以質譜鑑定 Chlorogenic acid 結構

Chlorogenic acid 的分子量是 354.3 Da，由 ESI-MS 負電荷分析結 果(圖 4-2)，由圖中可發現［M-H］^- 為 353.1 m/z 的訊號，此為綠原 酸失去一個氫的分子訊號。191.1 m/z 的訊號，則是綠原酸斷 C-O 鍵 後，左邊氧帶負電結構的 fragment 訊號，因為測的樣品純度不是 100%

所以其它的訊號可能是雜質。由於Chlorogenic acid 標準品可購買到，

故也測了Chlorogenic acid 標準品的 ESI-MS 負電荷(圖 4-3)，並與收 集的綠原酸作比對，同樣可發現353.1 m/z 和 191.1 m/z 這兩個訊號。

因此由質譜偵測鑑定後，可初步確定peak a 即為 Chlorogenic acid 成 分。

圖

圖4-3

7.2 mins (neg)

100 120

%

0 100 98121520 72 (0.7

1

(1.036) Cn (Cen,3, 80.00, Ht);

191.0

192.0

lorogenic

genic acid

200 220 240 260 Sm (SG, 2x0.75); Sb (3,40.00

x2 1

92.1 203.3 219.1 263

0 350 400 450

280 300 320 0 ); Cm (68:79-15:57x2.000)

.1

500 550 600

0 ); Cm (20-2:5x2.000)

I-MS負電

測ESI-MS負

340 360 380 40 353.1

387.0

650 700 750 800

706.9

4.2

b (3,40.00 ); Cm (18:23-3:11x2

561.1

4.2 99011212 53

92.9

300 350 400 450

t); Sm (SG, 2x0.75); Sb (3,40

0.00 ); Cm (52:58-8:50x2.000)

9

800 850 900 950

01.1 895.4

認這 98121518 33

108.9

150 200 250

3 (0.333) Cn (Cen,3, 80.00, H

9

169.1 151.0

4.9 203.0 265

237.0

40.00 ); Cm (32:52-3:14) 50

462.9 0

381.1 444.9 474.7

訊號，所以

646.8 662.8 739

M-H］^- 訊

圖

是

35 mins (neg

100 150 Sm (SG, 2x0.75); Sb (3,40.0

488.9

900 950 1000 105 10

(A)

(B)

圖4-9、Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)成分中碎片訊號測 MS-MS質譜圖

(A) 532.9 m/z fragment 訊號的 MS-MS 質譜圖。

(B) 488.9 m/z fragment 訊號的 MS-MS 質譜圖。

4.3 以 HPLC 分析初步批式萃取後的桑葉樣品

4.3.1 批式萃取後的 sample 1

桑葉中的成分相當的複雜，因為雜質物過多，所以若要直接從如

此多物質當中，針對目標物找出合適的 CPC 溶劑系統，使其具有較

佳的分配係數值，其實相當不容易。藉由EA 的初步批式萃取，把低

極性的目標物萃取至有機相，進而把欲分離的樣品簡單化，因此可以

比較容易找到適合的 CPC 的溶劑系統和分配係數值。由層析圖(圖

4-10)發現，經由 EA 的初步批式萃取後，e、g 這兩個目標物會被萃 取到有機相當中，分別是Isoquercitrin 和 Astragalin。

圖4-10、HPLC分析sample 1的層析圖

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0 50 100 150 200

g

mAU

min e

4.3.2 批式萃取後的 sample 2

藉由EA 加 5 mL 的甲酸做批式萃取，主要是想萃取到含有-COOH 官能基的目標物，藉由加酸可以防止-COOH 官能基解離，而使化合 物的極性降低，所以可以使含有-COOH 官能基的成分從水相被萃取 到有機相中，由層析圖(圖 4-11)發現，經由 EA 加 5 mL 的甲酸做批 式萃取後，a、h、i 這三個目標物會被萃取到有機相當中，分別是 Chlorogenic acid 、 Quercetin 3-(6-malonylglucoside) 和 Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)。

圖4-11、HPLC分析sample 2的層析圖

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0 200 400 600 800 1000

h i

mAU

min a

4.4 以 HPLC 分析標準品

根 據 文 獻 [3] 提 到 ， 桑 葉 中 存 在 Chlorogenic acid 、 Rutin 、 Isoquercitrin、Astragalin、Quercetin 3-(6-malonylglucoside)、Kaempferol 3-(6-malonylglucoside) 這 幾 種 主 要 的 抗 氧 化 物 ， 但 實 際 上 只 有 Chlorogenic acid 和 Rutin 這兩種化合物可以購買的到標準品，所以我

們進一步用HPLC 來分析這兩種成分的標準品，並與桑葉萃取的黏稠

物 層 析 圖 相 互 比 對 ， 可 以 初 步 確 認 Chlorogenic acid( 圖 4-12)和 Rutin(圖 4-13)分別存在的波鋒位置。

圖4-12、HPLC分析桑葉2號萃取物和Chlorogenic acid標準品層析圖 上圖：桑葉2 號的乙醇萃取物之層析圖。

下圖：Chlorogenic acid 標準品之層析圖。

0 5 10 15 20 25 30 35

250 a Mulberry NO.2

圖4-13、HPLC分析桑葉萃取物和Rutin標準品的層析圖 上圖：桑葉2 號的乙醇萃取物之層析圖。

下圖：Rutin 標準品之層析圖。

4.5 以離心分配層析儀分離桑葉成分的實驗結果

先前提到我們一開始使用 EA/BuOH/H2O 三項溶劑系統，經過多 組不同比例(表 4-1)測試發現，桑葉中五種目標物都傾向分佈在有機 相，表示樣品的分配係數值不理想，所以EA/BuOH/H2O 組成的溶劑 系統不適合應用在CPC 分離 Chlorogenic acid、Isoquercitrin、Astragalin、

Quercetin 3-(6-malonylglucoside)、Kaempferol 3-(6-malonylglucoside) 這五個成分。

0 5 10 15 20 25 30 35

0 400 800

1200 C

min

Rutin

0 5 10 15 20 25 30 35

0 40 80 120 160

mAU

Mulberry NO.2 C

劑系統，測試多組不同比例(表 4-2；4-3)，並得到兩組最佳化的溶劑 系統，分別應用在CPC 分離 sample 1 和 sample 2。桑葉中五種目標 物在兩相中不僅都有理想的分佈(KD在0.2 ~ 5 之間 )，且任意兩個成 分的 KD值相除，會得到較大的選擇因子(selectivity factor, α)[37]，

選擇因子越大表示不同的成分越容易被分開。

(1) CPC 分離 Sample1 的最佳化溶劑系統比例，(MTBE/Acetone/H2O

= 6：4：10)

(2) CPC 分離 Sample2 的最佳化溶劑系統比例，(MTBE/Acetone/H2O

= 6：4：10)額外加入溶劑系統總體積 0.6% (v/v)的 formic acid

表4-1、EA/BuOH/H2O三項溶劑系統，測試在不同組成比例中，桑葉 中五種目標物的分配係數值(KD)

4：6：10 6：4：10 9：1：10 Chlorogenic acid 13.53 7.43 1.83

Isoquercitrin 11.05 6.75 2.95

Astragalin 12.73 5.32 3.86

Quercetin

3-(6-malonylglucoside) 28.17 10.41 6.21 Kaempferol

3-(6-malonylglucoside) 31.87 10.37 9.46 EA/BuOH/H₂O

表4-2、MTBE/Acetone/H2O三項溶劑系統，測試在不同組成比例中，

Isoquercitrin、Astragalin的分配係數值(KD)

4：6：10 6：4：10 8：2：10

Isoquercitrin 0.22 0.23 0.52

Astragalin 0.32 0.45 0.65

表4-3、MTBE/Acetone/H₂O三項溶劑系統加甲酸，測試在不同組成比 例中，Chlorogenic acid、Quercetin 3-(6-malonylglucoside)、Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)的分配係數值(K_D)

6：4：10 加0.2% (v/v)

formic acid

6：4：10 加0.6% (v/v)

formic acid

6：4：10 加1.0% (v/v)

formic acid

Chlorogenic acid 0.38 0.23 0.68

Quercetin

3-(6-malonylglucoside) 0.56 0.54 0.80 Kaempferol

3-(6-malonylglucoside) 1.34 1.13 1.37 MTBE/Acetone/H2O

MTBE/Acetone/H2O 加 formic acid

4.5.1 sample 1 分離結果

sample 1 中主要包含 Isoquercitrin 和 Astragalin 兩個成分，我們已

找出分離sample 1 的 CPC 最佳化條件(表 4-4)，選用 MTBE / Acetone / H₂O 這組溶劑系統的原因，主要是因為溶劑極性所適合分離的樣品 範圍，包含目標物的成分，溶劑組成的體積比(MTBE / Acetone / H₂O

= 6：4：10)是經由多次嘗試後，發現此組比例，目標物可以得到最佳 的分配係數值(表 4-5)。由表中可知 KD值都小於 1，表示樣品傾向分 佈在下層相，故最後選擇以descending mode 作為實驗條件。管柱總 體積220 mL，靜相滯留量大約 187 mL，表示靜相滯留率可高達 85%。

表4-4、CPC分離sample 1的實驗參數

溶劑系統 (MTBE / Acetone / H₂O = 6：4：10) 流動模式 Descending mode (下層相當動相) 樣品進樣量 5 mL (75 mg 溶於 6 mL 的動相)

轉速 900 rpm

流速 1.0 mL/min

偵測波長 350 nm

表4-5 、 Isoquercitrin 和 Astragalin 兩 種 成 分 在 溶 劑 系 統 (MTBE / Acetone / H₂O = 6：4：10)的分配係數值

Isoquercitrin Astragalin

分配係數(K_D) 0.23 0.45

經由上述實驗參數進行CPC 分離 sample 1，所得到的結果(圖 4-14) 可明顯觀察出存在 I、II、III 三個波峰，使用分管收集器收集這三個

波峰，先將分管收集器設定在第 45 分鐘前的沖提溶液不作收集，之

後設定每3 分鐘收集一管，波峰 I 收集 51-69 min(3-8 管)；波峰 II 收 集75-99 min(11-18 管)；波峰 III 收集 114-141 min(24-32 管)，然後進 一步做HPLC 分析。由 HPLC 層析圖(圖 4-15)可得知，波峰 I 所含蓋 的都是屬於極性較大的化合物，分配係數值較小，所以最先被沖提出 管柱外；波峰II 主要是 Isoquercitrin 成分，且純度是 94.0%；波峰 III 則以Astragalin 成分為主，純度有 97.0%。經由 CPC 製備分離的兩個 成分，純度都可到達 90%以上，比起一般的 silica gel chromatography 方法[38]，樣品可以擁有更純化的結果。

圖4-14、CPC分離sample 1的層析圖

波峰I 收集 51-69 min(3-8 管)；波峰 II 收集 75-99 min(11-18 管)；波

4.5.2 sample 2 分離結果

sample 2 中 主 要 包 含 Chlorogenic acid 、 Quercetin 3-(6-malonylglucoside)和 Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)三個成分，

已找出分離sample 2 的 CPC 最佳化條件(表 4-6)，溶劑系統(MTBE / Acetone / H₂O = 6：4：10)加 0.6% (v/v)formic acid 的組成比例，使得 這三個目標物可以得到最佳的分配係數值(表 4-7)。靜相滯留量大約 185 mL，表示靜相滯留率也可高達 85%。

表4-6、CPC分離sample 2的實驗參數

溶劑系統 (MTBE / Acetone / H₂O = 6：4：10) 加0.6% (v/v) formic acid 流動模式 Descending mode (下層相當動相) 樣品進樣量 5 mL (73 mg 溶於 6 mL 的動相)

轉速 900 rpm

流速 1.0 mL/min

偵測波長 350 nm

表 4-7 、 Chlorogenic acid 、 Quercetin 3-(6-malonylglucoside) 和 Kaempferol 3-(6-malonylglucoside) 三 種 成 分 在 溶 劑 系 統 (MTBE / Acetone / H₂O = 6：4：10) 加0.6% (v/v) formic acid的分配係數值

Chlorogenic acid

Quercetin

3-(6-malonylglucoside)

Kaempferol 3-(6-malonylglucoside) 分配係

數(KD) 0.23 0.54 1.13

經由上述實驗參數進行CPC 分離 sample 2，所得到的結果(圖 4-16)

可明顯觀察出存在 A、B、C、D 四個波峰，同樣使用分管收集器收

集這四個波峰，先將分管收集器設定在第 45 分鐘前的沖提溶液不作

收集，之後設定每3 分鐘收集一管，波峰 A 收集 51-66 min(3-7 管)；

波峰B 收集 72-90 min(10-15 管)；波峰 C 收集 105-129 min(21-28 管) ； 波峰 D 收集 180-252 min(46-69 管)，然後進一步做 HPLC 分析。由 HPLC 層析圖(圖 4-17)可得知，波峰 A 所含蓋的都是屬於極性較大的 化合物，所以最容易被沖提出管柱外，其中包含了 Rutin 這個成分，

由於 Rutin 存在的量很少，所以並沒有額外分離出 Rutin 化合物；波 峰B 主要是 Chlorogenic acid 成分，且純度可達到 98.0%；波峰 C 則 以Quercetin 3-(6-malonylglucoside)成分為主，純度有 93.5%；波峰 D

則是Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)成分，純度有 92.5%。經由 CPC

製備分離的三個成分，純度也都可到達 90%以上，因此樣品確實具有

被純化的效果。

圖4-16、CPC分離sample 2的層析圖

波峰A 收集 51-66 min(3-7 管)；波峰 B 收集 72-90 min(10-15 管)；波

(B)

(C)

圖4-17、HPLC分析波峰B、波峰C和波峰D的層析圖 (A) 波峰 B 主要包含 a (Chlorogenic acid)成分。

(B) 波峰 C 主要包含 h [Quercetin 3-(6-malonylglucoside)]成分。

(C) 波峰 D 主要包含 i [Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)]成分。

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0 50 100 150 200

a g

mAU

min

h

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0

20 40 60 80 100

g

mAU

min

i

4.6 以 NMR 鑑定桑葉成分的結構

為了增加個別成分的量，以達到測 NMR 所需的量，將 150 mg 樣品分別溶在6 mL 動相中，進樣於 5 mL sample loop，經由 CPC 製 備分離並收集a、e、g、h、i 五個目標物，分別收集五次後，再用減 壓迴旋蒸餾把溶劑抽乾，然後由¹H 和¹³C NMR 做結構鑑定。雖然先

前已由偵測質譜結果可初步確認這五個成分，藉由進一步偵測 NMR

來更加證實這五個目標物的結構。在 NMR 實驗中，選擇 DMSO-d6

當作溶解樣品的溶劑，偵測後的結果分別可得到 Chlorogenic acid、

Isoquercitrin 、 Astragalin 、 Quercetin 3-(6-malonylglucoside) 和 Kaempferol 3-(6-malonylglucoside) ¹H 和¹³C NMR 圖譜，進一步與參 考文獻[3；39；40]做比對，並在圖譜標記上個別結構訊號出現的位 置，由結果發現，不論是 ¹H 或¹³C NMR 圖譜，文獻中提及的訊號，

幾乎都可以在圖4-18 ~ 4-27 的 NMR 圖譜中顯示出。

4.6.1 以 NMR 鑑定 Chlorogenic acid 結構[39]

Chlorogenic acid 的結構標記分為兩個部份，由偵測 NMR 結果發 現(圖 4-18；4-19)，文獻上所提到的訊號在綠原酸的 ¹H 和¹³C NMR

圖譜中都可被觀察到，但因為樣品的純度不是 100%，所以其它的訊

號可能是雜質所造成。其中綠原酸-OH 官能基上氫的訊號在文獻中和 本實驗之NMR 結果中都未偵測到，在之後探討中會加以解釋。在 ¹H NMR 圖譜中，3 ~ 4 ppm 存在一個較強訊號，是 DMSO-d6溶劑訊號；

而 ¹³C NMR 溶劑訊號則出現在 40 ppm 左右的位置。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d6)：δ 7.42 (1H, d, J = 16 Hz, H-7 caffeoyl), 7.03 (1H, d, J

= 2 Hz, H-2 caffeoyl), 6.98 (1H, dd, J = 2 and 8 Hz, H-6 caffeoyl), 6.77 (1H, d, J = 8 Hz, H-5 caffeoyl), 6.15 (1H, d, J = 16 Hz, H-8 caffeoyl), 5.08 (1H, br d, J = 5 Hz, H-3' quinic), 3.94 (1H, br s, H-5' quinic), 3.55 (1H, br d, J = 4 Hz, H-4' quinic), 1.7-2.1 (2H, m, H-6' quinic), 1.98 (2H, br d, J = 5 Hz, H-2' quinic)；¹³C NMR (500 MHz, DMSO-d6)：δ 174.9 (C-7' quinic), 165.7 (C-9 caffeoyl), 148.3 (C-4 caffeoyl), 145.5 (C-3 caffeoyl), 144.8 (C-7 caffeoyl), 125.6 (C-1 caffeoyl), 121.2 (C-6 caffeoyl), 115.7 (C-5 caffeoyl), 114.7 (C-2 caffeoyl), 114.3 (C-8 caffeoyl), 73.6 (C-1' quinic), 70.9 (C-3' quinic), 70.6 (C-4' quinic), 68.3 (C-5' quinic), 37.2 (C-6' quinic), 36.5 (C-2' quinic).

圖4-18、Chlorogenic acid的500 MHz ¹H NMR圖譜

圖4-19、Chlorogenic acid的500 MHz ¹³C NMR圖譜

4.6.2 以 NMR 鑑定 Isoquercitrin 結構[40]

Isoquercitrin 的結構標記分為三個部份，根據偵測 NMR 結果發現 (圖 4-20；4-21)，文獻上所提到的訊號在 Isoquercitrin 的 ¹H 和 ¹³C NMR 圖譜中都可被觀察到，但因為樣品的純度不是 100%，所以其它 的訊號可能是雜質所造成。其中Isoquercitrin -OH 官能基上氫的訊號 在文獻中和本實驗之NMR 結果中都未偵測到，只有 5 號位置-OH 官 能基上氫的訊號會顯示出在12.65 ppm 處，在之後探討中會加以解釋。

同樣在¹H NMR 圖譜中，3 ~ 4 ppm 存在一個較強訊號，是 DMSO-d6

溶劑訊號；而 ¹³C NMR 溶劑訊號則出現在 40 ppm 左右的位置。¹H NMR (DMSO-d6, 500 MHz)：δ 12.65 (1H, s, 5-OH), 7.69–7.57 (2H, m, H-2', 6'), 6.85 (1H, d, J = 9.2 Hz, H-5'), 6.40 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-6), 5.48 (1H, d, J = 6.8 Hz, H-1'')；¹³C NMR (DMSO-d6, 500 MHz)：δ 156.7 (C-2), 133.9 (C-3), 177.9 (C-4), 161.7 (C-5), 99.1 (C-6), 164.6 (C-7), 94.0 (C-8), 156.8 (C-9), 104.5 (C-10), 121.1 (C-1'), 115.7 (C-2'), 145.3 (C-3'), 148.9 (C-4'), 116.7 (C-5'), 121.7 (C-6'), 101.4 (C-1''), 74.6 (C-2''), 77.0 (C-3''), 70.5 (C-4''), 78.0 (C-5''), 61.5 (C-6'').

圖4-20、Isoquercitrin的500 MHz ¹H NMR圖譜

圖4-21、Isoquercitrin的500 MHz ¹³C NMR圖譜

4.6.3 以 NMR 鑑定 Astragalin 結構[40]

Astragalin 的結構標記分為三個部份，根據偵測 NMR 結果發現(圖 4-22；4-23)，文獻上所提到的訊號在 Astragalin 的¹H 和¹³C NMR 圖

譜中都可被偵測到，但因為樣品的純度不是 100%，所以其它的訊號

可能是雜質所造成。其中 Astragalin -OH 官能基上氫的訊號在文獻中 和本實驗之NMR 結果中都未偵測到，只有 5 號位置-OH 官能基上氫 的訊號會顯示出在 12.62 ppm 處，在之後探討中會加以說明。在 ¹H NMR 圖譜中，3 ~ 4 ppm 存在一個較強訊號，是 DMSO-d6溶劑訊號；

而 ¹³C NMR 溶劑訊號則出現在 40 ppm 左右的位置。¹H NMR (DMSO-d6, 500 MHz)：δ 12.62 (1H, s, 5-OH), 8.05 (2H,d, J = 8.8 Hz, H-2', 6'), 6.90 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3', 5'), 6.44 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-8), 6.21 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-6), 5.47 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1'')；¹³C NMR (DMSO-d6, 500 MHz)：δ 156.9 (C-2), 133.7 (C-3), 178.0 (C-4), 161.7 (C-5), 99.2 (C-6), 164.6 (C-7), 94.1 (C-8), 156.8 (C-9), 104.5 (C-10), 121.4 (C-1'), 131.4 (C-2', 6'), 115.6 (C-3', 5'), 160.4 (C-4'), 101.4 (C-1''), 74.7 (C-2''), 76.9 (C-3''), 70.4 (C-4''), 78.0 (C-5''), 61.4 (C-6'').

圖4-22、Astragalin的500 MHz ¹H NMR圖譜

圖4-23、Astragalin的500 MHz ¹³C NMR圖譜

4.6.4 以 NMR 鑑定 Quercetin 3-(6-malonylglucoside)結構[39]

Q3MG 的結構較複雜所以標記分為四個部份，根據偵測 NMR 結 果發現(圖 4-24；4-25)，文獻上所提到的訊號在 Q3MG 的 ¹H 和¹³C NMR 圖譜中都可被偵測到，因為樣品的純度不是 100%，所以其它的 訊號可能是雜質所造成。但在 ¹³C NMR 圖譜中觀察到，雜訊的訊號 有些似乎特別強，與Chlorogenic acid ¹³C NMR 結果做比對後，發現 Q3MG ¹³C NMR 圖譜存在的兩個雜訊訊號 174.9 ppm 和 70.6 ppm，同

Q3MG 的結構較複雜所以標記分為四個部份，根據偵測 NMR 結 果發現(圖 4-24；4-25)，文獻上所提到的訊號在 Q3MG 的 ¹H 和¹³C NMR 圖譜中都可被偵測到，因為樣品的純度不是 100%，所以其它的 訊號可能是雜質所造成。但在 ¹³C NMR 圖譜中觀察到，雜訊的訊號 有些似乎特別強，與Chlorogenic acid ¹³C NMR 結果做比對後，發現 Q3MG ¹³C NMR 圖譜存在的兩個雜訊訊號 174.9 ppm 和 70.6 ppm，同

在文檔中 以離心分配層析法製備分離桑葉中五種有效成分 (頁 52-0)