較快速，且能自動化與標準化，亦能提供強而有 力的目標物質譜指紋證據，減少法律執行上的不確定性。質譜法不僅能夠解決免 疫法之缺點，並擁有許多其他優勢，因此質譜方法之發展受各界重視。
相較於小分子化合物的分析，將質譜定量技術應用於食品過敏原這類的蛋白 高分子上，仍具有許多障礙像是：ㄧ、前處理方法複雜，蛋白質質譜分析前需以 消化步驟，先將高分子酵素水解成胜肽進行分析。二、基於同位素稀釋法之定量，
需在蛋白分子上進行同位素標記，而蛋白質依物種、存在部位、蛋白質種類、結 構，在萃取、純化、消化、標記等步驟上會產生許多不同之差異。三、蛋白質之
標準品難以取得，因蛋白質之序列複雜、變異性大、純化不易，皆會造成其標準 品取得困難 四、於質譜圖上較複雜，胜肽分子帶電荷數多、後修飾種類多、分 子大小差異大，且因分子量大，子離子之組成也較複雜，使蛋白質一次、二次質 譜圖較為複雜，以上四點使蛋白高分子之質譜分析較小分子質譜分析具挑戰。
過敏原之來源相當多元，其中以植物性過敏原的分析較為複雜，因植物組織 蛋白質含量較低，需仰賴前處理步驟來提高分析的靈敏性；含有大量干擾物質(次 級代謝物、植物性酵素、碳水化合物)；具細胞壁，細胞較難破碎，因此於分析時 常需搭配基質特異的前處理步驟。而目前植物性過敏原之研究以花生、黃豆等常 見致敏性作物為主，於水果過敏原之研究較少。水果具有與被廣泛研究之作物不 同的特性，造成過敏原分析上之挑戰：一、水分多蛋白含量低，使其在前處理步 驟上更需注重萃取純化步驟，以確保低含量之過敏原亦能於後續質譜分析時具一 定靈敏性。二、於後熟水果中果實性質、組成、酵素活性會隨成熟度而產生巨幅 度變化。
本研究目標利用穩定同位素二甲基標記結合質譜技術建立奇異果過敏原之 分析法。奇異果為我國重要進口水果之一，亦為國民前十大食品過敏原。其為後 熟性水果，並含有大量高活性之可能干擾前處理步驟之奇異果蛋白酶 Actinidin，
使其適合做為水果過敏原前處理法開發之代表物。同時利用穩定同位素二甲基標 記法搭配合成胜肽，來產生具同位素標記之合成胜肽，此法能解決其他標記法昂 貴、費時等缺點，並能對目標過敏原進行絕對定量。期望此研究能成為未來質譜 水果過敏原分析法之範本，協助提升我國之食品安全管理。
研究架構
研究分為三部分，第一部分：進行樣品前處理方法之開發與優化；第二部分：
質譜分析方法之建立與確效；第三部分：不同加工處理對奇異果過敏原之影響。
第一部分：進行樣品前處理方法之開發與優化
1. 從四種常用的蛋白質製備法中選擇出苯酚法作為奇異果過敏原分析前處理
方法之蛋白質萃取法，並對苯酚法進行適合奇異果蛋白質萃取之方法優化，同 時開發方便操作並可與後續質譜相容之微量苯酚萃取法。優化參數包含萃取溫 度、萃取果泥量、萃取方法、沉澱時間，選擇高萃取效率、高精密度與高操作 簡易性之參數。
方法之蛋白質萃取法，並對苯酚法進行適合奇異果蛋白質萃取之方法優化，同 時開發方便操作並可與後續質譜相容之微量苯酚萃取法。優化參數包含萃取溫 度、萃取果泥量、萃取方法、沉澱時間，選擇高萃取效率、高精密度與高操作 簡易性之參數。