一、研究背景
自從工業革命以後，開始大量使用石化燃料和開發自然資源，同時也排放了 大量廢氣、廢水和固體廢棄物，造成自然生態平衡破壞。以淡水河為例，九十三 年七月台北淡水河獅子頭跳機事件（1），造成每日近百萬噸的生活污水未進入八 里污水處理場而直接排入淡水河，其中可能因是含有致癌性的物質（如戴奧辛或 是其它環境賀爾蒙等），透過食物鏈的傳遞與層層的生物蓄積與濃縮效應，最後 將危害到人們的健康。如近海養殖鮭魚含有高量戴奧辛的事件(2)等，而台灣河川 各種水產品的戴奧辛含量(如圖1)。
圖1 台灣河川各種水產品的戴奧辛含量，1 pg 等於10-12g。(原始數據取自環保署 網站http://www.epa.gov.tw/j/dioxin/index.htm)
TCDD對線蟲P450基因的影響
Cytochrome P450 (CYPs)是一群帶有heme 基質的monooxygenase 酵素 蛋白，參與了脂質、固醇類荷爾蒙以及xenobiotics 毒物的氧化代謝工作，
並對體內毒物的代謝扮演相當重要的功能。在基因調控的分子機制上，眾所 週知的2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin（TCDD，戴奧辛）透過細胞內的 AHR/ARNT 信息傳遞的活化作用，誘導CYP1A1 與CYP1B1 基因的表現
(3)。而在實驗室線蟲可以當很好的生物標示，在低濃度環境毒物的處理下，
P450等基因就會被啟動(4)，將來可以用線蟲這種生物模式，來檢測環境是否 存在TCDD等其它環境毒物。
在遺傳工程上則使用轉殖線蟲Caenorhabditis elegans 為供試生物，含有由 E. coli 之lacZ基因融合至P450，當線蟲遇TCDD壓迫時，使
o-nitrophenyl-β-galactopyranoside (ONPG)變成藍色。
二、研究目標
1. 在不同劑量TCDD和重金屬等處理下線蟲的存活率。
2. 低濃度環境毒物的處理下，P450基因等能被偵測到的最低濃度。
3. 田野調查~以線蟲作為生物指標，檢測河川水體中是否含TCDD等有毒汙染物 質？使得相關的基因被啟動。
4. 下調（knockdown）P450基因等，對線蟲外型、產卵率等影響。 OP50 strain WT 線蟲
Cholesterol
四、研究方法
使用或放入1×TAE 中儲存。DNA 樣品加入 1⁄10 體積 DNA 追蹤染劑，注入洋菜 units/µl），以無菌之三次水補至總體積為 10µl，於 4℃下作隔夜反應或在 室溫下反應 1 小時。
(2) 特異性限制酵素之接合
含有特異性限制酵素切點的線狀DNA 溶液 3µl 加入 1µl vector (同樣 含有特異性限制酵 素切點之線狀載體)、2µl T4 DNA ligase buffer、1µl ATP 及 1µl T4 DNA ligase，以無菌三次水補至總體積為 20µl，置於 16℃下反 應隔夜。
4. 質體轉型 (transformation)
(1) 通透性細胞 (competent cell) 製備
取210µl E.coli 通透細胞加入 5µl 的重組質體 DNA (recombinant plasmid DNA)，均勻混合，置冰 30 分鐘，隨後在 42℃水浴中熱休克 (heat shock) 90 秒，
再置回冰上5 分鐘，隨後加入 0.8ml SOC 培養液(SOB 溶液中加入 20 mM glucose) 均勻混合後，於 37℃恆溫振盪培養 1 小時。隨後快速離心菌液 20 秒，去
除上清液，將剩餘些許培養液與菌體重新 混合，均勻塗抹於含 Ampicillin 之 LB 培養皿中（LB/Amp），置於 37℃培養箱隔夜培養。
5. 聚合酵素連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction，PCR) 首先添加下列試劑於0.2ml 微量試管中
3. 生物技術protocal(PCR、
RNAi…)。
4. 基因調控。
5. 整理實驗桌(海大)。
6. 記錄每天實驗進度。
1/21(五) 1. 配藥。
(1) NGM、LB broth M9 buffer
(2) 不同濃度梯度TCDD、重金 屬等。
2. 滅菌、倒plate、養菌。
3. 區分出性別和不同的發育階 段。
4. 如何設計primer？→order primer(CYPs, hsp,
metallothionein…)。
1/27(四) Cloning。
knockdown線蟲。
1/28(五) 觀察、記錄knockdown線蟲外 觀、反應
1/29(六) 將knockdown線蟲置入不同濃度 的TCDD中。
2/ 7(一)
2/8~11 春節
1. 採集各河川的水體。
(1) 基隆河的上中下游。
(2) 淡水河…。
2/12(六) 將線蟲放入不同水體中。
整理報告。
2/13(日) 觀察&記錄24hr後的死亡率。
PCR→檢驗那些基因被induce？
2/14(一) 開學
參考文獻
1. www.cy.gov.tw/XMLPost/xml_di/attach/0931900839-1.DOC
2. Hites, R. A., J. A. Foran, D. O. Carpenter, M. C. Hamilton (2004) Global assessment
of organic contaminants in farmed Salmon, Science, 303, 226.
3. Whitlock, J. P., 1999. Induction of cytochrome P4501A1. Annu. Rev. Pharmacol.
Toxicol. 39, 103-125.
4. Custodia N, Won SJ, Novillo A, Wieland M, Li C, Callard IP. Custodia N, Won SJ, (2001) Caenorhabditis elegans as an environmental monitor using DNA microarray analysis. Novillo A, Wieland M, Li C, Callard IP. Ann N Y Acad Sci. 948:32-42.