國 立 交 通 大 學
應用化學研究所
碩士論文
以離心分配層析法製備分離
桑葉中五種有效成分
Preparative Separations of Five Active Compounds
in Mulberry Leaves Using
Centrifugal Partition Chromatography
研 究 生：陳伶宜
指導教授：余艇 博士
以離心分配層析法製備分離
桑葉中五種有效成分
Preparative Separations of Five Active Compounds
in Mulberry Leaves Using
Centrifugal Partition Chromatography
研 究 生：陳伶宜 Student：Ling-Yi Chen 指導教授：余 艇 博士 Advisor：Dr. Tiing Yu 國立交通大學 應用化學研究所 碩士論文 A Thesis
Submitted to Institute of Applied Chemistry National Chiao Tung University in Partial Fulfillment of the Requirement
for the Degree of Master of Science
In
Applied Chemistry June 2010
Hsinchu, Taiwan, Republic of China.
以離心分配層析法製備分離
桑葉中五種有效成分
學生：陳伶宜 指導教授：余 艇 國立交通大學應用化學所 摘要 桑葉中的有效成分具有降低血液中總膽固醇濃度的效能，因而 有助於預防動脈硬化病變。本研究是利用離心分配層析(centrifugal partition chromatography, CPC)來製備分離桑葉中的Chlorogenic acid、 Isoquercitrin、Astragalin、Quercetin 3-(6-malonylglucoside)和 Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)五種成分。 離心分配層析是一種無固體靜相支持物的液相-液相層析技術， 不會有固體吸附、靜相阻塞的問題，此外離心分配層析的分離管柱中 比起典型的填充管柱可擁有更大量的靜相。根據上述兩種特性，因此 離心分配層析很適合應用在生物分子及天然物等複雜物質的分離。桑 葉經由60% (v/v)的乙醇萃取後所獲得的五種有效成分先經由電噴灑 質譜進行初步鑑定，然後再使用乙酸乙酯和去離子水做批式萃取。本實驗中使用兩組離心分配層析的溶劑系統，分別是(methyl t-butyl ether (MTBE)/acetone/H2O = 6：4：10) 和 (MTBE/acetone/ H2O = 6：
4：10)額外加入溶劑系統總體積 0.6% (v/v)的formic acid，都是以上 層有機相當作靜相，下層水相當作動相。在900 rpm 轉速下，靜相滯 留於總體積220 mL 管柱中的量為 187 mL，靜相滯留率為 85%。前處 理後的樣品經由離心分配層析製備分離，並使用紫外光-可見光譜儀 線上偵測系統，其沖提液以分管收集器每3 mL 收集一管，以高效能 液相層析分析各收集管中不同成分的純度和回收率，並以核磁共振做 結構定。在 20.0 g 的乾燥桑葉中，這五種成分依序分別得到的純度和 回收量為98% (59.2 mg)、94% (95.7 mg)、97% (56.7 mg)、93.5% (28.0 mg)、92.5% (23.0 mg)。
Preparative Separations of Five Active Compounds
in Mulberry Leaves Using
Centrifugal Partition Chromatography
Student : Ling-Yi Chen Advisor : Tiing Yu Institute of Applied Chemistry
National Chiao Tung University
Abstract
Active components in mulberry leaves are found effective in reducing the total cholesterol concentration in human blood, thus are able to help prevent atherosclerotic lesion. Preparative separations of five active compounds, including Chlorogenic acid, Isoquercitrin, Astragalin, Quercetin 3-(6-malonylglucoside) and Kaempferol 3-(6-malonylglucoside) in mulberry leaves, were carried out using centrifugal partition chromatography (CPC) in this study.
CPC is a technique of liquid-liquid chromatography which needs no solid-state support for the stationary phase. Accordingly, permanent
adsorption of analytic molecules can be avoided during elution. In addition, the stationary phase volume in the separation column can be very large compared with the packed column. These two properties make the technique very suitable for preparative separations of biomolecules and natural products. These five components in the crude extract by 60% (v/v) ethanol were first identified using ESI-MS. After pre-extractions using ethyl acetate and water, we used two solvent systems, i.e. methyl t-butyl ether (MTBE) / acetone / H2O = 6:4:10 and MTBE / acetone / H2O = 6:4:10 added with 0.6% (v/v) formic acid, to separate sample extracts. The descending elution mode was applied, i.e. the lower aqueous layer was used as the mobile phase, and the upper organic layer as the stationary phase. Under 900 rpm, the volume of the stationary phase retained was 187 mL in the separation cells of a total volume 220 mL. The CPC effluent monitored using an on-line UV/Vis detector was fraction-collected every 3 mL, and the fractions were further analyzed using HPLC and NMR. The purities and recoveries were 98% (59.2 mg)、94% (95.7 mg)、97% (56.7 mg)、93.5% (28.0 mg)、 92.5% (23.0 mg), for Chlorogenic acid, Isoquercitrin, Astragalin,
3-(6-malonylglucoside), respectively, obtained from a 20-g dry mulberry leaf sample.
謝誌 我們三個終於…畢業了！兩年的碩士班生涯即將在此告一段落， 一切一切的點點滴滴、歡笑與淚水，都將深深烙印在我記憶深處，令 我今生難以忘懷呀！ 首先誠摯的感謝恩師余艇，給予我研究與實驗方面莫大的指導， 使我獲益匪淺；感謝王念夏老師、黃賢達老師百忙之中抽空前來參加 我的口試，並感謝所有口試委員提醒我論文應該注意的細節。 謝謝淑慧學姐，成為我們最後的精神支柱，且總會教導我做人處 事的道理，在我迷惘時為我解惑，希望學姐未來在工作上能一切順利。 也謝謝經緯學長不厭其煩的指導我，在實驗上給予我很大的幫助，並 帶給我積極努力的觀念，希望幸運帶到女兵的學長當兵順利。接著謝 謝大膽國~育國告訴我們許多社會新鮮事和小道消息，也謝謝典祐帶 我探索BG 世界，我們三個又可向前邁進囉！感謝琬茹學姐和印從學 長為實驗室帶來歡樂的氣分，並謝謝宜儒、士峯以及詩軒幫我張羅口 相關的東西，也希望你們的實驗順順利利，加油！ 最後要謝謝我的家人，因為有你們的支持與關心，使我可以無後 顧之憂的順利完成學業，盼著盼著這個日子，我終於畢業了！
總目錄 中文摘要 ... i 英文摘要 ... iii 謝誌 ... vi 總目錄 ... vii 圖目錄 ... xi 表目錄 ... xiv 第一章 緒論... 1 1.1 前言 ... 1 1.2 研究動機 ... 2 第二章 研究背景與文獻回顧 ... 3 2.1 桑葉的介紹 ... 3 2.1.1 桑葉的成分 ... 3 2.1.2 桑葉成分的功效 ... 3 2.1.3 中草藥萃取物的類別 ... 5
2.2.1 簡介 ... 7 2.2.2 逆流層析的分離理論 ... 7 2.2.3 逆流層析的儀器系統 ... 10 2.2.4 逆流層析的優點 ... 13 2.3 離心分配層析 ... 14 2.3.1 原理 ... 14 2.3.2 動相與靜相的流動模式 ... 17 2.3.3 溶劑系統的選擇 ... 18 2.3.4 影響靜相滯留量的因素 ... 18 2.3.5 離心分配層析儀的應用 ... 19 第三章 實驗... 20 3.1 實驗藥品 ... 20 3.2 實驗儀器 ... 22 3.3 實驗流程 ... 24 3.3.1 桑葉的前處理流程 ... 24 3.3.2 偵測桑葉成分在分配系統中的分佈 ... 28 3.3.3 配製不同的溶劑系統 ... 28 3.3.4 純度的計算 ... 30
3.3.5 回收率的計算 ... 30 3.3.6 CPC 製備實驗步驟... 31 3.3.5 HPLC 分析收集液實驗步驟 ... 32 第四章 結果與討論 ... 34 4.1 以 HPLC 分析桑葉 2 號萃取出的黏稠物 ... 34 4.2 以質譜鑑定桑葉成分的結構 ... 35 4.2.1 以質譜鑑定 Chlorogenic acid 結構 ... 35 4.2.2 以質譜鑑定 Isoquercitrin 結構... 37 4.2.3 以質譜鑑定 Astragalin 結構 ... 38 4.2.4 以質譜鑑定 Quercetin 3-(6-malonylglucoside)結構 ... 38 4.2.5 以質譜鑑定 Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)結構 ... 40 4.3 以 HPLC 分析初步批式萃取後的桑葉樣品 ... 43 4.3.1 批式萃取後的 sample 1 ... 43 4.3.2 批式萃取後的 sample 2 ... 44 4.4 以 HPLC 分析標準品 ... 45 4.5 以離心分配層析儀分離桑葉成分的實驗結果 ... 46 4.5.1 sample 1 分離結果 ... 49
4.6 以 NMR 鑑定桑葉成分的結構 ... 56 4.6.1 以 NMR 鑑定 Chlorogenic acid 結構 ... 57 4.6.2 以 NMR 鑑定 Isoquercitrin 結構 ... 59 4.6.3 以 NMR 鑑定 Astragalin 結構 ... 61 4.6.4 以 NMR 鑑定 Quercetin 3-(6-malonylglucoside)結構 ... 63 4.6.5 以 NMR 鑑定 Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)結構 ... 66 4.6.6 探討 1H NMR 圖譜中-OH 官能基上氫訊號消失的原因 .. 68 4.7 純度的探討 ... 68 4.8 回收率的探討 ... 69 第五章 結論... 71 參考文獻 ... 73
圖目錄 圖2-1、桑葉中五種成分的結構圖 ... 6 圖2-2、液相-液相層析方法 ... 9 圖2-3、流體靜態平衡系統(HSES)示意圖 ... 11 圖2-4、流體動態平衡系統(HDES)示意圖 ... 13 圖2-5、CPC 儀器示意圖... 16 圖2-6、CPC 的兩種流動模式 ... 17 圖3-1、Rutin 的結構 ... 20 圖3-2、桑葉前處理的流程 ... 26 圖3-3、三次批式萃取示意圖 ... 27 圖3-4、CPC 實驗儀器裝置 ... 32 圖3-5、HPLC 實驗儀器裝置 ... 33 圖4-1、HPLC 分析桑葉萃取物的層析圖 ... 34
圖4-3、Chlorogenic acid 標準品測 ESI-MS 負電荷質譜圖 ... 36
圖4-4、Isoquercitrin 測 ESI-MS 負電荷質譜圖 ... 37
圖4-5、Astragalin 測 ESI-MS 負電荷質譜圖 ... 38
圖4-6、Quercetin 3-(6-malonylglucoside)測 ESI-MS 負電荷質譜圖 .. 39
圖4-7、Quercetin 3-(6-malonylglucoside)成分中碎片訊號 548.9 m/z 測
MS-MS 質譜圖 ... 40
圖4-8、Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)測 ESI-MS 負電荷質譜圖
... 41 圖4-9、Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)成分中碎片訊號測 MS-MS 質譜圖 ... 42 圖4-10、HPLC 分析 sample 1 的層析圖 ... 43 圖4-11、HPLC 分析 sample 2 的層析圖 ... 44 圖4-12、HPLC 分析桑葉 2 號萃取物和 Chlorogenic acid 標準品層析 圖 ... 45 圖4-13、HPLC 分析桑葉萃取物和 Rutin 標準品的層析圖 ... 46 圖4-14、CPC 分離 sample 1 的層析圖 ... 51
圖4-15、HPLC 分析波峰 II 和波峰 III 的層析圖 ... 51 圖4-16、CPC 分離 sample 2 的層析圖 ... 54 圖4-17、HPLC 分析波峰 B、波峰 C 和波峰 D 的層析圖 ... 55 圖4-18、Chlorogenic acid 的 500 MHz 1H NMR 圖譜 ... 58 圖4-19、Chlorogenic acid 的 500 MHz 13C NMR 圖譜 ... 58 圖4-20、Isoquercitrin 的 500 MHz 1H NMR 圖譜 ... 60 圖4-21、Isoquercitrin 的 500 MHz 13C NMR 圖譜 ... 60 圖4-22、Astragalin 的 500 MHz 1H NMR 圖譜 ... 62 圖4-23、Astragalin 的 500 MHz 13C NMR 圖譜 ... 62 圖4-24、Quercetin 3-(6-malonylglucoside)的 500 MHz 1H NMR 圖譜 ... 64 圖4-25、Quercetin 3-(6-malonylglucoside)的 500 MHz 13C NMR 圖譜 ... 65 圖4-26、Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)的 500 MHz 1H NMR 圖譜 ... 67 圖4-27、Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)的 500 MHz 13C NMR 圖譜
表目錄 表3-1 EA/BuOH/H2O 三項溶劑系統，測試不同組成比例 ... 29 表3-2 MTBE/Acetone/H2O 三項溶劑系統，測試不同組成比例 ... 29 表4-1、EA/BuOH/H2O 三項溶劑系統，測試在不同組成比例中，桑葉 中五種目標物的分配係數值(KD) ... 47 表4-2、MTBE/Acetone/H2O 三項溶劑系統，測試在不同組成比例中， Isoquercitrin、Astragalin 的分配係數值(KD) ... 48 表4-3、MTBE/Acetone/H2O 三項溶劑系統加甲酸，測試在不同組成
比例中，Chlorogenic acid、Quercetin 3-(6-malonylglucoside)、
Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)的分配係數值(KD) ... 48
表4-4、CPC 分離 sample 1 的實驗參數 ... 49
表4-5、Isoquercitrin 和 Astragalin 兩種成分在溶劑系統(MTBE /
Acetone / H2O = 6：4：10)的分配係數值 ... 50
表4-6、CPC 分離 sample 2 的實驗參數 ... 52
表4-7、Chlorogenic acid、Quercetin 3-(6-malonylglucoside)和
Acetone / H2O = 6：4：10)加 0.6% (v/v) formic acid 的分配係數值 .. 53
表4-8、利用 CPC 製備分離、純化桑葉中五種成分之純度 ... 69
表4-9、利用 CPC 製備分離、純化 sample 1 之回收率 ... 70
第一章 緒論 1.1 前言 中草藥存在的歷史相當悠久。尤其在中國、埃及和印度等皆有幾 千年的醫療貢獻，但在西醫西藥崛起後，因為證實醫學更可以針對病 症用藥，所以中草藥有漸漸式微的趨勢，但近年來可能因為有下列的 因素促成中草藥的再復甦： (1) 西藥因為常有副作用，因此許多人常以傳統的療法做輔助治療， 增加醫治機會，因而促使中草藥之興起。 (2) 中草藥產品開發的相關法規已相當完善，如國內衛生署亦已公告， “中藥新藥查驗登記需知”，“中藥藥品臨床實驗申請作業相關規定” 等，因此使中草藥產品開發環境較完善，所以產業較積極投入。 中草藥的應用方式隨著社會不斷進步而逐漸地發展，最初是直接 服用或塗敷草藥，後來發明湯劑，出現了中藥丸、中藥飲片，進而形 成了中藥方面的產業鏈。隨著現代中藥產業的進一步發展，中藥萃取 物已成為一種新型的中藥原料從中藥產業鏈中嶄露出來。由於世界各 國對草藥日益重視，因此草藥已逐漸使用於藥品、食品、化妝品、保 健用品、飲食補充劑等領域。
離心分配層析(centrifugal partition chromatography, CPC) 是一種 不使用固體支撐靜相(support-free liquid stationary phase)的液相-液相
分離技術，由於 CPC 是使用中空的管柱，內部的靜相佔總管柱體積
的比例往往可達 60%以上，因為 CPC 的管柱中含有大量的靜相，所
以 CPC 比 起 典 型 的 高 效 能 液 相 層 析 (high performance liquid
chromatography, HPLC)更適合用來分離大量的樣品。因此 CPC 目前 被定位在製備型的層析儀器，可應用在中草藥的分離，能製備大量的 中草藥標準品，對於醫學研究、藥物開發、以及科學中藥的法令制定 有相當大的幫助。 1.2 研究動機 在本研究中，我們利用離心分配層析儀的技術，搭配有機-水相 溶劑系統，並找出最合適的 CPC 溶劑系統，使桑葉樣品具有理想的 分佈，以期達到製備分離、純化桑葉中五種具有療效的成分，包括 Chlorogenic acid ( 綠 原 酸 ) 、 Isoquercitrin 、 Astragalin 、 Quercetin 3-(6-malonylglucoside)、Kaempferol 3-(6-malonylglucoside) (K3MG)等，
藉由 CPC 製備分離這五種有效成分的標準品，期望在醫學研究、藥
物或保健食品開發都能有所貢獻。在進行 CPC 分離實驗前，這些成
分 也 預 先 藉 由 ESI-MS (electrospray ionization-tandem mass
spectrometry)初步確認結構，證實這五個目標物確實存在桑葉中，之
第二章 研究背景與文獻回顧 2.1 桑葉的介紹 2.1.1 桑葉的成分 桑葉為桑科植物，在古書籍中又稱神仙葉，《本草綱目》記載： “桑葉治勞熱咳嗽，明目，長髮。”桑葉的樹皮和樹枝早已被用在中醫 治療發燒、保護肝臟、改善視力、強化關節、促進尿液排放、降低血 壓等功用[1]。在日本，桑葉茶或粉末的銷售量有增加趨勢，研究報 告顯示由丁醇萃取出桑葉中的抗氧化物，可有效抑制低密度脂蛋白氧 化[2]。根據文獻[3；4；5]的研究，桑葉中存在 Q3MG、Chlorogenic acid、 Rutin、Isoquercitrin、Astragalin、K3MG 這幾種主要的抗氧化物，大 部分屬於黃酮類(Flavonoid)的成分。 2.1.2 桑葉成分的功效 過去曾經有學者研究老鼠血管的動脈硬化實驗時發現[6]，餵食 老鼠吃會造成動脈血管阻塞的食物，而導致動脈硬化情況下，若在食 物中添加 Quercetin 3-(6-malonylglucoside)此成分，則可以明顯改善動 脈血管阻塞的現象，若在食物中改成添加桑葉的粉末，也同樣具有相 同的效果。之後作者也提到，餵食老鼠吃含有桑葉或 Q3MG 成分的 食物，比起先前沒有吃的情形時，血液中總膽固醇濃度明顯的降低許
多，可由25 mmol/L 降至 19 mmol/L 左右，事實上，若能有效降低膽 固醇的濃度，就可以預防動脈硬化疾病的發生。
Chlorogenic acid (綠原酸)[7；8；9]長期以來被作為一種抗氧化劑，
存在於咖啡豆中，在未經烘培的咖啡豆中含量高達 45%以上，而經過
烘培的咖啡豆僅存 5~10%。綠原酸的功用包括阻止小腸吸收葡萄糖
(reducing the absorption of glucose)、阻止肝糖酵素釋放葡萄糖進入血 液(reduce hepatic glycogenolysis)、幫助脂肪燃燒和提供能量給肌肉等； Rutin[10；11；12]可以抑制血小板聚集(inhibiting platelet aggregation)， 以及降低毛細血管的通透性(decreasing capillary permeability)，作為血 液稀釋劑和改善血液循環(blood thinner and improving circulation)； Isoquercitrin[13 ； 14] 能 抑 制 肥 胖 細 胞 的 去 顆 粒 化 (inhibiting degranulation of mast cells)，且具有抗發炎的作用(anti-inflammatory effect)；Astragalin[15；16]有助於減少發炎反應(reducing inflammation)
和 止 癢 的 功 用 (antipruritic effect) ； Kaempferol
3-(6-malonylglucoside)[17]具有預防罹患動脈粥樣硬化之相關病症 (prevention of atherosclerosis)。
2.1.3 中草藥萃取物的類別 根據不同的目的或要求可以對中草藥萃取物進行多種方式的分 類。例如根據用途可分為藥用萃取物、食用萃取物等；依照萃取溶劑 不同可分為水萃取物、乙醇萃取物、乙酸乙酯萃取物等。此外，目前 對於研究中草藥萃取物的種類有很多，按其作用和功效可分為： (1) 抗氧化劑：葡萄籽萃取物、綠茶萃取物等[18]。 (2) 鎮靜劑：纈草萃取物、啤酒花萃取物等。 (3) 植物雌激素與婦女保健類：當歸萃取物、黑升麻萃取物、大豆萃 取物（大豆異黃酮）[19]等。 (4) 減肥藥：烏龍茶萃取物、麻黃萃取物等。 (5) 護肝類：水飛薊萃取物、五味子萃取物[20]等。 (6) 改善心血管系統及神經保護功能類：銀杏葉萃取物、紅景天萃取 物等。
Chlor I rogenic ac Isoquercit Kaem 圖2-cid trin mpferol 3--1、桑葉中 Querc -(6-malony 中五種成 cetin As ylglucosid 成分的結構 -malonylg stragalin de) 構圖 glucoside)
2.2 逆流層析技術 2.2.1 簡介 逆流層析[21]是一種不需固體靜相支持物的液相-液相萃取技術， 所使用的動相和靜相皆為液體，並利用樣品在兩相溶劑中的分配系數 (partition coefficient)不同而分離，逆流層析的液態靜相不會有吸附現 象，所以可以避免樣品流失和管柱阻塞而失效。 早 期 的 逆 流 層 析 技 術 起 源 於 上 世 紀 50 年 代 的 逆 流 分 佈 法 (countercurrent distribution, CCD)[22]，是一種不連續式分液漏斗的液 相萃取，它採用數百個玻璃的分離管進行操作，但因其儀器複雜龐大 容易損壞且分離時間長。Yoichiro Ito 等人對於 CCD 的理論基礎開始 深入研究而發展出離心系統，根據離心力場的不同可將現代逆流層析 分為離心分配層析(centrifugal partition chromatography, CPC)，也稱盤
管 行 星 離 心 層 析 (coil plant centrifugal, CPC) ， 和 逆 流 層 析
(countercurrent chromatography, CCC)。 2.2.2 逆流層析的分離理論[23；24] 逆流層析分離的基礎是建立於逆流分佈法，CCD 是一連串的萃 取過程，其過程可用圖2-2(A)說明：若有多個連續的萃取槽，最初分 析物在 L0中，而 U0、U1….Un和 L1，L2….Ln分別為不含分析物的兩 相(L 代表下層液；U 代表上層液)。當 U0和 L0
混和後，物質在液相-液相系統中分配，達到濃度平衡時，U0 會萃走部份分析物，接著和 L1混合，完成平衡後，再依序與 L2、L3….Ln混合；新的上層液 U1、 U2、U3….依序緊隨在 U0後做相同的步驟。由二項式定理計算可知， 大部份的分析物最後會集中在某幾個萃取槽中，若一開始含有兩個分 配係數不同的混合物，藉由增加萃取槽的數目，就可以提高分離的解 析度，然而隨著萃取次數的增加，分析物的分佈也會變得比較寬 (broad)。 圖 2-2(B)，為液相-液相分配層析法，亦為 CCD 概念的延伸，分 析物在無限多個萃取槽間連續進行分配，不同的物質會由分配係數不 同而產生分離的情形，此為液相層析的原始觀點。圖 2-2(C)，為一般 所熟知的液相層析，藉由管柱中填充固體支持物，使液體靜相以物理 性吸附或化學鍵結的方式留在固體支持物的表面。前者的缺點是因為 物理性吸附性弱造成靜相易在沖提過程中溶解在動相中而減少，後者 之靜相雖然不會被帶走，但是未被靜相完全覆蓋的固體支持物，則會 吸附部份的分析物，因而造成層析峰拖尾的現象。
(A) (B) (C) ) 傳統步驟 ) 逆流萃取 ) 液相-液 圖 驟式液相萃 取(CCE) 液相層析(L 樣品注入 圖2-2、液 萃取。 ，兩相都是 LLC)，靜 入 固 液相-液相層 是動相，分 靜相是以固 固體支持物 層析方法 分別往反 固體支持物 物 液 反方向移動 物滯留在管 液相 動。 管柱中。
2.2.3 逆流層析的儀器系統[23；24]
為了能發展逆流層析成為實用的層析儀器，陸續開發出具有穿流 (flow-through)性質、不同管柱結構和不同力場的儀器。因此，逆流層 析的儀器系統依分離的管柱本身的轉動方式可區分為兩種：流體靜態 平衡系統和流體動態平衡系統。
(1) 流體靜態平衡系統(Hydrostatic Equilibrium System，HSES)
在 HSES 系統中，管柱每一個部份所受力大小固定。靜相因重力 場滯留在管柱中，樣品隨著動相穿越靜相，並藉著樣品在動靜相的分 配係數不同而達到分離。圖 2-3 為 HSES 示意圖。圖 2-3(A)，所使用 的動、靜相事先平衡過，選擇靜相為下層相，先使其充滿管柱後將動 相(上層相)由一端緩緩的注入，靜相會被動相推出直到兩相的界面到 達螺管底部，此時由於重力場的作用，動相開始往上穿越靜相直到螺 管頂端，如此一直重複直到分離管柱的末端，其每一圈的螺管都會保 留住一半的靜相。圖2-3(B)和 2-3(A)相反，使用平衡過的上層相當作 靜相，而下層相為動相，因此動靜相在螺管中會產生不同的平衡狀 態。
(2) 將靜 動 螺 (Ar 管柱 圖 (A) 靜 (B) 靜 流體動態 在 HDE 靜相滯留在 螺 旋 形 的 rchimedes 柱內存在有 圖2-3、流 靜相為下層 靜相為上層 態平衡系統 ES 系統中 在管柱中 的 管 子 ， 可 s screw fo 有輕重兩 流體靜態平 層相，動 層相，動 統(Hydrody 中，螺旋管柱 ，這扭力 可 將 河 水 orce)。此原 兩相，受阿 平衡系統( 動相為上層 動相為下相 ynamic Eq 柱會藉由 力是由希臘 水 取 至 水 壩 原理亦被應 阿基米德扭 HSES)示意 層相。 相。 quilibrium 由轉動所產 臘數學家阿 壩 ， 此 即 應用在H 扭力及重力 意圖[21] m System 產生的扭力 阿基米德發 即 所 謂 阿 基 HDES 系統 力之作用下 ，HDES) 力及離心力 發現，藉由 基 米 德 扭 統中。若螺 下，輕重兩 力， 由轉 扭 力 螺旋 兩相
因為受力不均，而在管柱中有不同的分佈，圖 2-4 說明在重力場作用 下，阿基米德扭力對旋轉中螺管的影響、圖 2-4(a)先將螺旋管中注滿 水，再導入氣泡或玻璃珠，封住螺管兩端，接著將螺管緩慢旋轉，由 於阿基米德扭力的作用，將使氣泡與玻璃珠帶往螺管的左端，此表示 不管比水輕或比水重的物質皆會向螺管的某一端移動，此端稱為螺管 的頭端(head)，而另一端則稱為尾端(tail)。圖 2-4(b)中，利用平衡過 的溶劑系統進行相同的實驗，圖2-4(b)上圖是先將螺管注滿較輕的一 相，也就是溶劑系統的上層相，而較重的一相則由尾端打入，此時較 重的一項行為就像是水中的玻璃珠會往頭端移動，圖2-4(b)下圖則先 將較重的一相注滿螺管，由尾端打入較輕的一相，其行為就像是水中 的氣泡。圖2-4(c)，先將螺管內填入等體積的輕重兩相，兩相會在螺 管的每一圈形成分離，當螺管開始轉動，任一相多餘的量則會被推至 螺管尾端。因此，當螺管達到動力學平衡，則兩相在螺管中的分佈將 保持不變，使靜相維持程度的滯留。
(a) (b) (c) 2.2 別於 體對 圖 將螺旋管 先將較重 將螺管內 離。 .4 逆流層 現代逆流 於一般的高 對樣品的吸 圖2-4、流 管中注滿水 重的一相注 內填入等體 層析的優點 流層析技 高效液能 吸附、變性 流體動態平 水，再導入 注滿螺管， 體積的輕重 點 技術為化合 能層析管柱 性、失活、 平衡系統(H 入氣泡或玻 ，由尾端打 重兩相，兩 合物的分離 柱，它無需 、拖尾等現 HDES)示 玻璃珠，封 打入較輕的 兩相會在螺 離純化提供 需固體作固 現象，且能 示意圖[22] 封住螺管兩 的一相。 螺管的每一 供了一種新 固定相，所 能達到很高 兩端。 一圈形成分 新的方法 所以不存在 高的回收率 分 ，有 在固 率，
節省昂貴的材料和溶劑的消耗。逆流層析在不需更換不同極性的層析 管柱情況下，藉由提高極性溶劑或非極性溶劑比例的方法，可以實現 流動相從弱極性到強極性或相反的轉化。由於層析管柱容積大，無填 料，管柱內的空間全部都是有效空間，因此樣品的負載能力強，製備 分離量大，再現性好。
2.3 離心分配層析(centrifugal partition chromatography, CPC) 2.3.1 原理[25] 離心分配層析屬於流體靜力平衡系統，其儀器設計原理如圖 2-5 所示，層析管柱由一系列刻在圓盤或圓筒內的導管相聯的柱體組成， 依管徑大小的不同管柱又可分為兩種，管徑小的稱duct，主要是動相 流動的通道，管徑大的稱 channel，滯留靜相的管柱部分，透過單軸 旋轉產生恆定的重力場，靜相被滯留在管柱中。管柱中兩個旋轉密封 的接口分別連接流動相的進口和出口，動相是以液滴的形式在靜相中 傳遞，樣品成分會在液滴的表面進行分佈，因為不同的物質有不同的 分配係數，因此經由自動化且連續式的萃取，就可以把樣品成分分 離。
(A)
(A) (B) (C) (C) ) CPC 外部 ) CPC 內部 ) CPC 管柱 圖 部構造與蝕 部結構，由 柱中運作原 圖2-5、CP 蝕刻在圓 由一系列圓 原理，動相 PC儀器示 圓盤上的層 圓盤組成 相是以液 示意圖[26] 層析管柱。 成。 液滴的形式式在靜相中中傳遞。
2.3 以選 因此 (de 相當 .2 動相與 由於 CP 選擇其中一 此存在兩種 escending 當作動相 上圖：as 下圖：de 與靜相的流 PC 是屬於 一相當作 種模式，一 mode)如圖 ；下降法 圖2 cending m escending 流動模式 於液相-液相 作靜相，另一 一種是上升 圖2-6 所示 法則是以上 2-6、CPC mode，下層 mode，上 相層析技 一相則當作 升法(asce 示，上升 上層相當作 的兩種流 層相當作 上層相當作 技術，根據 作動相，動 ending mo 升法是以下 作靜相，下 流動模式[2 作靜相，上 作靜相，下 據實驗條件 動靜相可以 ode)，另一 下層相當作 下層相當作 27] 上層相當作 下層相當作 件的不同， 以互相交換 一種是下降 作靜相，上 作動相。 作動相。 作動相。 ，可 換。 降法 上層
2.3.3 溶劑系統的選擇[28；29] 大部分的溶劑系統含水，加上其他有機溶劑，相互達到飽和而成 為不互溶的兩相，分別為動相和靜相。其溶劑的成分組合視其實驗的 分離條件而決定。在離心分配層析當中，溶劑系統的選擇有幾點必須 注意：(1) 樣品有充分的溶解度 (2) 樣品不會被分解和去活性 (3) 適 當的分配係數 (4) 良好的靜相滯留量。 2.3.4 影響靜相滯留量的因素 在離心分配層析中，液體靜相在管柱中滯留的多寡影響了分離的 效率，在較高的靜相滯留量下可提高對樣品的承載量和分離的解析度。 影響靜相滯留量及分離的效率的因素分為下列幾點[30] (a) 溶劑系統：在選擇適當的溶劑系統時必須考慮溶劑極性、對溶質 的選擇性以及溶質在不同溶劑中的溶解度。一般而言，分析物在 兩相溶極間最佳的分配係數 KD需在 0.2 ~ 5 之間，才能獲得較佳的 分離效果。但在二元的溶劑系統中，KD值要落在此範圍不容易， 因此，常藉由加入第三種甚至第四種可溶於原先兩者的溶劑，用 來調和原先溶劑在極性或是界面張力的差異。然後依 KD來判斷分 離結果，並決定動靜相。 (b) 儀器轉速：在較大的轉速下，使靜相越容易滯留在管柱中，且因
層，這兩個結果均可提供較高的靜相滯留量，在有關於離心分配 層析分離效果的研究中，若可以得到靜相滯留量越大，解析度也 較佳，所以在CPC 機械結構可以承受的轉速之下，轉動速度越快， 分離效果越好。 (c) 動相流速：當動相流速越快時，越容易將靜相推出管柱，因此靜 相的滯留量會比較少，分離效果較差。反之動相流速若較慢，會 達到較佳的靜相滯留量，且可提高分離解析度，但相對地分離時 間會變長。 2.3.5 離心分配層析儀的應用 以往 CPC 主要應用在天然物製備分離，曾經有學者研究葡萄籽 與 葡 萄 藤 蔓 中 的 成 分 [31] ， 並 大 量 分 離 出 葡 萄 藤 蔓 中 的 trans-resveratrol，此成分具有降低血小板凝集效果，相當於活血作用， 所以也可以防止血栓，甚至中風等疾病。近年來有學者將CPC 與 chiral selectors 結合，應用在分離鏡像異構物的分子[32]，根據研究結果指 出，CPC 也可成功製備分離鏡像異構物。
3.1 (1) 購買 NO alb 育蠶 (2) Chl Bel Rut Bel 實驗藥品 桑葉 買自苗栗縣 O.2)。大部 a L.品種的 蠶業農場可 標準品 lorogenic lgium, US tin(圖 3-1 lgium, US 品 縣泉明生 部分研究桑 的乾燥桑 可購買到 acid, C16H SA) ), C27H30O SA) 第 生態教育蠶 桑葉的文獻 桑葉，根據 到此品種的 H18O9, M.W O16, M.W. 圖3-1 第三章 實驗 蠶業農場，編 獻[3；6；33 據文獻[34] 的乾燥2 號 W. 354.3, . 664.6, 97 、Rutin的 驗 編號為台 3；34]所選 的記載， 號桑葉。 , 99%, GR 7% up, GR 的結構 台灣桑葉 2 選用的都是 苗栗縣的 R grade (A R grade (A 號(Mulbe 是屬於Mo 的泉明生態 ACROS, G ACROS, G erry orus 態教 Geel, Geel,
(3) 溶劑
Acetonitrile (ACN), HPLC grade, 99.9%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA) Deionized water, purified from Milli-Q plus, (Bedford, MA, USA)
Methyl t-Butyl Ether (MTBE), HPLC grade, 99.8%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA)
Ethanol, 99.5%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA)
Acetone, HPLC grade, 99.9%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA) Formic acid, 98% up, (ACROS, Geel, Belgium, USA)
Ethyl Acetate (EA), HPLC grade, 99.8%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA) n-Butanol (BuOH), ACS grade, 99.9%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA)
3.2 實驗儀器
(1) 離心分配層析儀
CPC 是由 Sanki (Tokyo, Japan)所生產，型號是 CPC 240，內部主
體由 12 個 disks 所構成，包含 3136 個 channels，最高可耐壓為 6.2×
106 N/m2 (900 psi)，管柱總容積大約 220 毫升，此儀器的轉速可以控
制在0 ~ 2000 rpm。藉由轉動外部控制閥，就可輕易選擇 ascending
mode 或 descending mode 的操作模式。 (2) 往覆式幫浦
此幫浦為Series II Digital HPLC pump ，流速可由 0.01 mL/min ~
9.99 mL/min，購買自 Pharma-Tech Research Company (Baltimore, MD, USA)。
(3) 梯度沖提幫浦
梯度控制器LabGrad 是由 Lab Alliance (Apple Valley, MN, USA)
公司製造，並結合了Series III pump，流速設定可由 0.01 mL/min ~
10.00 mL/min，最多可做四種動相組成的混合梯度。 (4) 高效能液相層析管柱
由Polymer Laboratories 製造的 PLRP-S column (250 mm × 4.6
(5) 紫外光-可見光偵測器(UV-Visible Detector)
型 號 為 Bio-Rad Model 1801 UV-Visible detector (Bio-Rad,
Hercules, CA, USA)，偵測器外部與個人電腦連接，利用色層分析儀 數據處理系統(訊華公司，台北市)擇取實驗訊號。
(6) 紫外光-可見光譜儀(UV-Visible Spectrophotometer) Hewlett Packard 8453, (Waldronn, Germany)。 (7) 離心機
型號為EBA20 (Hettich, Germany)，最大轉速 6000 rpm，最大離
心力為 3421 g。 (8) 迴旋減壓蒸餾器
廠牌為 Buchi (Switzerland)，型號是 R-114。 (9) 分管收集器
廠牌為Advantec (Tokyo, Japan)，型號是 CHF1215A。
(10) ESI-MS
廠牌為 Micromass (Manchester, England)，型號是 Quattro Micro，
主要使用分子量小於2000 電灑游離法質譜。
(11) NMR 500
此儀器廠牌為美國Varian (Lexington, MA, USA)，型號是 Unity
Inova -500。重要規格具有(a)超導體磁鐵、電子控制系統、工作站電 腦(b)雙射頻配合 Z 的脈衝磁場梯度(c)變溫裝置(d)探頭分為 5 mm
SWPFG 正向探頭、5 mm IDPFG 反向探頭、Nano probe 超微量膠態 用。 3.3 實驗流程 3.3.1 桑葉的前處理流程 桑葉前處理的流程如圖3-2 所示 在進入 HPLC 分析前，桑葉樣品必須做前處理的步驟，據由文獻 [35]的研究，作者秤 2.0 g 的乾燥桑葉粉末，嘗試利用 20 mL 不同濃 度的乙醇水溶液(0％、20％、40％、60％、80％、100％，v/v)做兩次 萃取，然後再進行 HPLC 的分離，結果可發現桑葉經由 60％乙醇水 溶液萃取後，所得到的 Flavonol compounds 含量最多，由於我們的研 究目的是想分離出桑葉中的Chlorogenic acid、Isoquercitrin、Astragalin、 Q3MG、K3MG 五種成分如圖 2-1 所示，大部分是屬於 Flavonol compounds，故在桑葉樣品的前處理步驟中，則選用 60％乙醇水溶液 做萃取。 (1) 先用天平秤 20.0 g 的乾燥台灣桑葉 2 號，然後使用 500 mL 的 60% (v/v)乙醇做萃取，在 40 °C 的水浴中利用磁石攪拌萃取 2 小時，之後 使用抽器過濾來除去殘渣的部分，並保留濾液的部分，再使用迴旋減 壓蒸餾器把溶劑抽乾。由於桑葉中的成分相當複雜，希望藉由初步的
批式萃取除去極性較大的化合物，使分離的目標物單純化。 (2) 把溶劑抽乾後的黏稠物，先溶於 100 mL 的去離子水中，使用 300 mL 的 EA 做批式萃取(圖 3-3)，首先加入 100 mL EA，劇烈搖晃後， 靜置 30 分鐘使兩相達到平衡，之後將下層相轉移至另一個分液漏斗 中，再加入新鮮的100 mL EA 於下層相中，同樣劇烈搖晃後，靜置 30 分鐘使兩相達到平衡，再作一次下層相的轉移，最後加入一次新 的100 mL EA，待至平衡，上述總共做了三次批式萃取，故會得到大 約300 mL 的 EA 相和 100 mL 的水相。保留三次 EA 有機相的部分， 並使用迴旋減壓蒸餾器把溶劑抽乾，當作sample 1。 (3) 經由三次 100 mL 的 EA 做批式萃取後的下層水相，再使用每次 100 mL 的 EA 加 0.5 mL 的甲酸做兩次的批式萃取，總共使用 200 mL 的 EA，保留兩次 EA 有機相的部分，並使用迴旋減壓蒸餾器把溶劑 抽乾，當作 sample 2。加入甲酸的目的是希望萃取到含有-COOH 官 能基的目標物，因為酸可以防止-COOH 官能基解離，而降低化合物 的極性，所以可以使得含有-COOH 官能基的成分從水相被萃取到有 機相中。
Samp 圖 ple 1 圖3-2、桑 Samp 桑葉前處理 ple 2 理的流程
先將 劇烈 一個 30 待至 相和 將桑葉萃取 烈搖晃後 個分液漏斗 分鐘，再 至平衡，上 和100 mL 圖 取黏稠物 ，靜置 30 斗中，再加 再作一次下 上述總共做 L 的水相 圖3-3、三次 物溶於100 0 分鐘使兩 加入新鮮 下層相的轉 做了三次批 。 次批式萃 mL 的去離 兩相達到 鮮的100 m 轉移，最後 批式萃取 萃取示意圖 離子水中 到平衡，之 mL EA，同 後加入一次 取，故會得到 圖 ，並加入1 之後將下層 同樣劇烈搖 次新的10 到大約30 100 mL EA 層相轉移至 搖晃後並靜 00 mL EA 00 mL 的 A， 至另 靜置 A， EA
3.3.2 偵測桑葉成分在分配系統中的分佈 在實驗過程中，將所配製的 20 mL 有機-水相系統，加入 10 mg 的桑葉樣品，劇烈的搖晃待至平衡後，上、下層相各取4 毫升，然後 用迴旋減壓蒸餾器把溶劑抽乾，再分別加入1 毫升的 HPLC 動相，之 後進樣HPLC 做分析，可得到上、下層相的層析圖，同一個成分在兩 相的濃度比值，也就是層析峰面積積分比值，可得到桑葉各個成分在 兩相中的分佈(KD)。
Cu ： concentration of solute in the upper phase
Cl ： concentration of solute in the lower phase
3.3.3 配製不同的溶劑系統
一開始曾嘗試使用 EA/BuOH/H2O 三項溶劑系統(ternary solvent
systems)，經過多組不同比例(表 3-1)測試發現，桑葉中五種目標物都
傾向分佈在有機相，表示樣品分佈不是很理想，所以 EA/BuOH/H2O
組成的溶劑系統不適合應用在CPC 分離桑葉方面。
劑系統，測試多組不同比例(表 3-2)，並得到兩組最佳化的溶劑系統， 分別應用在CPC 分離 sample 1 和 sample 2。桑葉中五種目標物在兩 相中都有理想的分佈。 表3-1 EA/BuOH/H2O三項溶劑系統，測試不同組成比例 EA/BuOH/H2O 4 : 6 : 10 6 : 4 : 10 9 : 1: 10 表3-2 MTBE/Acetone/H2O三項溶劑系統，測試不同組成比例 MTBE/Acetone/H2O 4 : 6 : 10 6 : 4 : 10 8 : 2 : 10 MTBE/Acetone/H2O 加 formic acid 6 : 4 : 10 加0.2% (v/v) formic acid 6 : 4 : 10 加0.6% (v/v) formic acid 6 : 4 : 10 加1.0% (v/v) formic acid
3.3.4 純度的計算 大部份利用 CPC 或 CCC 儀器應用在製備分離中草藥方面[31； 32]，其純度計算方法，主要是藉由不同物質在 HPLC 層析圖中，單 一物質的波峰面積佔總面積的百分比。 純度的計算： 純度 % 單一成分波峰面積 HPLC 所有層析峰的總面積 100% 3.3.5 回收率的計算 根據文獻[36]提到，回收率的計算方法，首先要確認樣品進樣於 CPC 的重量，然後與 HPLC 層析圖中，單一物質的波峰面積佔總面 積的百分比相乘，就可估算出單一成分的回收量，之後再與CPC 製 備分離實驗後真正得到單一成分的量相除，便可計算出樣品回收率。 回收量估計值的計算： 回收量估計值 mg 樣品進樣量 mg 單一成分波峰面積 HPLC 所有層析峰的總面積 回收率的計算： 回收率 % 回收量實際值 mg 回收量估計值 mg 100%
3.3.6 CPC 製備實驗步驟 CPC 實驗儀器裝置如圖 3-4 所示[27] (1) 利用量筒量取特定體積溶劑，並置於分液漏斗內，配製成所需的 溶劑系統，然後靜置至兩相分層，分別取出上層與下層相。 (2) CPC 調至 descending 方向，用氮氣把管柱內的去離子水保存液吹 出，之後使用往復式幫浦以流速 8 mL/min 將有機靜相填滿整個管 柱。 (3) 啟動 CPC，使其轉速達到 900 rpm。 (4) 待其轉速穩定後，以流速 1 mL/min 將動相打入 CPC，此時會有 靜相從 CPC 中被推出，動相與靜相會在內部達到一個平衡，直到靜 相不再持續被推出時，紀錄被推出的靜相體積，並可以初步計算出此 溶劑系統的靜相滯留率。 (5) 當有機相不再流出，表示動靜相已達到平衡，開啟 UV-Vis 偵測 器(350 nm)，並等待訊號穩定。 (6) 注入桑葉樣品溶液 5 mL，以下層當動相來沖提，並在樣品注入 的同時紀錄層析訊號。 (7) 每 3 分鐘收集一管，即每管中含有 3 mL 的樣品液。 (8) 實驗完成後，CPC 停止轉動，用氮氣將管柱內的液體吹出並收集， 紀錄有機相和水相的體積，上層有機相的體積與總體積相除就是靜相
滯留率。 (9) 在 CPC 停止轉動的情況下，先以 300 mL 甲醇沖洗管柱，再以 300 mL 去離子水清洗，未流出之去離子水保存在 CPC 中。 圖3-4、CPC實驗儀器裝置 包含了梯度幫浦、CPC 儀器、紫外光偵測器、以及分管收集器。 3.3.5 HPLC 分析收集液實驗步驟 HPLC 實驗儀器裝置如圖 3-5 所示
(1) 使用 reversed phase HPLC 系統，先以純的 Acetonitrile 清洗管柱 15 分鐘，再用 solvent A [Tetrahydrofuran：0.1％(v/v) formic acid = 25： 75 (v/v)]當動相沖提管柱 15 分鐘。
(2) (3) solv 掉因 (4) 由 開啟UV 每支收集 vent A 溶 因為溶劑不 注入桑葉 inject 調至 包含了 V-Vis 偵測 集管先用迴 溶解樣品， 不同而產 葉樣品溶液 至 load 的 圖 了梯度幫浦 測器，偵測 迴旋減壓蒸 ，選擇用 產生的背景 液於六向閥 的同時紀錄 圖3-5、HP 浦、HPLC 測波長設定 蒸餾裝置 HPLC 沖 景干擾訊號 閥的20 μ 錄層析訊號 PLC實驗儀 C 管柱、紫 定在350 nm 置把溶劑抽 沖提的動相 號。 μL sample 號。 儀器裝置 紫外光偵測 m，並等待 抽乾，再加 相來溶解樣 loop 中， 置 測器。 待訊號穩定 加入 1 mL 樣品，可避 並將六向 定。 L 的 避免 向閥
第四章 結果與討論
4.1 以 HPLC 分析桑葉 2 號萃取出的黏稠物
我們利用 HPLC 可以在 50 分鐘內分析桑葉中的混合物，以波長 350 nm 的偵測器偵測，桑葉中 60% (v/v)乙醇萃取物的層析圖(圖 4-1) 出現許多個波鋒，由於桑葉中的成分相當複雜，所以先為這些波鋒由 a ~ i 標記上編號，其中 a、e、g、h、i 依序分別為 Chlorogenic acid、 Isoquercitrin、Astragalin、Q3MG、K3MG 這五個成分，也就是我們
要製備分離的目標物，這些成分的確認是經由收集之後偵測 ESI-MS
得知。其依序的滯留時間分別為8.2 min、17.8 min、21.1 min、26.3 min
和34.9 min。 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 50 100 150 200 250 m v min
a
b c
d
e
f g
h
i
4.2 以質譜鑑定桑葉成分的結構 藉由 HPLC 分析並收集 a、e、g、h、i 五個目標物，樣品進樣量 由原本的20 μL 換成體積較大的 100 μL，分別收集八次後，再用減壓 迴旋蒸餾把溶劑抽乾，然後進一步由ESI-MS 負電荷做結構鑑定，此 儀器是選用低解析度的模式，準確值到整數位。 4.2.1 以質譜鑑定 Chlorogenic acid 結構
Chlorogenic acid 的分子量是 354.3 Da，由 ESI-MS 負電荷分析結
果(圖 4-2)，由圖中可發現［M-H］- 為 353.1 m/z 的訊號，此為綠原
酸失去一個氫的分子訊號。191.1 m/z 的訊號，則是綠原酸斷 C-O 鍵
後，左邊氧帶負電結構的 fragment 訊號，因為測的樣品純度不是 100%
所以其它的訊號可能是雜質。由於Chlorogenic acid 標準品可購買到，
故也測了Chlorogenic acid 標準品的 ESI-MS 負電荷(圖 4-3)，並與收
集的綠原酸作比對，同樣可發現353.1 m/z 和 191.1 m/z 這兩個訊號。
因此由質譜偵測鑑定後，可初步確定peak a 即為 Chlorogenic acid 成
圖 圖4-3 7.2 mins (neg) 100 120 % 0 100 98121520 72 (0.7 1 124.7 a 100 % 0 100 99011211 20 ( 圖4-2、Chl 、Chlorog ) 140 160 180 2 727) Cn (Cen,3, 80.00, Ht); S 191.1 173.1 136.9 19 2 150 200 250 30 (1.036) Cn (Cen,3, 80.00, Ht); 191.0 192.0 lorogenic genic acid 200 220 240 260 Sm (SG, 2x0.75); Sb (3,40.00 x2 1 92.1 263 203.3 219.1 0 350 400 450 Sm (SG, 2x0.75); Sb (3,40.0 352.9 354.0 acid測ES d標準品測 280 300 320 0 ); Cm (68:79-15:57x2.000) .1 500 550 600 0 ); Cm (20-2:5x2.000) I-MS負電 測ESI-MS負 340 360 380 40 353.1 387.0 650 700 750 800 706.9 708.1 電荷質譜圖 負電荷質譜 0 420 440 460 411.0 411.9 0 850 900 950 S 圖 譜圖 m/z 480 Scan ES- 1.33e6 m/z 1000 Scan ES- 1.19e7
4.2 (圖 訊號 m/z 果 .2 以質譜 Isoquerc 圖4-4)發現 號代表［M z 的訊號 ，可初步確 e 100 % 0 100 20100305 譜鑑定 Isoq citrin 的分 現，由質譜 M-H］-，此 ，則是Iso 確定peak 圖4-4、Is 200 300 525 18 (0.633) Cn (Cen,3, 80 quercitrin 分子量是4 譜圖中可獲 此為Isoq oquercitrin k e 即為 Is soquercitr 400 500 0.00, Ht); Sm (SG, 2x0.75); Sb 463.1 421.2 464.3 499.0 n 結構 464.4 Da， 獲得兩個強 quercitrin 失 n dimer 的 soquercitr rin測ESI-M 600 700 b (3,40.00 ); Cm (18:23-3:11x2 561.1 672.6 ，藉由ESI 強度較大的 失去一個 的訊號。根 rin 成分。 MS負電荷 800 900 2.000) 927 9 I-MS 負電 的訊號，4 個氫的分子 根據質譜偵 荷質譜圖 1000 1100 7.1 928.1 929.2 1024.7 1109.6 電荷分析結 463.1 m/z 子訊號。92 偵測鑑定的 m/z Scan ES- 1.57e5 6 結果 z 的 27.1 的結
4.2 4-5 失去 即為 4.2 4-6 代表 .3 以質譜 Astraga 5)，由圖中 去一個氫的 為Astraga .4 以質譜 Q3MG 6)發現，由 表［M-H］ 29min 100 % 0 100 99011212 53 92.9 102 譜鑑定 Ast alin 的分子 中可發現 的分子訊 alin 成分 圖4-5、 譜鑑定 Que 的分子量 由質譜圖中 -，此為Q 150 200 250 3 3 (2.747) Cn (Cen,3, 80.00, H 9 .8 284. 202.9 150.9 237.0 tragalin 結 子量是448 ［M-H］ -訊號。因此 。 Astragalin ercetin 3-量是 550.4 中可獲得三 3MG 失去 300 350 400 450 t); Sm (SG, 2x0.75); Sb (3,40 446.9 .8 312.7 424.8 394.9 44 44 結構 8.4 Da，由 - 為 446.9 此由質譜偵 n測ESI-M -(6-malon Da，藉由 三個強度較 去一個氫的 0 500 550 600 0.00 ); Cm (52:58-8:50x2.000) 9 48.1 48.9 由ESI-M 9 m/z 的訊 偵測鑑定後 MS負電荷質 nylglucosi 由 ESI-M 較大的訊 的分子訊號 650 700 750 8 ) 80 MS 負電荷 訊號，此為 後，可初步 質譜圖 de)結構 S 負電荷 訊號，548.9 號。504.9 800 850 900 950 01.1 895.4 荷分析結果 為 Astrag 步確定 pea 荷分析結果 9 m/z 的訊 m/z 和 30 m/z 0 1000 Scan ES- 4.70e5 果(圖 galin ak g 果(圖 訊號 01.1
認這 548 被打 以判 訊號 號主 frag Qu 圖 這兩個訊號 8.9 m/z 作 打碎後所得 判斷504.9 號。推測 主要是 Q gment 訊號 ercetin 3-( 圖4-6、Qu 26.5 mins ( 100 % 0 100 98121518 33 108.9 114 號都是Q 作 MS-MS 得到的碎 9 m/z 和 504.9 m/ Q3MG 斷 號。根據 (6-malony uercetin 3 (neg) 150 200 250 3 (0.333) Cn (Cen,3, 80.00, H 9 169.1 151.0 4.9 203.0 265 237.0 Q3MG 的部 偵測(圖 4 碎片訊號， 301.1 m/ z 訊號是 C-O 鍵後 據質譜偵測 ylglucosid -(6-malon 0 300 350 Ht); Sm (SG, 2x0.75); Sb (3, 301.1 300.1 .1 281.0 369.0 316.8 部分結構訊 4-7)，經由 確實包含 /z 應該都是 Q3MG 失 後，上半 測鑑定的結 de)成分。 nylglucosi 400 450 50 40.00 ); Cm (32:52-3:14) 50 462.9 0 381.1 444.9 474.7 訊號，所以 由質譜圖的 含了504.9 是屬於Q 失去CO2結 半部 querc 結果，可初 de)測ESI-00 550 600 04.9 7 548.9 505.9 507.0 530.9 562.9 588.9 以針對［M 的觀察發現 m/z 和 30 3MG 成分 結構，則 cetin 氧帶 初步確定 -MS負電荷 650 700 7 739 646.8 662.8 M-H］- 訊 現，548.9 01.1 m/z， 分的fragm 301.1 m/z 帶負電結構 peak h 即 荷質譜圖 m/z 750 800 Scan ES- 1.99e5 .7 訊號 m/z ，所 ment z 訊 構的 即為
圖 4.2 4-8 代表 m/z 這兩 號 發現 和 488 圖4-7、Qu 測M .5 以質譜 K3MG 8)發現，由 表［M-H］ z 則可能是 兩個訊號都 532.9 m/z 現，532.9 285.0 m/z 8.9 m/z 和 ercetin 3-( MS-MS質 譜鑑定 Kae 的分子量 由質譜圖中 -，此為K 是 K3MG 都是屬於 z 和 488.9 9 m/z 被打 z；而 488. 和 285.0 m (6-malony 質譜圖 empferol 量是 534.0 中可獲得三 K3MG 失去 G 成分的兩 於K3MG 的 9 m/z 作 M 打碎後所得 .9 m/z 的碎 m/z 應該都 ylglucosid 3-(6-malo Da，藉由 三個強度較 去一個氫的 兩個 fragm 的部分結構 MS-MS 偵 得到的碎片 碎片訊號則 都是屬於K de)成分中 onylgluco 由 ESI-M 較大的訊 的分子訊號 ment 訊號 構訊號，所 偵測(圖 4-9 片訊號，確 則包含了 K3MG 成 中碎片訊號 oside)結構 S 負電荷 訊號，532.9 號。488.9 號。為了更 所以針對 9)，經由質 確實包含 了285.0 m/ 成分的frag 號548.9 m/z 構 荷分析結果 9 m/z 的訊 m/z 和 28 更進一步證 ［M-H］ 質譜圖的觀 含了488.9 /z，所以判 gment 訊號 z 果(圖 訊號 85.0 證實 - 訊 觀察 m/z 判斷 號。
是 訊號 3-(6 圖 K3MG 斷 號。因此由 6-malonyl 圖4-8、Kae 35 mins (neg 100 150 % 0 100 98121519 86 (0 102.8 2 104.9 斷 C-O 鍵後 由質譜偵 lglucoside empferol 3 ) 200 250 300 3 0.868) Cn (Cen,3, 80.00, Ht); 285.0 284.0 233.0 203.0 237.2 286.1 35 287.0 後，上半部 偵測鑑定後 e)成分。 3-(6-malo 50 400 450 500 Sm (SG, 2x0.75); Sb (3,40.0 488.9 447.0 55.1 437.1 53 部 kaemp 後，可初步 onylglucos 550 600 650 70 00 ); Cm (84:99-8:62) 32.9 533.8 566.8 ferol 氧帶 步確定 pea side)測ES 00 750 800 850 帶負電結構 ak i 即為 I-MS負電 900 950 1000 105 10 構的 fragm 為 Kaempf 電荷質譜圖 m/z 50 Scan ES- 4.06e5 067.1 ment ferol 圖
(A) (B) 圖4-9、Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)成分中碎片訊號測 MS-MS質譜圖 (A) 532.9 m/z fragment 訊號的 MS-MS 質譜圖。 (B) 488.9 m/z fragment 訊號的 MS-MS 質譜圖。
4.3 以 HPLC 分析初步批式萃取後的桑葉樣品 4.3.1 批式萃取後的 sample 1 桑葉中的成分相當的複雜，因為雜質物過多，所以若要直接從如 此多物質當中，針對目標物找出合適的 CPC 溶劑系統，使其具有較 佳的分配係數值，其實相當不容易。藉由EA 的初步批式萃取，把低 極性的目標物萃取至有機相，進而把欲分離的樣品簡單化，因此可以 比較容易找到適合的 CPC 的溶劑系統和分配係數值。由層析圖(圖 4-10)發現，經由 EA 的初步批式萃取後，e、g 這兩個目標物會被萃 取到有機相當中，分別是Isoquercitrin 和 Astragalin。 圖4-10、HPLC分析sample 1的層析圖 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 50 100 150 200 g mA U min e
4.3.2 批式萃取後的 sample 2 藉由EA 加 5 mL 的甲酸做批式萃取，主要是想萃取到含有-COOH 官能基的目標物，藉由加酸可以防止-COOH 官能基解離，而使化合 物的極性降低，所以可以使含有-COOH 官能基的成分從水相被萃取 到有機相中，由層析圖(圖 4-11)發現，經由 EA 加 5 mL 的甲酸做批 式萃取後，a、h、i 這三個目標物會被萃取到有機相當中，分別是 Chlorogenic acid 、 Quercetin 3-(6-malonylglucoside) 和 Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)。 圖4-11、HPLC分析sample 2的層析圖 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 200 400 600 800 1000 i h mAU min a
4.4 以 HPLC 分析標準品
根 據 文 獻 [3] 提 到 ， 桑 葉 中 存 在 Chlorogenic acid 、 Rutin 、 Isoquercitrin、Astragalin、Quercetin 3-(6-malonylglucoside)、Kaempferol 3-(6-malonylglucoside) 這 幾 種 主 要 的 抗 氧 化 物 ， 但 實 際 上 只 有 Chlorogenic acid 和 Rutin 這兩種化合物可以購買的到標準品，所以我
們進一步用HPLC 來分析這兩種成分的標準品，並與桑葉萃取的黏稠 物 層 析 圖 相 互 比 對 ， 可 以 初 步 確 認 Chlorogenic acid( 圖 4-12)和 Rutin(圖 4-13)分別存在的波鋒位置。 圖4-12、HPLC分析桑葉2號萃取物和Chlorogenic acid標準品層析圖 上圖：桑葉2 號的乙醇萃取物之層析圖。 下圖：Chlorogenic acid 標準品之層析圖。 0 5 10 15 20 25 30 35 0 100 200 300 400 500 a Chlorogenic acid mA U min 0 5 10 15 20 25 30 35 0 50 100 150 200 250 a Mulberry NO.2
圖4-13、HPLC分析桑葉萃取物和Rutin標準品的層析圖 上圖：桑葉2 號的乙醇萃取物之層析圖。 下圖：Rutin 標準品之層析圖。 4.5 以離心分配層析儀分離桑葉成分的實驗結果 先前提到我們一開始使用 EA/BuOH/H2O 三項溶劑系統，經過多 組不同比例(表 4-1)測試發現，桑葉中五種目標物都傾向分佈在有機 相，表示樣品的分配係數值不理想，所以EA/BuOH/H2O 組成的溶劑 系統不適合應用在CPC 分離 Chlorogenic acid、Isoquercitrin、Astragalin、
Quercetin 3-(6-malonylglucoside)、Kaempferol 3-(6-malonylglucoside) 這五個成分。 0 5 10 15 20 25 30 35 0 400 800 1200 C min Rutin 0 5 10 15 20 25 30 35 0 40 80 120 160 mAU Mulberry NO.2 C
劑系統，測試多組不同比例(表 4-2；4-3)，並得到兩組最佳化的溶劑 系統，分別應用在CPC 分離 sample 1 和 sample 2。桑葉中五種目標 物在兩相中不僅都有理想的分佈(KD在0.2 ~ 5 之間 )，且任意兩個成 分的 KD值相除，會得到較大的選擇因子(selectivity factor, α)[37]， 選擇因子越大表示不同的成分越容易被分開。 (1) CPC 分離 Sample1 的最佳化溶劑系統比例，(MTBE/Acetone/H2O = 6：4：10) (2) CPC 分離 Sample2 的最佳化溶劑系統比例，(MTBE/Acetone/H2O = 6：4：10)額外加入溶劑系統總體積 0.6% (v/v)的 formic acid 表4-1、EA/BuOH/H2O三項溶劑系統，測試在不同組成比例中，桑葉 中五種目標物的分配係數值(KD) 4：6：10 6：4：10 9：1：10 Chlorogenic acid 13.53 7.43 1.83 Isoquercitrin 11.05 6.75 2.95 Astragalin 12.73 5.32 3.86 Quercetin 3-(6-malonylglucoside) 28.17 10.41 6.21 Kaempferol 3-(6-malonylglucoside) 31.87 10.37 9.46 EA/BuOH/H2O
表4-2、MTBE/Acetone/H2O三項溶劑系統，測試在不同組成比例中， Isoquercitrin、Astragalin的分配係數值(KD) 4：6：10 6：4：10 8：2：10 Isoquercitrin 0.22 0.23 0.52 Astragalin 0.32 0.45 0.65 表4-3、MTBE/Acetone/H2O三項溶劑系統加甲酸，測試在不同組成比
例中，Chlorogenic acid、Quercetin 3-(6-malonylglucoside)、Kaempferol
3-(6-malonylglucoside)的分配係數值(KD) 6：4：10 加0.2% (v/v) formic acid 6：4：10 加0.6% (v/v) formic acid 6：4：10 加1.0% (v/v) formic acid Chlorogenic acid 0.38 0.23 0.68 Quercetin 3-(6-malonylglucoside) 0.56 0.54 0.80 Kaempferol 3-(6-malonylglucoside) 1.34 1.13 1.37 MTBE/Acetone/H2O MTBE/Acetone/H2O 加 formic acid
4.5.1 sample 1 分離結果
sample 1 中主要包含 Isoquercitrin 和 Astragalin 兩個成分，我們已
找出分離sample 1 的 CPC 最佳化條件(表 4-4)，選用 MTBE / Acetone
/ H2O 這組溶劑系統的原因，主要是因為溶劑極性所適合分離的樣品 範圍，包含目標物的成分，溶劑組成的體積比(MTBE / Acetone / H2O =6：4：10)是經由多次嘗試後，發現此組比例，目標物可以得到最佳 的分配係數值(表 4-5)。由表中可知 KD值都小於 1，表示樣品傾向分 佈在下層相，故最後選擇以descending mode 作為實驗條件。管柱總 體積220 mL，靜相滯留量大約 187 mL，表示靜相滯留率可高達 85%。 表4-4、CPC分離sample 1的實驗參數 溶劑系統 (MTBE / Acetone / H2O =6：4：10) 流動模式 Descending mode (下層相當動相) 樣品進樣量 5 mL (75 mg 溶於 6 mL 的動相) 轉速 900 rpm 流速 1.0 mL/min 偵測波長 350 nm
表4-5 、 Isoquercitrin 和 Astragalin 兩 種 成 分 在 溶 劑 系 統 (MTBE / Acetone / H2O = 6：4：10)的分配係數值 Isoquercitrin Astragalin 分配係數(KD) 0.23 0.45 經由上述實驗參數進行CPC 分離 sample 1，所得到的結果(圖 4-14) 可明顯觀察出存在 I、II、III 三個波峰，使用分管收集器收集這三個 波峰，先將分管收集器設定在第 45 分鐘前的沖提溶液不作收集，之 後設定每3 分鐘收集一管，波峰 I 收集 51-69 min(3-8 管)；波峰 II 收
集75-99 min(11-18 管)；波峰 III 收集 114-141 min(24-32 管)，然後進
一步做HPLC 分析。由 HPLC 層析圖(圖 4-15)可得知，波峰 I 所含蓋
的都是屬於極性較大的化合物，分配係數值較小，所以最先被沖提出
管柱外；波峰II 主要是 Isoquercitrin 成分，且純度是 94.0%；波峰 III
則以Astragalin 成分為主，純度有 97.0%。經由 CPC 製備分離的兩個
成分，純度都可到達 90%以上，比起一般的 silica gel chromatography
圖4-14、CPC分離sample 1的層析圖 波峰I 收集 51-69 min(3-8 管)；波峰 II 收集 75-99 min(11-18 管)；波 峰III 收集 114-141 min(24-32 管)。 圖4-15、HPLC分析波峰II和波峰III的層析圖 上圖：波峰 II 主要包含 e (Isoquercitrin)成分。 下圖：波峰 III 主要包含 g (Astragalin)成分。 0 50 100 150 200 250 0 200 400 600 800 1000 mAU min 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 20 40 60 mAU min 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 40 80 120 160 e g I II III
4.5.2 sample 2 分離結果
sample 2 中 主 要 包 含 Chlorogenic acid 、 Quercetin 3-(6-malonylglucoside)和 Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)三個成分，
已找出分離sample 2 的 CPC 最佳化條件(表 4-6)，溶劑系統(MTBE /
Acetone / H2O = 6：4：10)加 0.6% (v/v)formic acid 的組成比例，使得
這三個目標物可以得到最佳的分配係數值(表 4-7)。靜相滯留量大約 185 mL，表示靜相滯留率也可高達 85%。 表4-6、CPC分離sample 2的實驗參數 溶劑系統 (MTBE / Acetone / H2O = 6：4：10) 加0.6% (v/v) formic acid 流動模式 Descending mode (下層相當動相) 樣品進樣量 5 mL (73 mg 溶於 6 mL 的動相) 轉速 900 rpm 流速 1.0 mL/min 偵測波長 350 nm
表 4-7 、 Chlorogenic acid 、 Quercetin 3-(6-malonylglucoside) 和
Kaempferol 3-(6-malonylglucoside) 三 種 成 分 在 溶 劑 系 統 (MTBE /
Acetone / H2O = 6：4：10) 加0.6% (v/v) formic acid的分配係數值
Chlorogenic acid Quercetin 3-(6-malonylglucoside) Kaempferol 3-(6-malonylglucoside) 分配係 數(KD) 0.23 0.54 1.13 經由上述實驗參數進行CPC 分離 sample 2，所得到的結果(圖 4-16) 可明顯觀察出存在 A、B、C、D 四個波峰，同樣使用分管收集器收 集這四個波峰，先將分管收集器設定在第 45 分鐘前的沖提溶液不作 收集，之後設定每3 分鐘收集一管，波峰 A 收集 51-66 min(3-7 管)； 波峰B 收集 72-90 min(10-15 管)；波峰 C 收集 105-129 min(21-28 管) ； 波峰 D 收集 180-252 min(46-69 管)，然後進一步做 HPLC 分析。由 HPLC 層析圖(圖 4-17)可得知，波峰 A 所含蓋的都是屬於極性較大的 化合物，所以最容易被沖提出管柱外，其中包含了 Rutin 這個成分， 由於 Rutin 存在的量很少，所以並沒有額外分離出 Rutin 化合物；波 峰B 主要是 Chlorogenic acid 成分，且純度可達到 98.0%；波峰 C 則 以Quercetin 3-(6-malonylglucoside)成分為主，純度有 93.5%；波峰 D
則是Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)成分，純度有 92.5%。經由 CPC 製備分離的三個成分，純度也都可到達 90%以上，因此樣品確實具有 被純化的效果。 圖4-16、CPC分離sample 2的層析圖 波峰A 收集 51-66 min(3-7 管)；波峰 B 收集 72-90 min(10-15 管)；波 峰C 收集 105-129 min(21-28 管)；波峰 D 收集 180-252 min(46-69 管)。 (A) 0 50 100 150 200 250 300 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 D C B mA U min A 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 200 400 600 800 1000 1200 mA U a
(B)
(C)
圖4-17、HPLC分析波峰B、波峰C和波峰D的層析圖 (A) 波峰 B 主要包含 a (Chlorogenic acid)成分。
(B) 波峰 C 主要包含 h [Quercetin 3-(6-malonylglucoside)]成分。 (C) 波峰 D 主要包含 i [Kaempferol 3-(6-malonylglucoside)]成分。 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 50 100 150 200 a g mA U min h 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 20 40 60 80 100 g mAU min i
4.6 以 NMR 鑑定桑葉成分的結構 為了增加個別成分的量，以達到測 NMR 所需的量，將 150 mg 樣品分別溶在6 mL 動相中，進樣於 5 mL sample loop，經由 CPC 製 備分離並收集a、e、g、h、i 五個目標物，分別收集五次後，再用減 壓迴旋蒸餾把溶劑抽乾，然後由1H 和13C NMR 做結構鑑定。雖然先 前已由偵測質譜結果可初步確認這五個成分，藉由進一步偵測 NMR 來更加證實這五個目標物的結構。在 NMR 實驗中，選擇 DMSO-d6 當作溶解樣品的溶劑，偵測後的結果分別可得到 Chlorogenic acid、
Isoquercitrin 、 Astragalin 、 Quercetin 3-(6-malonylglucoside) 和
Kaempferol 3-(6-malonylglucoside) 1H 和13C NMR 圖譜，進一步與參
考文獻[3；39；40]做比對，並在圖譜標記上個別結構訊號出現的位
置，由結果發現，不論是 1H 或13C NMR 圖譜，文獻中提及的訊號，
4.6.1 以 NMR 鑑定 Chlorogenic acid 結構[39] Chlorogenic acid 的結構標記分為兩個部份，由偵測 NMR 結果發 現(圖 4-18；4-19)，文獻上所提到的訊號在綠原酸的 1H 和13C NMR 圖譜中都可被觀察到，但因為樣品的純度不是 100%，所以其它的訊 號可能是雜質所造成。其中綠原酸-OH 官能基上氫的訊號在文獻中和 本實驗之NMR 結果中都未偵測到，在之後探討中會加以解釋。在 1H NMR 圖譜中，3 ~ 4 ppm 存在一個較強訊號，是 DMSO-d6溶劑訊號； 而 13C NMR 溶劑訊號則出現在 40 ppm 左右的位置。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)：δ 7.42 (1H, d, J = 16 Hz, H-7 caffeoyl), 7.03 (1H, d, J
= 2 Hz, H-2 caffeoyl), 6.98 (1H, dd, J = 2 and 8 Hz, H-6 caffeoyl), 6.77 (1H, d, J = 8 Hz, H-5 caffeoyl), 6.15 (1H, d, J = 16 Hz, H-8 caffeoyl), 5.08 (1H, br d, J = 5 Hz, H-3' quinic), 3.94 (1H, br s, H-5' quinic), 3.55 (1H, br d, J = 4 Hz, H-4' quinic), 1.7-2.1 (2H, m, H-6' quinic), 1.98 (2H, br d, J = 5 Hz, H-2' quinic)；13C NMR (500 MHz, DMSO-d6)：δ 174.9
(C-7' quinic), 165.7 (C-9 caffeoyl), 148.3 (C-4 caffeoyl), 145.5 (C-3 caffeoyl), 144.8 (C-7 caffeoyl), 125.6 (C-1 caffeoyl), 121.2 (C-6 caffeoyl), 115.7 (C-5 caffeoyl), 114.7 (C-2 caffeoyl), 114.3 (C-8 caffeoyl), 73.6 (C-1' quinic), 70.9 (C-3' quinic), 70.6 (C-4' quinic), 68.3 (C-5' quinic), 37.2 (C-6' quinic), 36.5 (C-2' quinic).
圖4-18、Chlorogenic acid的500 MHz 1H NMR圖譜
4.6.2 以 NMR 鑑定 Isoquercitrin 結構[40] Isoquercitrin 的結構標記分為三個部份，根據偵測 NMR 結果發現 (圖 4-20；4-21)，文獻上所提到的訊號在 Isoquercitrin 的 1H 和 13C NMR 圖譜中都可被觀察到，但因為樣品的純度不是 100%，所以其它 的訊號可能是雜質所造成。其中Isoquercitrin -OH 官能基上氫的訊號 在文獻中和本實驗之NMR 結果中都未偵測到，只有 5 號位置-OH 官 能基上氫的訊號會顯示出在12.65 ppm 處，在之後探討中會加以解釋。 同樣在1H NMR 圖譜中，3 ~ 4 ppm 存在一個較強訊號，是 DMSO-d6 溶劑訊號；而 13C NMR 溶劑訊號則出現在 40 ppm 左右的位置。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz)：δ 12.65 (1H, s, 5-OH), 7.69–7.57 (2H, m, H-2', 6'), 6.85 (1H, d, J = 9.2 Hz, H-5'), 6.40 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-6), 5.48 (1H, d, J = 6.8 Hz, H-1'')；13C NMR (DMSO-d6, 500 MHz)：δ 156.7 (C-2), 133.9 (C-3), 177.9 (C-4), 161.7 (C-5), 99.1 (C-6), 164.6 (C-7), 94.0 (C-8), 156.8 (C-9), 104.5 (C-10), 121.1 (C-1'), 115.7 (C-2'), 145.3 (C-3'), 148.9 (C-4'), 116.7 (C-5'), 121.7 (C-6'), 101.4 (C-1''), 74.6 (C-2''), 77.0 (C-3''), 70.5 (C-4''), 78.0 (C-5''), 61.5 (C-6'').
圖4-20、Isoquercitrin的500 MHz 1H NMR圖譜
4.6.3 以 NMR 鑑定 Astragalin 結構[40] Astragalin 的結構標記分為三個部份，根據偵測 NMR 結果發現(圖 4-22；4-23)，文獻上所提到的訊號在 Astragalin 的1H 和13C NMR 圖 譜中都可被偵測到，但因為樣品的純度不是 100%，所以其它的訊號 可能是雜質所造成。其中 Astragalin -OH 官能基上氫的訊號在文獻中 和本實驗之NMR 結果中都未偵測到，只有 5 號位置-OH 官能基上氫 的訊號會顯示出在 12.62 ppm 處，在之後探討中會加以說明。在 1H NMR 圖譜中，3 ~ 4 ppm 存在一個較強訊號，是 DMSO-d6溶劑訊號； 而 13C NMR 溶劑訊號則出現在 40 ppm 左右的位置。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz)：δ 12.62 (1H, s, 5-OH), 8.05 (2H,d, J = 8.8 Hz, H-2', 6'), 6.90 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3', 5'), 6.44 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-8), 6.21 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-6), 5.47 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1'')；13C NMR (DMSO-d6, 500 MHz)：δ 156.9 (C-2), 133.7 (C-3), 178.0 (C-4), 161.7 (C-5), 99.2 (C-6), 164.6 (C-7), 94.1 (C-8), 156.8 (C-9), 104.5 (C-10), 121.4 (C-1'), 131.4 (C-2', 6'), 115.6 (C-3', 5'), 160.4 (C-4'), 101.4 (C-1''), 74.7 (C-2''), 76.9 (C-3''), 70.4 (C-4''), 78.0 (C-5''), 61.4 (C-6'').
圖4-22、Astragalin的500 MHz 1H NMR圖譜
4.6.4 以 NMR 鑑定 Quercetin 3-(6-malonylglucoside)結構[39] Q3MG 的結構較複雜所以標記分為四個部份，根據偵測 NMR 結 果發現(圖 4-24；4-25)，文獻上所提到的訊號在 Q3MG 的 1H 和13C NMR 圖譜中都可被偵測到，因為樣品的純度不是 100%，所以其它的 訊號可能是雜質所造成。但在 13C NMR 圖譜中觀察到，雜訊的訊號 有些似乎特別強，與Chlorogenic acid 13C NMR 結果做比對後，發現 Q3MG 13C NMR 圖譜存在的兩個雜訊訊號 174.9 ppm 和 70.6 ppm，同 樣也存在於Chlorogenic acid 13C NMR 圖譜中，根據比對後判斷，174.9 ppm 和 70.6 ppm 則是屬於 Chlorogenic acid 的結構訊號。會造成此現 象的發生，主要是因為偵測 NMR 的樣品量需要很多，在 CPC 製備 分離後，分管收集Q3MG 的過程中，由於 Q3MG 的 peak 和 Chlorogenic
acid 的 peak 相鄰，所以大量收集時會同時收集到部份的 Chlorogenic
acid 成分，才會造成 Q3MG 13C NMR 圖譜中出現 Chlorogenic acid 的
結構訊號。也發現 Q3MG -OH 官能基上氫的訊號在文獻中和本實驗 之NMR 結果中都未偵測到，在之後探討中會加以解釋。在 1H NMR 圖譜中，3 ~ 4 ppm 存在一個較強訊號，是 DMSO-d6溶劑訊號；而 13C NMR 溶劑訊號則出現在 40 ppm 左右的位置。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz)：δ 7.52 (1H, d, J = 2 Hz, H-2'), 7.49 (1H, dd, J = 2 and 9Hz, H-6'), 6.84 (1H, d, J = 9 Hz, H-5'), 6.40 (1H, d, J = 2 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J =
2 H H-6 13C 166 148 (C-76. mal 圖 Hz, H-6), 5 6A''), 4.03 C NMR (5 6.5 (CO m 8.4 (C-4'), -5'), 115.1 1 (C-3''), lonyl). 圖4-24、Qu 5.39 (1H, (1H, dd, J 500 MHz, malonyl), , 144.7 (C 1 (C-2'), 1 73.9 (C-2 uercetin 3 d, J = 8 H J = 11 and DMSO-d 164.1 (C C-3'), 133. 03.9 (C-1 2'' and C--(6-malon Hz, H-1''), d 5 Hz, H d6)：δ 177 C-7), 161. 1 (C-3), 1 10), 101.0 -5''), 69.5 nylglucosi 4.21 (1H, -6B''), 3.10 7.3 (C-4), .2 (C-5), 121.5 (C-1 0 (C-1''), 9 (C-4''), 6 ide)的500 dd, J = 1 0 (2H, s, C , 167.7 (C 156.3 (C 1'), 121.0 98.7 (C-6) 63.6 (C-6' MHz 1H N 1 and 1.5 CH2 malon CO malon C-2 and C (C-6'), 11 ), 93.5 (C '), 41.0 (C NMR圖譜 Hz, nyl)； nyl), C-9), 16.1 C-8), CH2 譜
