高中生物技術種子教師培養:以線蟲生物模式提升生物科技之素養(含學生競賽活動)(1/2)

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行政院國家科學委員會專題研究計畫期中進度報告

高中生物技術種子教師培養:以線蟲生物模式提升生物科技

之素養(含學生競賽活動)(1/2)

計畫類別：個別型計畫

計畫編號： NSC93-2515-S-002-008-

執行期間： 93 年 10 月 01 日至 94 年 09 月 30 日

執行單位：國立臺灣大學生命科學系

計畫主持人：何國傑

共同主持人：謝豐舟，李心予

報告類型：精簡報告

處理方式：本計畫可公開查詢

中華民國 94 年 7 月 28 日

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國科會科教處九十三年度「大眾科學教育」研究計畫成果報告

計畫題目高中生物技術種子教師培養:以線蟲生物模式提升生物科技之素養計畫主持人國立台灣大學生命科學系何國傑共同主持人國立台灣大學醫學系謝豐舟國立台灣大學生命科學系李心予

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摘要

本計畫之目的，在於提升目前國內高中生物老師對現代生物學，尤其是生物技術進展之認知，並藉對線蟲生物模式之認識、研習以及實驗，培養高中生物種子教師，將線蟲實驗應用於生物教學與實習以培養基本生物科技素養。計畫實行將國內重點高中分為北、中、南等三區分為三個梯次，由國立台灣大學生命科學系提供空間、人員以及實驗材料，以線蟲為實驗材料，以兩天之時間使與會學員參與實驗之操作，以了解這種現代生物學中佔重要角色之模式生物之生活史、生理與遺傳，並期望與會學員能將這種簡易但重要之模式生物之操作，適切融入高中生物課程與教學之中，以達到提升國內高中生物科技教育水準之目的，使生物科技向下紮根。

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Abstract

The purpose of this proposal is attempted to improve the modern biological knowledge for high school biology teacher in Taiwan. Training classes are designed to provide basic and practical knowledge about C. elegans, an easy to handle nematode species, to selected high school biology teachers of Taiwan. We offered three separated two-day classes for high school biology teachers from Northern, Central, Southern and Eastern part of Taiwan. Class materials, space for the training and tutors will be offered by the Department of Life Science, National Taiwan University. The participants will discuss the life cycles, physiology and genetics of C. elegans. In the mean time, the participants will obtain basic handling skills for this model system, and also some molecular biology training as well by using this species. In the first year of the proposal, we will hold a proposal contest for the participants for how to integrate C. elegans into the current high school biology education. In the second year, a C. elegans experimental contest for high school students will be hosted by the Department of Life Science, NTU.

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計畫背景、理念及重要性

高中生物教師具備基本生物科技素養之重要性大專以下的中、小學教育，有關生物技術的教育內容非常缺乏，而且約百分之九十的生物科教師在師資培育的階段，皆未修習生物技術相關課程。然而教育部於 1995 年 10 月發布的「高級中學課程標準」之生物科課程標準中，高二的「生命科學」第八章「生命科學和人生」，整章敘述生物技術的概況；高三「生物學」的重點目標，亦強調以分子與細胞的層次探討生命現象，有關分子生物及生物技術的部份，約佔內容的 20%，可見中學生物教師有關生物技術的再教育已經刻不容緩。因此，本計畫之重點是針對我國高中之生物科教師，推動生物技術新知之在職進修教育，以密集課程及確實的實驗操作，提昇我國生物教師現代生物技術之素養，以造就我國下一代生物科技人材。本計畫之最終目的，乃在於培育生物技術高(大學)、中(專校)級種子師資，以提昇我國生物教師現代生物技術之素養，以期能達到生物技術知識經驗共享、轉移及紮根作用。教材內容涵蓋各項新生物技術之原理、操作及應用，將提供全國各校作為教學之重要參考，以提高教學成效，普及國內之生物技術教學。線蟲生物模式的特性及對培養生物科技素養之重要性線蟲與果蠅以及斑馬魚被並列為胚胎發生學的最佳模式動物。它的構造簡單，全身透明，生長快速，可大量養殖，易於產生突變，都是它平易近人的特質；此外，它的細胞數目及細胞命運圖譜(cell fate map)幾乎固定，並且易於追蹤，更使得線蟲成為研究細胞分裂與分化調控的重要模式動物。1998 年，John E. Sulston 等人完成線蟲的基因定序，成為第一個完成基因體定序的多細胞動物，也因此獲得了研究線蟲更有利的工具，使得線蟲的相關研究突飛猛進。由於牠全身透明，在高倍顯微鏡下，每個細胞都一覽無遺，對高中學生的實驗操作及觀察而言並不困難。此外，由於其基因簡易以及易於觀察之特性，線蟲已成為生物學界極為熱門之研究對象。包括國內之研究團隊在內，許多重要生理現象均藉由線蟲而被發現，以本系吳益群副教授為例，即利用線蟲之計畫性死亡為方向，發現極重要之訊息傳遞介質，並發表於多項國際知名期刊之中，為複雜的人類生理現象提供了研究的指標。因此，對這種模式動物的了解，成為對現代生物學教材編列之重要內容。線蟲生物模式在高中生物教學方面之意義以及優勢多年來國內高中生物課程皆以果蠅作為遺傳學的實驗材料，以驗證古典遺傳學中的孟德爾遺傳法則。果蠅雖然也是模式生物，但培養較費時費力，且線蟲在實驗上更具有下列優勢： (1)構造簡單，各發育階段皆可用解剖顯微鏡來區別 (2)繁殖速度快，生命週期約 3 天，可在短時間內培養大量個體來進行遺傳分析 (3)自由生活，以細菌為食，無寄生性，用簡單的細菌培養基即可培養 (4)可以冷凍，保存相當方便 (5)雌雄同體，自體受精，提高了遺傳實驗和突變株品系維持的便利性；亦可用雄性進行異體受精，進行遺傳分析

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(6)從卵、胚胎、幼蟲到成蟲皆透明，利用相位差顯微鏡可以清楚看見所有細胞基於以上幾點，線蟲不失為現代生物技術訓練之極佳教材。生物教師研習線蟲生物模式之利基如前所述，線蟲為一培養簡易且亦於操作之模式動物，以線蟲作為高中遺傳學課程的實驗材料所需要的背景知識，在現行課程大綱中皆有敘及。此外，線蟲目前於新加坡已成為高中生物實驗之教材 : (http://www.biomed-singapore.com/bms/sg/en_uk/index/research_resources/r esearch_highlights/2003/worm_starter_kit_launched.html)，廣泛推動並成效良好。因此，本計畫預計建立高中生物之種子教師教導學生認識線蟲的形態構造、生活與生殖、發育、培養等知識，並輔以現代生物學之現代生物學操作技術於課程內容，以期使學員深入了解線蟲，並期望將來使其納入高中生物實驗教材之中，以填補高中教育生物技術內容不足之缺憾。線蟲計畫之專屬教學網頁線蟲計畫已成立一個專屬網頁，提供高中老師報名、得知最新消息以及資訊交流的場所。本活動網頁網址為：http://magicfx.m3.ntu.edu.tw/nemato/link5.html。網頁的更新與維護聘請專門學生負責之，以促進本活動之資訊交流順暢。

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計畫內容本計畫分為二階段，首階段(計畫第一年)將國內之各學區重點高中依地域性分為三梯次，每梯次大約五十人次，於週休二日時間於台灣大學生命科學系之三樓以及四樓教室以及實驗室進行兩日之密集課程，以建立重點學校種子教師之建立。於第二階段(計畫第二年)預計進行種子教師推動之學生線蟲研究競賽計畫，以落實提升高中生物科技教學之目的。九十三年度實行的是本計劃之第一階段內容。

線蟲計畫教材內容：

線蟲計畫的教材內容擬定邀請國內對於線蟲生理學有專精之專家學者共同擬定。主要目的在於讓高中老師能夠了解線蟲生理，並且了解現代生物學對於利用線蟲作為模式生物之科學應用之重要性。其內容必須淺顯易懂、深入淺出。本教材提供本活動各梯次前來參加之高中老師授課之教材，其中也包含基礎的實驗原理及方法，有助於讓高中生物老師思考如何將線蟲推廣至高級中學之教育。以下是本活動教學之教材內容：

主辦者的話

本系很榮幸能夠承辦國科會科教處所委託之「高中生

物技術種子教師培養計畫」活動，感謝過程中國科會科

教處林福來處長的支持與醫學院謝豐舟教授之鼎力相

助。歡迎所有高中教師蒞臨台灣大學生命科學系，期待

這次的研習活動，能夠讓與會人員，深刻的學習到線蟲

的相關知識與操作方法，並將其推廣至我們的高中生物

教育之中。也希望透過台灣大學的推廣，讓大學的科學

研究能夠與高中生物教育接軌，為台灣的生物科技發

展，奠定穩健的基礎。

國立台灣大學生命科學系代系主任

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線蟲 PCR（worm PCR）

原理

聚合酵素鏈鎖反應（polymerase chain reaction，PCR）是在現代生物學中，被廣泛使用來增殖 DNA 的一種實驗方法。PCR 最早是由美國 Cetus 公司的 Kary Millis 在 1984 年所發明，可以在很短的時間內，準確的對某一特定序列進行量的放大到106_倍以上。

PCR 的原理十分簡單，在要放大的 DNA 片段兩端，分別設計一個前置引子（forward primer）和反置引子（reverse primer），使之與經高溫變性的單股 DNA 配對後，再使用由耐高溫細菌（Thermus aquaticus）中所分離出來的 DNA 聚合酵素（Taq DNA polimerase）進行 DNA 聚合反應，對目標片段進行複製。因此，PCR 的操作過程，可簡單的分為變性（denature）、配對（anealing）與延伸（extension）三個部分。透過自動化機械的技術，PCR 除了在各個生物實驗室中被廣泛使用外，同時也被大量應用在檢驗、公衛等其他領域之中，是現代生物學發展上一個相當重要的突破性技術。本實驗使用經遺傳技術對特定基因序列進行刪除（deletion）後之突變線蟲株，透過PCR 的進行，將可讓我們得知此突變是否成功。材料 1. 線蟲 2. 溶解溶液（lysis buffer） 3. PCR 反應試劑 4. 電泳設備與洋菜膠

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步驟

1. 將一隻線蟲挑入含有 2.5 l　溶解溶液（lysis buffer）的 eppendorf 中。 2. 將 eppendorf 放到-70℃，10 分鐘。 3. 將溶液移至冰上溶解後，加入一滴礦物油（mineral oil）。 4. 60℃，一小時。 5. 95℃，15 分鐘。 6. 將 eppendorf 放在冰上，使其降溫至 4℃。 7. 加入 22.5 l　事先配好的PCR mixture： 8. 以桌上型離心機將溶液離下。 9. 將 eppendorf 放入 PCR machine。 10. 進行 PCR program：步驟溫度（℃）時間 1 93 1：30 2 93 0：20 3 48 0：30 4 72 1：10 5 重複步驟2～4，30 次 6 72 5:00 7 結束 11. 取 PCR 產物 4 ml 與 1 ml 5X loading dye 混合，注入電泳槽中，以 1%洋菜膠電泳分析。

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常見實驗原理簡介

即時定量 PCR（real-time PCR） 即時定量PCR 是一種將傳統 PCR 加以改良的新型聚合酵素鍊鎖反應，其優點是能夠在PCR 反應進行的同時，即時測量 DNA 的產量，進而將 PCR 的結果數值化。由於PCR 反應是以 2 的倍數在放大原始的範本（template），因此在反應最初加入的範本越多，進行相同次數的PCR 反應後，所得的產物也就越多。傳統的 PCR 方法中，最後產物的濃度要靠跑膠後以螢光定量，但real-time PCR 則可以在反應的過程中，就即時偵測每次反應後，產物的數量，不僅節省時間，也為整個實驗提供了更真實可信的數據。

目前在real-time PCR 中，使用來偵測 PCR 產物的方法主要有 TaqMan probes 與SYBR green I dye 兩種方式。TaqMan probes 是在 PCR 的反應中，除了原本的 primer 之外，再加入針對PCR 產物有特異性（specificity）的探針（probe）。在此探針上的兩端，分別接有會放出螢光的標定物（reporter）與會吸收標定物能量的抑制劑（quencher）。當此兩種物質同時存在於探針上時，由於抑制劑會把標定物的能量吸收，所以就偵測不到標定物所放出來的螢光；相反的，當PCR 反應進行時，此探針會被破壞，使得標定物與抑制劑分開，此時標定物就能夠穩定的放出螢光，而此法也就是藉著偵測標定物所發出的螢光強度，來為PCR 產物定量。

第二種方法是使用SYBR green I 這種會結合到雙股 DNA 上的螢光染劑，隨著 PCR 反應的進行，在每次延伸（extension）期的最後，就會有越來越多的雙股 DNA 存在，因此也就能偵測到較強的螢光強度。

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酵素免疫分析法（ELISA）

早在1970 年代，除了顆粒性凝集反應（agglutination tests）和放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）之外，科學家就已發展出固相酵素結合試劑（solid phase enzyme-coupled reagent）的分析法，對抗原與抗體進行簡單又靈敏地偵測和定量。其主要原理是將酵素以化學鍵連結至抗原或抗體後，再被用來測定免疫複合物 (immune complexes)，而此複合物是在一固相(solid phase)中形成。

實驗中，將未結合到免疫複合物上的酵素連結物洗去，接著加入受質與酵素反應，便會產生有顏色的產物。經由光學密度(optical density)的測量，即可加以定量。由於酵素免疫分析法既簡單又靈敏，在一個簡單的實驗環境中，可被用來測定大量的微量樣本，因此，其已廣範地被使用在流行病學與感染性疾病的偵測。此外，亦經常地被用在單株抗體的篩選、荷爾蒙及藥物的偵測與定量、專一性抗體種類 (isotypes)及免疫複合物的決定、與許多其它的應用方面。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）

RNA 干擾是近年來在生物學研究上，時常被大家使用來抑制特定基因表現的一種實驗方法。RNA 干擾現象，在 1998 年首度在線蟲中發現，將雙股 RNA（dsRNA）送入細胞中後，dsRNA 會被一種名為 Dicer 的酵素切割成許多小片段，這些小片段的RNA（short interfering RNA，siRNA）結合到與其序列互補的特定序列之 RNA 上後，會引發這些RNA 的降解，使得 mRNA 無法轉譯為蛋白質，進而抑制了特定基因之表現。 RNAi 的現象除了在線蟲中被發現外，在植物、果蠅、酵母菌與哺乳類動物中，同樣都被證明有RNAi 的機制存在。而 RNAi 的技術除了在實驗上，提供給科學家一個簡易操控基因表現的管道之外，在對疾病的治療上，也同樣具有莫大的潛力。 E 受質呈色初級抗體次級抗體

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elegan—優雅的字根 若見過 Caenorhabditis elegans 曼妙的身段及渾然天成的爬行弧線，就不難想像為何有人稱 Caenorhabditis elegans為秀麗線蟲。

線蟲在發育學的歷史

2002年，肉眼所見僅0.1公分左右的線蟲（Caenorhabditis elegans）在國際上大 放異采。諾貝爾生理醫學獎頒發給在器官發育和計畫性細胞死亡遺傳調節（genetic regulation of organ development and programmed cell death）上有卓越貢獻的Sydney Brenner、Robert Horvitz和John Sulston三人。欲對發育生物學有更深一層了解的人們 不能不去了解C. elegans這簡單多細胞生物的模式動物在現代發育生物學發展上的 卓越貢獻。

Sydney Brenner可說是發展C. elegans為實驗模式動物的開山祖師。在雙股螺旋的風 潮方興未艾，DNA轉錄成RNA，RNA轉譯出蛋白質的重大發現中，1963年Sydney Brenner提出了一個新想法，他認為分子生物學的許多問題已找到答案，生物學家應該去開拓一個更迷人的神秘領域──「發育生物學」。而要進一步了解細胞發育的模式必須發展新的模式動物。這個生物必須是具有細胞分化及器官構造的簡單生物體，並能以基本的遺傳方式分析。而線蟲易培養，生活史短；個體小便於操作大量個體數；細胞數不多，可徹底研究細胞譜系和模式；已有簡單遺傳技術可運用等幾項特性符合了新模式動物的需求。Sydney Brenner的高瞻遠矚和線蟲突變技術的發展，使線蟲儼然成為發育生物學研究上的利器。利用線蟲全身透明的特性，John Sulston發揮他的細心和耐心，從受精卵開始，紀錄每一次細胞分裂的時間和分裂後各個細胞的發展情形，直到受精卵發育成一隻具有959個體細胞的成蟲，建構了完整的細胞淵源圖（cell lineage map）。從細胞淵源圖可以清楚知道每隻線蟲具有相同的發育模式（fix-lineage）。John Sulston更從中發現線蟲在正常的發育過程中總是有 131個特定的細胞會在特定的時間、地點死亡，形成鈕扣狀的細胞屍體（cell corpse），這種現象也就是我們目前所知的「計畫性細胞死亡（programmed cell death）」。此外，他也找到第一個參與細胞死亡過程的基因（nuc-1）。John Sulston的發現提供了在活體中觀察細胞死亡的利器，細胞淵源圖也讓之後的研究者在尋找發育異常的突變性狀時更得心應手。 Robert Horvitz利用基本的遺傳技術，搜尋調控計畫性細胞死亡的基因，利用細胞屍體數目變化的性狀，找到控制細胞死亡的幾個關鍵基因，如：ced-3和ced-4這兩個執行死亡任務的「殺手基因」；阻止「殺手基因」執行任務的「保鑣基因」──ced-9；收屍的第一清除大隊──ced-1、ced-6、ced-7和第二清除大隊──ced-2、ced-5、ced-10、ced-12等。Robert Horvitz也發現了這些基因是彼此合作參與細胞死亡，更重要的是在人身上也找到了同源的基因，為人體細胞凋亡（apoptosis）的分子機制提供了相關的資訊，向人類相關疾病的研究，如癌症或阿滋海默症展現一線契機。

線蟲在實驗上的優勢

1. 構造簡單，成體僅約有1000個體細胞，目前估計基因約19000個。各發育階段皆可用解剖顯微鏡來區別。 2. 繁殖速度快，生命週期在 20℃時約三天，可在短時間內培養大量個體來進行遺傳分析。 3. 自由生活，以細菌為食，無寄生性，用簡單的細菌培養基即可培養。 4. 可以冷凍保存，對於突變

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品系的保存相當方便。 5. 雌雄同體，自體受精，提高了遺傳實驗和突變株品系維持的便利性；亦可用雄性進行異體受精，進行遺傳分析。 6. 從卵、胚胎、幼蟲到成蟲皆為全身透明，利用相位差顯微鏡可以清楚看見所有細胞，再配合細胞淵源圖，對於分析突變和正常的情形很有價值。 7. 100Mb的遺傳序列已完整定序，具有演化上的保守性，便於進行分子層次的探討。 8. 可用化學突變劑、輻射、跳躍子或核糖核酸干擾技術（RNA Interference）來進行突變或分析基因功能。

線蟲生活史

線蟲（C. elegans）屬於線形動物門，在自然情況下是生活在土壤 間水層中。有兩種性別，雌雄同體（hermaphrodite；XX）和雄性（male；XO）。雄性個體的產生係肇因於配子形成時（減數分裂）X染色體（性染色體）的無分離（non-disjunction），自然發生的機率約0.1%。在實驗操作中如欲使用大量雄性個體時，可以用熱刺激（heat shock）的方式提高X染色體無分離的機率。一隻成蟲約可產下300多個卵，卵細胞在通過儲精囊後即完成受精，接著受精卵會覆上一層卵殼，受精卵經多次細胞分裂變成胚胎，14小時後孵出成為第一期幼蟲（Larva one；L1），擁有588個體細胞。經過四次蛻皮（L1 L2 L3 L4）變為成蟲，含有959個體細胞。第四期幼蟲（L4）有明顯的特徵，蟲體發育中的產卵孔（vulva）會在體側形成一個略似蠶豆形的斑點。利用L4可以進行遺傳雜交的實驗（如同果蠅實驗中選用處女蠅）。由受精卵發育至成蟲能產下受精卵所需的時間隨著溫度會有些許變化，溫度有限制的增加可以加快線蟲生長發育的速度。一般而言，20℃環境下線蟲生活史約三天一代；25℃時約兩天半。環境中食物短缺時，L3、L4和成蟲會死亡，而L2會進入一個特殊的滯育期（dauer）以度過困境，滯育期約二個月，當食物供應回復正常時，L2便會從滯育回復到正常的發育。工欲善其事，必先熟其技拾起秘笈，一探究竟

線蟲基本操作

1. 基本微生物學技術 (Basic Aseptic Techniques) 為了避免線蟲培養過程中有其他細菌或真菌的污染，製作培養基、塗菌、配製相關溶液時皆必須注意器械和使用環境的滅菌，挑蟲移蟲時養成工具過火的習慣。 2. 線蟲的食物(Worm food) 實驗室中的線蟲主要以一種特別的無抗藥性細菌菌株─OP50來餵養。由於OP50可自行製造尿嘧啶（Uracil），因此在特別配置的線蟲生長培養基上生長速度有限，僅會在塗菌區域內生長，如此可以避免線蟲陷於「菌海」之中而影響實驗的操作和觀察，亦能有效控制線蟲的活動範圍。塗菌時的菌液，以LB培養液在37℃培養箱中震盪培養（275rpm）過夜即可使用。若無培養箱或震盪器，也可以將OP50置於室溫中培養兩天，記得要偶而搖晃一下。有時為了繁殖大量線蟲或欲避免線蟲食物過早短缺，我們可以利用另一種生長較OP50快的HB101菌株來達到延長培養時間或取得大量線蟲的目的。 3. 種菌於線蟲生長培養基（Seeding Nematode Growth Medium）依照附錄完成線蟲生長培養基（Nematode Growth Medium；NGM）後，在培養基表面滴上適量的OP50菌液，均勻塗開。

塗菌時有三點須注意：第一，避免將菌液塗至培養基邊緣，以防線蟲離開濕潤培養基而乾死。第二，避免將培養基劃破，以防線蟲鑽至培養基中。第三，注意滅菌，避免污染，可以的話最好在無菌操作台中操作。塗菌後，將培養基靜置兩天讓細菌

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生長成可見的「菌海」後即可使用。 4. 線蟲的次培養（Subculturing Worms；chunking）欲大量培養或將蟲移居至新培養基上時，可以用解剖刀將原本有蟲的培養基切下一塊（器械要注意過火燒紅以滅菌），面積大小依原培養基上線蟲的數量和遷移目的而定。有菌的一面朝下，放在新培養基的「菌海」邊緣。原本在培養基表面或因食物缺乏而鑽入培養基的線蟲會搜尋食物（細菌）的氣味而移動到菌海中。何時該移居線蟲呢？在線蟲生活史中我們得知線蟲在食物短缺時，L2會進入一個類似抗壓孢子的滯育時期（dauer），等待食物資源回復時能再次復甦。因此如果看到培養基上有L2（或L1）聚集成一個個小群聚或是培養基及「菌海」的厚度明顯變薄，線蟲在「菌海」中「游泳」的痕跡變淺等跡象就表示該chunking了。 5. 挑線蟲當要對特殊幾隻線蟲做遺傳實驗（例如：性狀觀察，雜交等）或特別處理時（例如：去污染，做PCR），我們會以挑蟲的方式來達成目的。挑蟲工具稱為pick，製作方法很簡單：準備一隻玻璃滴管和一段約2-3公分的白金絲，利用本生燈將玻璃滴管管口燒融後接上白金絲，以硬幣把白金絲前端碾壓成平板狀，邊緣鋸齒部分磨平滑（以免傷害線蟲）後即可使用。使用白金絲的理由是因為鉑的比熱小，利用酒精燈即可燒紅滅菌，降溫也快，可以避免將蟲燙死。挑蟲時，在pick前端沾黏一些細菌，再輕觸欲搬移的目標線蟲，將其黏起後移至另一個培養基，pick輕觸培養基表面後線蟲即會自行爬出。挑蟲時和種菌同樣要注意避免刮傷培養基表面。 6. 去除污染保存純品系培養線蟲時可能會發生培養基污染或細菌污染的情形，可能出現的有非OP50的細菌、黴菌或塵螨。這些污染會影響實驗的操作，例如線蟲藏匿在非OP50的細菌中，無法覓食造成發育不良；或在「黴菌森林」中穿梭，阻礙觀察；更甚者，有些黴菌會毒殺線蟲，塵螨則會捕食線蟲。因此維護環境的清潔，養成實驗操作時的良好習慣，妥善滅菌等可使污染機會降低，實驗進行不易產生困擾。如不慎有污染發生，排除這些污染的方式有兩種：第一，每隔數小時遷移受污染培養基中的線蟲至乾淨無污染的培養基上，讓線蟲在爬行的過程中磨去黏附在蟲體上的污染細菌或孢子。第二，在乾淨無污染的培養基邊緣滴一滴去污染液（漂白水：5M NaOH=1：1），挑幾隻子宮內具有受精卵的成蟲放入去污染液中，蟲體被溶解後，連帶的真菌和細菌也會被殺死。而受精卵有卵殼保護，不會受到去污染液的影響，可正常孵化成幼蟲。 7. 冷凍線蟲線蟲可以長期保存在液態氮中（-195.8℃）。L1和L2的線蟲在解凍之後恢復情形最佳，因此，如需長期保有某品系的線蟲，可以收集大量的L1和L2的線蟲進行冷凍。通常在細菌吃完的隔天會有較多的L1和L2的線蟲（依品系不同會有差異），趁L1和L2的線蟲最多且線蟲尚未鑽進培養基時，以M9（線蟲的生理液）將蟲洗下，加入和M9同體積的冷凍液（freezing solution），分裝於0.5毫升的小管中（吸取蟲液時需用玻璃滴管，避免線蟲黏附在管壁）。依序轉置到冰上、-20℃、-80℃冰箱中，最後儲存於液態氮桶。解凍線蟲時，從液態氮桶中取出小管，以體溫或在室溫初步溶解後，離心使蟲體下沉，去除上層冷凍液後，以玻璃滴管將蟲液滴至乾淨培養基菌海旁，線蟲即會慢慢甦醒爬至菌海覓食。 8. 顯微鏡的使用成體肉眼可見的線蟲，在解剖顯微鏡下可以區分出性別和不同的發育階段。在相位差顯微鏡底下，則可以進一步解析觀察線蟲體內的器官，如：腸道、生殖腺、產卵孔等構造，也可以觀察到單一細胞的情形。使

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用相位差顯微鏡時必須要製作線蟲玻片標本，和一般顯微玻片標本不同的是，線蟲無法直接放置在載玻片上，由於線蟲離開濕潤培養基後會乾死，因此必須將線蟲放置於透明保水的膠體墊（agarose pad）上才能觀察。膠體墊的製作方法如下：以M9為溶劑配製1~4%的膠體液，以微波爐加熱沸騰使溶液均勻，再分裝至小管中存放於50-70℃的加熱板上以便隨時取用。製作線蟲玻片標本時，滴一滴膠體液在載玻片上，用另一片載玻片將膠體液均勻展開，待膠體凝固後移開上方載玻片，膠體墊即完成。在膠體墊上滴上一滴M9或麻醉藥劑，將線蟲挑至液體中，輕放蓋玻片即完成線蟲玻片標本。甩開印象，睜開雙眼一探視野底下線蟲的樣貌

線蟲觀察實驗

1. 發育階段：卵－comma 2-fold 3-fold 4-fold 幼蟲－L4 成蟲線蟲卵的發育會經過數個階段，comma指的是線蟲胚胎形狀類似逗號的時期，之後胚胎會漸漸變成對折的情形，即稱為2-fold，依此演變，孵化前胚胎會發育成4-fold階段，即類似8字型彎曲的四折形狀。孵化後，幼蟲會經過四次蛻皮發育為成蟲。在四個幼蟲時期中，第四齡幼蟲（L4）的腹側中央在解剖顯微鏡下有一白斑，此處即為發育中尚為成熟開放的產卵孔。而成體的線蟲體色較深，且可看到完整的生殖腺輪廓或排列整齊的卵細胞。 2. 性別辨識：雌雄同體（hermaphrodite）、雄性（male）雌雄同體的成蟲尾端是平順收尖的，而雄性線蟲在L4時期即可在尾部看見類似箭突的形狀 3. 體內構造：咽（pharynx）、腸道（intestine）、生殖腺（gonad）、精匣（spermatheca）、子宮（uterus）、產卵孔（vulva） 4. 運動方式突變種：滾動型（roller）、癱瘓型(uncoordinated) 滾動型的線蟲（rol-6）是因為肌肉排列發生問題所導致的，而癱瘓型的線蟲(unc-32)則是因為神經突變導致無法正常運動。 5. 體型、構造突變種：矮胖型（dumpy）、一袋蟲(bag of worms) 產卵孔的發育產生突變（lin）造成受精卵無法產出體外而堆積在蟲體內孵化，便會造成一隻成蟲體內有一堆幼蟲的情形，這些幼蟲最後會破成蟲而出。 6. 報導基因的表現：綠色螢光（Green Florescence Protein）、紅色螢光（Red Florescence Protein）在sur-5基因啟動子（promoter）後接上表現綠色螢光蛋白或紅色螢光蛋白的DNA序列，利用微注射（microinjection）的方式把重組的報導基因（sur-5::GFP或sur-5::RFP））打進線蟲體內即可發現有sur-5表現的全身體細胞都會發出綠色或紅色的螢光。若將sur-5基因啟動子改成unc-25基因的啟動子，則可發現神經細胞會發出螢光。孟德爾的豌豆，連接了機率和生物線蟲的性狀，帶領我們探究遺傳的面向

線蟲遺傳實驗

1. 棋盤方格的驗證孟德爾的豌豆雜交實驗中，利用一對因子的實驗結果發現控制一種性狀的基因是兩個成對存在的，減數分裂形成配子時，成對的基因會互相分離至不同配子。性狀基因有兩種型式，一為顯性，一為隱性。顯性基因和隱性基因相遇時，只有顯性的性狀會表現在個體。上述的情形稱之為「分離律」。利

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用線蟲，可以在短時間內驗證孟德爾的分離律，本實驗使用行動正常的線蟲（N2）和癱瘓型(unc-32)的線蟲來進行雜交。 1-1 挑8-10隻雄性N2和3隻雌雄同體的 unc-32為親代（P0），到培養基上，三天後移除。注意雄性N2和雌雄同體的 unc-32 皆需在L4發育階段。 1-2 待培養基上的卵全部孵化（約移除P0後兩天），以pick 輕觸第一子代（F1）之線蟲，觀察其運動情形，紀錄表現性狀及比例，推測基因的組合填於右表。 1-3 挑數隻雌雄同體的F1，每一隻隔離於不同培養基上，三天後，移除F1，紀錄第二子代（F2）的性狀及比例。

表現性狀__________

基因組合__________

想一想：1. 為什麼要採用L4來進行實驗? 2. 為何要以正常的雄性個體來進行雜交?親代性別互換後結果會一樣嗎? 3. 癱瘓型的unc-32是顯性基因還是隱性基因? 4. F2代行動正常和癱瘓的比例為何?請以棋盤方格法驗證是否符合分離律。 5. F1和F2雄性比例何者較高?為什麼? 小技巧：雄性線蟲的出現機率低，利用熱刺激可以提高雄性個體的發生率。方法如下：取數隻L4或剛成熟的雌雄

自交雜交

表現性狀__________

基因組合__________

親代（P0）

第一子代

（F1）

第二子代

（F2）

N2/N2♂ X unc-32/unc32♀

20℃，溫使下一代出現雄性的比例提高。），將鳥糞在抽氣櫃中進行。剩餘廢液以 1M 。關緊離心移除上清液，重複 2-3 次。廢液須中和後的親代同體線蟲放至30℃培養箱處理6小時再移回度升高，會2. 搜尋線蟲突變株 X射線、紫外光、迦馬射線、化學藥劑都會導致線蟲的基因產生突變。在實驗室中，化學藥劑較易取得並控制，故這個實驗中，我們使用ethyl methanesulfonate（EMS）來誘發線蟲的基因突變，EMS會造成點突變（point mutation嘌呤轉變成腺嘌

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呤(Ｇ／ＣＡ／Ｔ)。注意：EMS對人體有致癌的可能，且有揮發性。操作 EMS時務必全程戴手套，並NaOH中和後方可倒棄。 2-1 以M9收集大量的N2第四期幼蟲（L4）裝於離心管中。 2-2 加入突變劑EMS，使蟲液中EMS濃度為47mM 管蓋後再以paraffin密封，靜置四小時。 2-3 離心使蟲體下沉，移除上清液。加入M9，清洗蟲體殘餘藥劑，再始可倒棄。 2-4 經突變劑處理的線蟲為親代（P0），將離心後蟲液滴至線蟲培養基上，待其發育至成蟲。 2-5 捨棄P0第一天產下的卵，在P0開始產卵24小時後，每三隻P0為一組，分別移至不同的線蟲培養基上，每隔三小時遷移一次，分開收取P0第二天產下的卵。 P0所產下的卵為第一子代（F1）。計算F1個體數目基因庫大小（genome pool 2-6 子代（）的性狀，以確定隔離的性狀具有遺傳性。可推定此次突變處理的 size）來計算突變率。待F1為成蟲後，將F1單隻培養，觀察第二子代（F2）性狀，隔離性狀有變異的F2，再分析第三F3 3. 找出基因在何條染色體 1911年，莫根在研究果蠅兩對基因遺傳時發現實驗結果的性狀比例不符合孟德爾的遺傳法則。現在我們知道，這是因為若無互換情形發生，同一條染色體上的基因，會分配到同一個配子中，這樣不符合獨立分配原則的現象稱為聯鎖，利用這種情形，我們可以將基因位置不明的突變株和已知基因位置的突變株雜交來判斷未知基因位在何條染色體上。

(73)

線蟲計畫課程實施及內容：

為了提高研習課程的品質，並且依據國內各區域的特色及需要，我們將線蟲計畫梯次分為三梯次來舉辦。第一梯次提供台北市、台北縣、基隆市等北部地區高中老師報名報名。第二梯次提供桃園縣、新竹縣、新竹市、苗栗縣、台中縣、台中市、彰化縣、雲林縣、南投縣等中部地區高中老師報名。第二梯次提供嘉義縣、嘉義市、台南縣、台南市、高雄縣、高雄市、屏東縣、台東縣、花蓮縣、宜蘭縣、澎湖縣、金門縣、連江縣等南部及東部離島地區高中老師報名。來參加本計劃研習之高中老師不僅能夠學得知識，並且能夠就推廣線蟲作為模式生物到高中教材上面，依據地地區民情風俗需求不同交換意見，也能夠讓我們知道目前高中老師對於線蟲作為模式生物的看法與所遭遇的問題，對於我們民年舉辦”全國高中線蟲科學展覽壁報比賽”有所刊考意義。以下是課程安排之內容與詳細資料：課程安排之時間:

課程時間表

第一梯次～民國 93 年 12 月 11、12 日（週六與週日共兩天）第二梯次～民國 94 年 3 月 5、6 日（週六與週日共兩天）第三梯次～民國 94 年 5 月 7、8 日（週六與週日共兩天） (週六) (週日) 10:00~10:30 報到(三樓中庭) 10:30~11:00 開幕典禮(3 樓視聽教室) 11:10~12:10 吳益群老師授課(3 樓視聽教室) 9:30~12:00 實驗時間(12 樓實驗教室) 12:10~13:00 午餐時間(3 樓 3A 教室) 12:10~13:00 午餐時間(3 樓 3A 教室) 13:10~14:10 何國傑老師授課(3 樓視聽教室) 13:10~15:00 實驗時間(1 樓實驗教室) 14:10~17:30 實驗時間(12 樓實驗教室) 15:10~17:00 腦力激盪時間(3 樓視聽教室) 住宿資訊：立德台大尊賢會館 (02)83692858 台北市羅斯福路四段 83 號國立台灣大學鹿鳴雅舍 (02)33662238 台北市基隆路四段 144 巷 64 號公務人力發展中心的福華文教會館 (02)83691155 台北市大安區新生南路三段30 號台灣師範大學校友樓 (02)23951141 台北市和平東路一段 129-1 號綜合大樓八樓

(74)

天成大飯店 (02)2361-7856 台北市忠孝西路 1 段 43 號香城大飯店 (02)2704-9546 台北市信義路四段 295 號亞太大飯店 (02)2772-2121 台北市忠孝路 4 段 172 號華懋大飯店 (02)2521-0222 台北市中山北路 1 段 83 巷 15 號如有近一步需要可參考下列網址 http://you168.idv.tw/mothl02.htm 公文及邀請函: 線蟲計畫之實施均於每梯次活動開始時間一個月之前委託台灣大學發送公函至全國各公私立高級中學，公告活動各項相關資訊。另一方面，同時發送邀請函至台灣大學相關學術單位之教授，邀請他們前來，給予本活動意見與指教。以下是各梯次公文之內容與格式以及邀請函之內容：

國立臺灣大學函

（稿）

地址：106 台北市羅斯福路四段一號聯絡電話：二三六三○二三一轉二三五二聯絡人：林紀佑傳真電話：二三六七三三七四電子信箱：[email protected]

受文者：

如正副本

速別：普通密等及解密條件：發文日期：中華民國九十四年一月二十日發文字號：字第號附件：如文(議程大綱‧DOC、活動時間表‧DOC、位置圖‧DOC)

主旨：本校辦理九十三年度國科會科教處委託高級中學教師在職進修

活動│「高中生物技術種子教師培養計畫」研習會，隨文檢附

研習大綱、活動時間表與交通路線圖各一份，請轉知貴屬教

師及相關人員報名參加並惠允公假，敬請查照。

說明：

一、研習會日期：九十四年三月五日及六日

分類號（案名）：

(75)

二、報名截止日期為九十三年三月一日

三、報名參加人員請傳真報名或至本計劃網站

http://magicfx.m3.ntu.edu.tw/nemato/index.php

線上報

名

四、敬請鼓勵教師踴躍參加，全程參加教師將核發十二小時研習

時數。

五、未盡事宜請洽台大動物所李心予實驗室本計劃活動小

組電子

信箱 [email protected]

六、關於本計劃任何詳細資訊及最新消息請洽本計劃網站

http://magicfx.m3.ntu.edu.tw/nemato/index.php

正本：各縣市公私立高級中學

副本：國科會教科處、台大生命科學系

校長陳維昭

教授道鑒﹕

本系受國科會科教處委託，將於九

十三年十二月十一日(星期六)舉辦高級

中學教師在職進修活動│﹁高中生物技

術種子教師培養計畫﹂研習會，僅訂於

是日上午十時三十分於本校生命科學館

三樓視聽教室舉行開幕儀式，敬請

撥冗蒞臨，俾添光采。耑此奉邀。祇頌

研祺

台灣大學

(76)

生命科學系代系主任

林讚標謹上

九十三年十一月二十六日

教師研習條與公文: 有鑒於高中老師對於在職研習時數之需求，我們委託台灣大學發送公文至各縣市政府教育局，核發教師在職進修研習時數十二小時。來參加本活動之高中老師若全程參與，都可以得到計畫主辦單位國立台灣大學生命科學系核發之研習條證明。以下是同意核發教師在職進修研習時數之縣市政府教育局，以及公文內容：

國立臺灣大學函

（稿）

地址：106 台北市羅斯福路四段一號聯絡電話：二三六三○二三一轉二三五二聯絡人：林紀佑傳真電話：二三六七三三七四電子信箱：[email protected]

受文者：

如正副本

速別：普通密等及解密條件：發文日期：中華民國九十四年一月二十日發文字號：字第號附件：如文(議程大綱‧DOC、活動時間表‧DOC、位置圖‧DOC)

主旨：本校辦理九十三年度國科會科教處委託高級中學教師在職進修

活動│「高中生物技術種子教師培養計畫」研習會。申請貴

單位核發教師在職進修研習時數十二小時。隨文檢附研習大

綱、活動時間表與交通路線圖各一份，敬請查照核辦惠復。

說明：

七、研習會日期：九十四年三月五日及六日

八、報名截止日期為九十三年三月一日

九、報名參加人員請傳真報名或至本計劃網站

http://magicfx.m3.ntu.edu.tw/nemato/index.php

線上報

分類號（案名）：

(77)

名

十、敬請鼓勵教師踴躍參加，全程參加教師將核發十二小時研習

時數。

十一、未盡事宜請洽台大動物所李心予實驗室本計劃活動小

組電子

信箱 [email protected]

十二、關於本計劃任何詳細資訊及最新消息請洽本計劃網站

http://magicfx.m3.ntu.edu.tw/nemato/index.php

正本：各縣市政府教育局、教育部中部辦公室

副本：國科會科教處、台大生命科學系

校長陳維昭

●本研習依規定採計 12 小時分散式研習時數，同意核發研習十數之縣市政府教育局為下:

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94/3/16 高雄市政府同意核發高雄市各高中全程參與教師研習時數 12 小時。發文字號：高市教一字第 0940007989 號 94/3/21 高雄縣政府同意核發高雄縣各高中全程參與教師研習時數 12 小時。發文字號：府教學字第 0940056514 號 94/3/15 屏東縣政府同意核發屏東縣各高中全程參與教師研習時數 12 小時。發文字號：屏府教學字第 0940045959 號 94/3/23 花蓮縣政府同意核發花蓮縣各高中全程參與教師研習時數 12 小時。發文字號：府教學字第 09400399670 號 94/3/15 台南市政府同意核發台南市各高中全程參與教師研習時數 12 小時。發文字號：南市教學字第 09400208900 號 94/3/25 台南縣政府同意核發台南縣各高中全程參與教師研習時數 12 小時。發文字號：府教發字第 0940053787 號 93/11/15 台北市政府同意核發台北市各高中全程參與教師研習時數 12 小時，課程代號 3-3-004。發文字號：北市教中字09338934600 號 93/11/9 台北縣政府同意核發台北縣各縣立高中全程參與教師研習時數 12 小時，課程代號 3-3-004。發文字號：北府教中第0930756671 號 93/11/5 教育部中部辦公室同意核發國立及台灣省私立高中參與之合格教師研習時數共 12 小時，發文字號：教中(一)字第 0930597544 號

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94/2/17 桃園縣政府教育局同意核發桃園縣市公私立高中參與之合格教師研習時數共 12 小時，發文字號：府教學字第 0940040744 號新竹市政府教育局同意核發新竹市公私立高中參與之合格教師研習時數共 12 小時，發文字號：府教學字第 070940000017 號 94/2/4 苗栗縣政府教育局同意核發苗栗縣公私立高中參與之合格教師研習時數共 12 小時，發文字號：府教務字第 0940015968 號 94/2/5 台中市政府教育局同意核發台中市公私立高中參與之合格教師研習時數共 12 小時，發文字號：府教學字第 0940024783 號 94/2/14 南投縣政府教育局同意核發南投縣公私立高中參與之合格教師研習時數共 12 小時，發文字號：府教督字第 09400348160 號新聞稿之發送與新聞報導: 為了擴大本活動舉辦之視聽，我們特別向各大媒體發送新聞稿，將本活動宣傳至大眾媒體，期望藉此更能夠將本活動的宗旨傳達到全國每一角落。結果尬大媒體報導踴躍，我們擷取自由時報與中央日報九十三年十一月十二日的報導於此。以下是我們發送的新聞稿內容以及各大媒體的報導內容：國立台灣大學生命科學系將於93 年 12 月 11 日舉辦受國科會教科處委託之高級中學教師在職進修活動—「高中生物技術種子教師培養計畫」研習會(相關訊息見該計畫網站：http://magicfx.m3.ntu.edu.tw/nemato/index.php)。這是台灣大學首次辦理與生物科學相關的高中老師在職進修活動。活動主旨在於推動全國公私立

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高中學生參與生物學門相關科學展覽活動，並寄望藉由這三個梯次的活動，培養出專業的生物”種子教師”，並期望這些種子教師回到任職之學校後，能推動以線蟲為模式相關的科學展覽活動，以達到科學普及化的目標。科學展覽活動在國內已經實行多年，藉由舉辦科學展覽活動也培養出許多優秀的學生。然而，高中科學展覽的內容與各大專院校實際的學術研究內容仍然有一段差距。有鑑於此，台灣大學生命科學系主動承辦本次活動，目的在於將實際的學術研究精神及內容，傳達給全國各高級中學，建立起一個高中與大學在科學研究上的交流平台。台大希望藉此首例，帶動起全國各大專院校與高級中學科學教育交流風氣，共同提升國內中等學校科學教育的品質。線蟲是一種構造簡單的生物，其主要生長環境為土壤，由於取得容易，培養簡單，其透明的身軀使其適合拿來作為醫學疾病現象的研究。此外，由於線蟲基因已完全定序，因而漸漸成為科學界熱門的寵兒。比起其他的模式動物如大鼠、天竺鼠與果蠅來說，線蟲在於培養條件上的低門檻，使其更適合拿來當作高中生物科學的教材。台灣大學生命科學系希望藉由此次線蟲計畫的推動，讓全國高中生物教學，未來能與大專院校的學術研究接軌。事實上，新加坡政府積極致力於把生命科學發展成為該國製造業的第四根支柱。為更好地領導和協調生命科學領域的發展，新加坡政府專門成立了生命科學部長級委員會，並邀請了被譽為”分子細胞學之父”的美國分子科學機構總裁，同時為 2002 年諾貝爾生醫獎得主布倫納教授(Sydney Brenner)擔任諮詢顧問，領導由至

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少12 名國際知名科學家組成的國際諮詢理事會，協助執行委員會制定生命科學發展以及新加坡生命科學教育的發展方向。由於布倫納教授利用線蟲為模式生物研究生命體的發育而榮獲2002 年諾貝爾生醫獎，因此他將線蟲的研究當作新加坡生命科學教育發展的主軸。在布倫納教授教授成功的領導之下，線蟲的研究成功的推展至新加坡高級中學科學教育內容。新加坡政府這種由中統籌規劃成立科學教育委員會，委託大專院校等學術機構舉辦活動，成功推廣科學教育至高級中學的模式，十分值得我們的借鏡。因此，本次由國內科學教育機構國科會教科處主辦，國內大專院校龍頭台灣大學承辦的科學教育推廣模式，正是我國推廣科學教育的處女秀。期望能夠像新加坡一樣，藉由以線蟲研究為主軸，達到成功推展國內生命科學教育的成果。

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參加開幕典禮觀禮來賓與學者: 本活動舉辦之開幕典禮於民國九十三年十二月十一日週六上午十時三十分舉行，適逢線蟲計畫第一梯次活動開始前舉辦。當天有來自各領域之專家學者均前來參加本開幕典禮，以下是前來參加本活動開幕典禮之來賓之簽到情況與詳細資料：

開幕典禮來賓名單

廖達珊台北市建國中學生物科老師謝豐舟臺大醫院婦產科主治醫師臺大醫學院教授陳益明台灣大學生命科學系教授劉廣定台灣大學化學系教授

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邱錦輝國科會生物處研究員林曜松台灣大學生命科學院院長吳靜雄台灣大學電機工程學系教授吳武雄台北市建國中學校長吳益群台灣大學生命科學系副教授彭文正台大新聞所教授黃啟穎台灣大學生命科學系教授楊濬光新店慈濟醫院主治醫師陶錫珍台灣大學生命科學系副教授陳瑞芬台灣大學生命科學系助理教授李心予台灣大學生命科學系助理教授林讚標台灣大學生命科學系教授

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線蟲計畫之實驗活動進行: 線蟲計畫各梯次參加學員人數不同。為了維護實驗活動之品質，我們將前來參加之學員分成數個小組。每小組人數約六人左右，小組成員內有來自各個不同高級中學的生物老師，學員們在實驗之餘，還可以相互交流意見。所有實驗的結果我門後放置在線蟲計畫專屬網頁上，學員們可以隨時隨地從網頁上回顧他們的實驗結果。實驗活動安排種類多元，除了有一般的基礎實驗之外，還有特別舉辦隻挑線蟲比賽，激發學員之間的鬥志與向心力，讓學員對線蟲有更一步認識外，還能夠激發出學員對於線蟲強烈的興趣。我們也準備了精美的贈品頒發給當天線蟲比賽勝利的小組學員，認真實驗的學員也額外頒發給他小獎品，整個實驗過程就在歡笑聲中結束。以下是第一梯次學員們的實驗結果:

實驗項目

:線蟲 PCR（worm PCR）

原理

聚合酵素鏈鎖反應（polymerase chain reaction，PCR）是在現代生物學

中，被廣泛使用來增殖

DNA 的一種實驗方法。PCR 最早是由美國 Cetus

公司的

Kary Millis 在 1984 年所發明，可以在很短的時間內，準確的對某

一特定序列進行量的放大到

10

6

倍以上。

PCR 的原理十分簡單，在要放大的 DNA 片段兩端，分別設計一個前

置引子（forward primer）和反置引子（reverse primer），使之與經高溫變性

的單股

DNA 配對後，再使用由耐高溫細菌（Thermus aquaticus）中所分離

出來的

DNA 聚合酵素（Taq DNA polimerase）進行 DNA 聚合反應，對目

標片段進行複製。因此，

PCR 的操作過程，可簡單的分為變性（denature）、

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配對（anealing）與延伸（extension）三個部分。

透過自動化機械的技術，PCR 除了在各個生物實驗室中被廣泛使用

外，同時也被大量應用在檢驗、公衛等其他領域之中，是現代生物學發展

上一個相當重要的突破性技術。

本實驗使用經遺傳技術對特定基因序列進行刪除（deletion）後之突變

線蟲株，透過

PCR 的進行，將可讓我們得知此突變是否成功。

材料

5. 線蟲

6. 溶解溶液（lysis buffer）

7. PCR 反應試劑

8. 電泳設備與洋菜膠

步驟

12. 將一隻線蟲挑入含有 2.5 l

　溶解溶液（lysis buffer）的 eppendorf 中。

13. 將 eppendorf 放到-70℃，10 分鐘。

14. 將溶液移至冰上溶解後，加入一滴礦物油（mineral oil）。

15. 60℃，一小時。

16. 95℃，15 分鐘。

17. 將 eppendorf 放在冰上，使其降溫至 4℃。

18. 加入 22.5 µl 事先配好的 PCR mixture：

19. 以桌上型離心機將溶液離下。

20. 將 eppendorf 放入 PCR machine。

21. 進行 PCR program：

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步驟

溫度（℃）

時間

1 93

1：30

2 93

0：20

3 48

0：30

4 72

1：10

5 重複步驟

2～4，30 次

6 72

5:00

7 結束

22. 取 PCR 產物 4 ml 與 1 ml 5X loading dye 混合，注入電泳槽中，以 1%

洋菜膠電泳分析。

實驗結果

第一組：

M W D D W W

第三組：

W D D

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第四組：

W M D D

第五組：

(103)

第六組：

ＭＷＷＤＤ

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ＭＷＤＤ

說明：Ｗ代表野生型的線蟲，PCR 的結果可以得到較長片段的產物（cm9 gene）； D 代表 cm9 gene deletion 的線蟲，因此 PCR 所得的產物較短。藉此實驗可得知所做的突變是否成功。活動完成頒發結業證書: 各梯次全程參與活動之高中老師，我們頒發結業證書一只以資證明。下面是我們結業證書的樣式:

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線蟲計畫報名與參加活動之高中老師: 所有欲參加線蟲計畫活動之高中老師均需要連結至本計劃專屬網站上進行報名。報名開始的時間約為各梯次活東開始時間之ㄧ個月前。報名結束時間約為活動開始時間前三天，以利活動準備之進行。第一梯次活動報名人數為54 人，實際完成活動之人數為 48 人。第二梯次報名人數為 23 人，實際活動完成人數為 21 人。第三梯次報名人數為 29 人，實際活動完成人數為 22 人。每位全程參與活動之高中老師我們均頒發結業證書與研習條證明。每次活動參加人數與詳細記錄我們都嚴格控管，以下是三梯次前來參加活動老師之簽到資料：

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線蟲計畫策劃活動老師及相關工作人員:

本活動能夠順利的完成，最主要感謝台大生命科學系系主任何國傑教授的全力主辦，另外要感謝台大醫學院教授謝豐舟教授的鼎力協助。此外也要感謝台大生命科學系李心予助理教授對於活動細節的幫忙，最後感謝參與授課的老師李心予老師與吳益群老師。最後還要感謝十四名協助本活動的大小朋友們，其中包括

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博士班學生、碩士班學生、以及大學部學生。以下是本活動參與人員的名單與詳細內容：

師資陣容

教師姓名研究主題任職單位何國傑教授美國北卡羅萊那大學博士微生物學、分子生物學、基因工程、生物技術台大生科系吳益群副教授美國麻省理工學院博士細胞凋亡與遷移之分子機制台大分子細胞所李心予助理教授美國加大舊金山分校博士水解磷酸脂於內皮細胞之研究台大動物所謝豐舟教授台大醫學院醫學系胎兒學、周產醫學、高層次超音波、發育生物學、產前遺傳學台大醫院婦產部

參與線蟲計畫之工作人員名單：

姓名現職負責工作內容 1 林紀佑台大動物所博士班學生總負責人 2 廖嘉駿台大動物所碩士班學生協助教學及實驗之進行 3 章齊倫台大動物所碩士班學生協助教學及實驗之進行 4 陳家嬅台大動物所碩士班學生協助教學及實驗之進行 5 顧家瑋台大動物所碩士班學生美工及會場佈置 6 黃鈺婷台大生命科學系學生協助活動之進行 7 許之彥台大生命科學系學生協助活動之進行 8 陳又綺台大生命科學系學生協助活動之進行 9 郭育廷台大生命科學系學生協助活動之進行 10 高禎陽台大生命科學系學生協助活動之進行 11 蘇亭恩台大醫院外科研究助理協助活動之進行 12 林佳璇台大農化系學生協助活動之進行 13 謝俊弘台大生機系學生協助活動之進行 14 丁楓峻台大生命科學系學生線蟲計畫網站維護

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線蟲計畫創意競賽實施：

線蟲計畫創意競賽實施之目的，在於了解前來參加本活動之高中老師對於課程內容之理解程度。我們希望藉由來自高中老師投稿之線蟲創意競賽稿件內容，窺知高中老師們對於將線蟲作為模式生物推廣至高中教材之看法，以及目前高中生物老師對於利用線重作為重點生物實驗教材的可行性。綜合上述之內容，我們可以根據這些創意競賽之內容作為參考，作為明年舉辦”全國高中線蟲科學展覽壁報比賽”之依據。本次線蟲創意競賽同樣分北中南三階段實施，分別開放三梯次前來參加線蟲計畫之高中老師報名參加。每梯次創意競賽時間開放一個月，也就是每梯次活動結束當天算起一個月後截止投稿。所有稿件經由本活動成立審查委員會，邀約國內生物醫學界權威學者參與審查工作。各梯次分別選出一名優勝及數名佳作作品，並頒發獎狀以資鼓勵。另外再從三梯次所有投稿作品中挑選出總優勝。創意競賽得獎結果於截止收件後一個月在網頁上公佈，並郵寄獎狀給得獎人。各梯次參加創意競賽投稿踴躍，以下為各梯次得獎作品之內容: 創意競賽得獎者名單: 梯次姓名學校題目得獎一楊惠雯國立基隆女中河川汙染知多少？以線蟲的為指標生物偵測毒河川中的性污染物質優勝一丘孟恩國立師大附中線蟲 VS. 桉葉素佳作一陳梅珍國立師大附中 1.線蟲 VS. 桉葉素 2.光與線蟲之影響佳作一陳蓓蓉國立師大附中線蟲 VS. 桉葉素佳作一許迺基臺北市立永春高中 NGM（Nematoda Growth Medium）agar 中添加不同濃度佳作

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的四物湯、十全大補湯對野生 種線蟲（C.elegans）生命週期 與族群影響之研究二黃添敏私立建臺高中手機電磁波對線蟲孵化、生長與生殖的影響優勝三廖學瑞國立虎尾高中利用線蟲檢驗備長炭、竹炭飲用水的安全優勝創意競賽審查委員名單: 姓名現職 1 謝豐舟國立台灣大學醫學系教授２吳益群國立台灣大學生命科學系副教授３鄭湧涇國科會科學教育發展處處長國立台灣師範大學生命科學系教授４陳俊宏國立台灣大學生命科學系副教授創意競賽得獎者內容:

第一梯次

優勝國立基隆女中楊惠雯

河川汙染知多少？

以線蟲的為指標生物偵測毒河川中的性污染物質

一、研究背景自從工業革命以後，開始大量使用石化燃料和開發自然資源，同時也排放了大量廢氣、廢水和固體廢棄物，造成自然生態平衡破壞。以淡水河為例，九十三年七月台北淡水河獅子頭跳機事件（₁），造成每日近百萬噸的生活污水未進入八里污水處理場而直接排入淡水河，其中可能因是含有致癌性的物質（如戴奧辛或是其它環境賀爾蒙等），透過食物鏈的傳遞與層層的生物蓄積與濃縮效應，最後將危害到人們的健康。如近海養殖鮭魚含有高量戴奧辛的事件(2)等，而台灣河川各種水產品的戴奧辛含量(如圖1)。

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圖1 台灣河川各種水產品的戴奧辛含量，1 pg 等於10-12_{g。(原始數據取自環保署}

網站http://www.epa.gov.tw/j/dioxin/index.htm)

TCDD對線蟲P450基因的影響

Cytochrome P450 (CYPs)是一群帶有heme 基質的monooxygenase 酵素蛋白，參與了脂質、固醇類荷爾蒙以及xenobiotics 毒物的氧化代謝工作，並對體內毒物的代謝扮演相當重要的功能。在基因調控的分子機制上，眾所週知的2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin（TCDD，戴奧辛）透過細胞內的 AHR/ARNT 信息傳遞的活化作用，誘導CYP1A1 與CYP1B1 基因的表現

(3)。而在實驗室線蟲可以當很好的生物標示，在低濃度環境毒物的處理下， P450等基因就會被啟動(4)，將來可以用線蟲這種生物模式，來檢測環境是否存在TCDD等其它環境毒物。 在遺傳工程上則使用轉殖線蟲Caenorhabditis elegans 為供試生物，含有由 E. coli 之lacZ基因融合至P450，當線蟲遇TCDD壓迫時，使 o-nitrophenyl-β-galactopyranoside (ONPG)變成藍色。二、研究目標 1. 在不同劑量TCDD和重金屬等處理下線蟲的存活率。 2. 低濃度環境毒物的處理下，P450基因等能被偵測到的最低濃度。 3. 田野調查~以線蟲作為生物指標，檢測河川水體中是否含TCDD等有毒汙染物質？使得相關的基因被啟動。

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4. 下調（knockdown）P450基因等，對線蟲外型、產卵率等影響。三、實驗器材儀器/材料名稱功能儀器歸屬已有/申購 25℃恆培養箱塑膠培養皿酒精燈無菌操作 OP50 strain WT 線蟲解剖顯微鏡海洋大學滅菌器海洋大學 PCR 機器海洋大學 DNA polymerase 海洋大學 p10 Pipet 海洋大學 p10 tip 海洋大學洋菜膠電泳海洋大學紫外燈海洋大學 Na2HPO4 5g 挑蟲棒 2~3支 Cholesterol 四、研究方法 1. 線蟲飼養 2. DNA 洋菜膠體電泳 依 DNA 的大小決定膠體濃度，本論文中篩選較大分子 DNA 時，用 0.8% 膠體分析，1Kb 以下片段用 1%膠體分析。秤取適量洋菜膠粉末，加入 1×TAE (50×TAE 稀釋 50 倍 ) 微波爐加熱溶解後，置室溫降溫，緩緩倒入鑄膠模（5.4cm×5.9cm）中，插上齒模，吸去氣泡。室溫凝固後，再移去齒模，可立刻

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使用或放入1×TAE 中儲存。DNA 樣品加入 1⁄10 體積 DNA 追蹤染劑，注入洋菜膠體上，以1×TAE 為緩衝液，在 50～100 伏特電壓下進行凝膠電泳，待追蹤染劑行進至電泳片3/4 位置 (約 5 公分) 時，切斷電源，取出膠體以 ethidium bromide (約 0.5 mg/ml) 染色約 5 分鐘，在以清水脫色後在 UV 光下看色帶位置，並與 DNA 分子量標幟相比對，判斷DNA 分子大小及濃度，並照相存檔。 3. DNA 重組接合 (ligation) (1) PCR 產物之接合

PCR 所得產物 DNA 取大約 25 ng，加入 1µl pGEM®-T Easy Vector（50 ng/µl）、 5µl 的 2× ligation buffer 以及 1µl T4 DNA Ligase（ 3 Weiss units/µl），以無菌之三次水補至總體積為 10µl，於 4℃下作隔夜反應或在室溫下反應 1 小時。

(2) 特異性限制酵素之接合

含有特異性限制酵素切點的線狀DNA 溶液 3µl 加入 1µl vector (同樣含有特異性限制酵素切點之線狀載體)、2µl T4 DNA ligase buffer、1µl ATP 及 1µl T4 DNA ligase，以無菌三次水補至總體積為 20µl，置於 16℃下反應隔夜。 4. 質體轉型 (transformation) (1) 通透性細胞 (competent cell) 製備 自保存菌株中移殖單一寄主 E. coli 菌落於 5 ml LB 培養液中，以 37℃ 隔夜振盪培養。第二天，自隔夜菌液中取80µl 加到 50 ml SOB 培養液中，在 37℃ 振盪培養，菌液量以 OD₅₅₀鑑測，當吸光值達 0.45～0.55 時，即可將菌液置冰 10 分鐘，然後在 4℃下，以 3,000 rpm 離心 10 分鐘，隨後去除上清液，加入 5 ml TFB 溶液與菌體混合，置冰 10 分鐘，之後在 4℃下以 3,000 rpm 離心 10 分鐘。倒去上層液，加入1,200µl TFB 及 70µl DND 溶液輕混勻，置冰 10 分鐘，再加入 70µl DND 溶液輕混勻，置冰 10 分鐘。 (2) 質體轉型 (transformation)

取210µl E.coli 通透細胞加入 5µl 的重組質體 DNA (recombinant plasmid DNA)，均勻混合，置冰 30 分鐘，隨後在 42℃水浴中熱休克 (heat shock) 90 秒，再置回冰上5 分鐘，隨後加入 0.8ml SOC 培養液(SOB 溶液中加入 20 mM glucose) 均勻混合後，於 37℃恆溫振盪培養 1 小時。隨後快速離心菌液 20 秒，去

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除上清液，將剩餘些許培養液與菌體重新混合，均勻塗抹於含 Ampicillin 之 LB 培養皿中（LB/Amp），置於 37℃培養箱隔夜培養。

5. 聚合酵素連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction，PCR) 首先添加下列試劑於0.2ml 微量試管中 5µl 單股 cDNA 溶液 1µl 25mM dNTP 1µl 30µM primer-1 1µl 30µM primer-2 5µl 10× Prozyme buffer 1µl Prozyme 36µl H₂O 總體積為50µl，置入 PCR cycler 中，設定程式，開始反應。所設定程式為：

Denatural temp 94℃ 1min Annealing temp 55℃ 2min Extension temp 72℃ 3min 循環35 次後停止反應。最後取 10µl 以 DNA 洋菜膠體電泳檢測產物。 6. 重金屬溶液的配製 7. 河水的取樣方法 8. RNAi 五、預期完成之工作項目及成果日期預期完成工作成果 1/20(四) 1. 線蟲基本資料(Why小兵立大功？線蟲分那四個時期？) 。 2. DNA & RNA & 限制酶。 3. 生物技術protocal(PCR、 RNAi…)。 4. 基因調控。 5. 整理實驗桌(海大)。 6. 記錄每天實驗進度。 1/21(五) 1. 配藥。 (1) NGM、LB broth M9 buffer

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(2) 不同濃度梯度TCDD、重金屬等。 2. 滅菌、倒plate、養菌。 3. 區分出性別和不同的發育階段。 4. 如何設計primer？→order primer(CYPs, hsp, metallothionein…)。 1/22(六) 挑蟲置入各實驗組和對照組中。 1/23(日) 記算線蟲的存活率&畫出區線圖。 PCR→觀察P450基因等量的變 化。製作gel。電泳。田寮河的取樣方法？採集地點？挑蟲置入田寮河水的水體中(對照組？)。 1/24(一) 觀察&記錄24hr後的死亡率 PCR→檢驗那些基因被induce？ 1/25(二) 1/26(三) RNAi技術。 Cloning。 1/27(四) Cloning。 knockdown線蟲。 1/28(五) 觀察、記錄knockdown線蟲外觀、反應 1/29(六) 將knockdown線蟲置入不同濃度的TCDD中。 1/30(日) 觀察&記錄24hr後的死亡率。 1/31(一) 2/ 1(二) 2/ 2(三) 2/ 3(四) 2/ 4(五) 2/ 5(六) 2/ 6(日)

高中生物技術種子教師培養:以線蟲生物模式提升生物科技之素養(含學生競賽活動)(1/2)

行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告