逆流層析的儀器系統

為了能發展逆流層析成為實用的層析儀器，陸續開發出具有穿流 (flow-through)性質、不同管柱結構和不同力場的儀器。因此，逆流層 析的儀器系統依分離的管柱本身的轉動方式可區分為兩種：流體靜態 平衡系統和流體動態平衡系統。

(1) 流體靜態平衡系統(Hydrostatic Equilibrium System，HSES)

在 HSES 系統中，管柱每一個部份所受力大小固定。靜相因重力 場滯留在管柱中，樣品隨著動相穿越靜相，並藉著樣品在動靜相的分 配係數不同而達到分離。圖 2-3 為 HSES 示意圖。圖 2-3(A)，所使用 的動、靜相事先平衡過，選擇靜相為下層相，先使其充滿管柱後將動 相(上層相)由一端緩緩的注入，靜相會被動相推出直到兩相的界面到 達螺管底部，此時由於重力場的作用，動相開始往上穿越靜相直到螺 管頂端，如此一直重複直到分離管柱的末端，其每一圈的螺管都會保 留住一半的靜相。圖2-3(B)和 2-3(A)相反，使用平衡過的上層相當作 靜相，而下層相為動相，因此動靜相在螺管中會產生不同的平衡狀 態。

(2)

因為受力不均，而在管柱中有不同的分佈，圖 2-4 說明在重力場作用 下，阿基米德扭力對旋轉中螺管的影響、圖 2-4(a)先將螺旋管中注滿 水，再導入氣泡或玻璃珠，封住螺管兩端，接著將螺管緩慢旋轉，由 於阿基米德扭力的作用，將使氣泡與玻璃珠帶往螺管的左端，此表示 不管比水輕或比水重的物質皆會向螺管的某一端移動，此端稱為螺管 的頭端(head)，而另一端則稱為尾端(tail)。圖 2-4(b)中，利用平衡過 的溶劑系統進行相同的實驗，圖2-4(b)上圖是先將螺管注滿較輕的一 相，也就是溶劑系統的上層相，而較重的一相則由尾端打入，此時較 重的一項行為就像是水中的玻璃珠會往頭端移動，圖2-4(b)下圖則先 將較重的一相注滿螺管，由尾端打入較輕的一相，其行為就像是水中 的氣泡。圖2-4(c)，先將螺管內填入等體積的輕重兩相，兩相會在螺 管的每一圈形成分離，當螺管開始轉動，任一相多餘的量則會被推至 螺管尾端。因此，當螺管達到動力學平衡，則兩相在螺管中的分佈將 保持不變，使靜相維持程度的滯留。

(a)

節省昂貴的材料和溶劑的消耗。逆流層析在不需更換不同極性的層析 管柱情況下，藉由提高極性溶劑或非極性溶劑比例的方法，可以實現 流動相從弱極性到強極性或相反的轉化。由於層析管柱容積大，無填 料，管柱內的空間全部都是有效空間，因此樣品的負載能力強，製備 分離量大，再現性好。

2.3 離心分配層析(centrifugal partition chromatography, CPC)

2.3.1 原理[25]

離心分配層析屬於流體靜力平衡系統，其儀器設計原理如圖 2-5 所示，層析管柱由一系列刻在圓盤或圓筒內的導管相聯的柱體組成，

依管徑大小的不同管柱又可分為兩種，管徑小的稱duct，主要是動相

流動的通道，管徑大的稱 channel，滯留靜相的管柱部分，透過單軸 旋轉產生恆定的重力場，靜相被滯留在管柱中。管柱中兩個旋轉密封 的接口分別連接流動相的進口和出口，動相是以液滴的形式在靜相中 傳遞，樣品成分會在液滴的表面進行分佈，因為不同的物質有不同的 分配係數，因此經由自動化且連續式的萃取，就可以把樣品成分分 離。

(A)

(B)

(A) (B) (C)

(C)

) CPC 外部 ) CPC 內部 ) CPC 管柱

圖 部構造與蝕 部結構，由 柱中運作原

圖2-5、CP 蝕刻在圓 由一系列圓 原理，動相

PC儀器示 圓盤上的層 圓盤組成 相是以液

示意圖[26]

層析管柱。

成。

液滴的形式式在靜相中中傳遞。

2.3

2.3.3 溶劑系統的選擇[28；29]

大部分的溶劑系統含水，加上其他有機溶劑，相互達到飽和而成 為不互溶的兩相，分別為動相和靜相。其溶劑的成分組合視其實驗的 分離條件而決定。在離心分配層析當中，溶劑系統的選擇有幾點必須 注意：(1) 樣品有充分的溶解度 (2) 樣品不會被分解和去活性 (3) 適 當的分配係數 (4) 良好的靜相滯留量。

2.3.4 影響靜相滯留量的因素

在離心分配層析中，液體靜相在管柱中滯留的多寡影響了分離的 效率，在較高的靜相滯留量下可提高對樣品的承載量和分離的解析度。

影響靜相滯留量及分離的效率的因素分為下列幾點[30]

(a) 溶劑系統：在選擇適當的溶劑系統時必須考慮溶劑極性、對溶質 的選擇性以及溶質在不同溶劑中的溶解度。一般而言，分析物在 兩相溶極間最佳的分配係數 KD需在 0.2 ~ 5 之間，才能獲得較佳的

分離效果。但在二元的溶劑系統中，KD值要落在此範圍不容易，

因此，常藉由加入第三種甚至第四種可溶於原先兩者的溶劑，用

來調和原先溶劑在極性或是界面張力的差異。然後依 KD來判斷分

離結果，並決定動靜相。

(b) 儀器轉速：在較大的轉速下，使靜相越容易滯留在管柱中，且因

層，這兩個結果均可提供較高的靜相滯留量，在有關於離心分配 層析分離效果的研究中，若可以得到靜相滯留量越大，解析度也

較佳，所以在CPC 機械結構可以承受的轉速之下，轉動速度越快，

分離效果越好。

(c) 動相流速：當動相流速越快時，越容易將靜相推出管柱，因此靜 相的滯留量會比較少，分離效果較差。反之動相流速若較慢，會 達到較佳的靜相滯留量，且可提高分離解析度，但相對地分離時 間會變長。

2.3.5 離心分配層析儀的應用

以往 CPC 主要應用在天然物製備分離，曾經有學者研究葡萄籽 與 葡 萄 藤 蔓 中 的 成 分 [31] ， 並 大 量 分 離 出 葡 萄 藤 蔓 中 的 trans-resveratrol，此成分具有降低血小板凝集效果，相當於活血作用，

所以也可以防止血栓，甚至中風等疾病。近年來有學者將CPC 與 chiral selectors 結合，應用在分離鏡像異構物的分子[32]，根據研究結果指 出，CPC 也可成功製備分離鏡像異構物。

3.1

(3) 溶劑

Acetonitrile (ACN), HPLC grade, 99.9%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA) Deionized water, purified from Milli-Q plus, (Bedford, MA, USA)

Methyl t-Butyl Ether (MTBE), HPLC grade, 99.8%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA)

Ethanol, 99.5%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA)

Acetone, HPLC grade, 99.9%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA) Formic acid, 98% up, (ACROS, Geel, Belgium, USA)

Ethyl Acetate (EA), HPLC grade, 99.8%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA) n-Butanol (BuOH), ACS grade, 99.9%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA)

3.2 實驗儀器

(1) 離心分配層析儀

CPC 是由 Sanki (Tokyo, Japan)所生產，型號是 CPC 240，內部主 體由 12 個 disks 所構成，包含 3136 個 channels，最高可耐壓為 6.2×

10⁶ N/m² (900 psi)，管柱總容積大約 220 毫升，此儀器的轉速可以控 制在0 ~ 2000 rpm。藉由轉動外部控制閥，就可輕易選擇 ascending mode 或 descending mode 的操作模式。

(2) 往覆式幫浦

此幫浦為Series II Digital HPLC pump ，流速可由 0.01 mL/min ~ 9.99 mL/min，購買自 Pharma-Tech Research Company (Baltimore, MD, USA)。

(3) 梯度沖提幫浦

梯度控制器LabGrad 是由 Lab Alliance (Apple Valley, MN, USA) 公司製造，並結合了Series III pump，流速設定可由 0.01 mL/min ~ 10.00 mL/min，最多可做四種動相組成的混合梯度。

(4) 高效能液相層析管柱

由Polymer Laboratories 製造的 PLRP-S column (250 mm × 4.6 mm, 15 μm)，屬於 reverse phase column，用於桑葉成分的分析。

(5) 紫外光-可見光偵測器(UV-Visible Detector)

型 號 為 Bio-Rad Model 1801 UV-Visible detector (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)，偵測器外部與個人電腦連接，利用色層分析儀 數據處理系統(訊華公司，台北市)擇取實驗訊號。

(6) 紫外光-可見光譜儀(UV-Visible Spectrophotometer) Hewlett Packard 8453, (Waldronn, Germany)。

(7) 離心機

型號為EBA20 (Hettich, Germany)，最大轉速 6000 rpm，最大離 心力為 3421 g。

(8) 迴旋減壓蒸餾器

廠牌為 Buchi (Switzerland)，型號是 R-114。

(9) 分管收集器

廠牌為Advantec (Tokyo, Japan)，型號是 CHF1215A。

(10) ESI-MS

廠牌為 Micromass (Manchester, England)，型號是 Quattro Micro，

主要使用分子量小於2000 電灑游離法質譜。

(11) NMR 500

此儀器廠牌為美國Varian (Lexington, MA, USA)，型號是 Unity Inova -500。重要規格具有(a)超導體磁鐵、電子控制系統、工作站電 腦(b)雙射頻配合 Z 的脈衝磁場梯度(c)變溫裝置(d)探頭分為 5 mm

SWPFG 正向探頭、5 mm IDPFG 反向探頭、Nano probe 超微量膠態 用。

3.3 實驗流程

3.3.1 桑葉的前處理流程

桑葉前處理的流程如圖3-2 所示

在進入 HPLC 分析前，桑葉樣品必須做前處理的步驟，據由文獻 [35]的研究，作者秤 2.0 g 的乾燥桑葉粉末，嘗試利用 20 mL 不同濃 度的乙醇水溶液(0％、20％、40％、60％、80％、100％，v/v)做兩次 萃取，然後再進行 HPLC 的分離，結果可發現桑葉經由 60％乙醇水 溶液萃取後，所得到的 Flavonol compounds 含量最多，由於我們的研 究目的是想分離出桑葉中的Chlorogenic acid、Isoquercitrin、Astragalin、

Q3MG、K3MG 五種成分如圖 2-1 所示，大部分是屬於 Flavonol compounds，故在桑葉樣品的前處理步驟中，則選用 60％乙醇水溶液 做萃取。

(1) 先用天平秤 20.0 g 的乾燥台灣桑葉 2 號，然後使用 500 mL 的 60%

(v/v)乙醇做萃取，在 40 °C 的水浴中利用磁石攪拌萃取 2 小時，之後 使用抽器過濾來除去殘渣的部分，並保留濾液的部分，再使用迴旋減 壓蒸餾器把溶劑抽乾。由於桑葉中的成分相當複雜，希望藉由初步的

批式萃取除去極性較大的化合物，使分離的目標物單純化。

(2) 把溶劑抽乾後的黏稠物，先溶於 100 mL 的去離子水中，使用 300 mL 的 EA 做批式萃取(圖 3-3)，首先加入 100 mL EA，劇烈搖晃後，

靜置 30 分鐘使兩相達到平衡，之後將下層相轉移至另一個分液漏斗

中，再加入新鮮的100 mL EA 於下層相中，同樣劇烈搖晃後，靜置 30 分鐘使兩相達到平衡，再作一次下層相的轉移，最後加入一次新 的100 mL EA，待至平衡，上述總共做了三次批式萃取，故會得到大 約300 mL 的 EA 相和 100 mL 的水相。保留三次 EA 有機相的部分，

並使用迴旋減壓蒸餾器把溶劑抽乾，當作sample 1。

(3) 經由三次 100 mL 的 EA 做批式萃取後的下層水相，再使用每次 100 mL 的 EA 加 0.5 mL 的甲酸做兩次的批式萃取，總共使用 200 mL

的 EA，保留兩次 EA 有機相的部分，並使用迴旋減壓蒸餾器把溶劑

抽乾，當作 sample 2。加入甲酸的目的是希望萃取到含有-COOH 官 能基的目標物，因為酸可以防止-COOH 官能基解離，而降低化合物 的極性，所以可以使得含有-COOH 官能基的成分從水相被萃取到有 機相中。

Samp

圖 ple 1

圖3-2、桑 Samp

桑葉前處理 ple 2

理的流程

先將

3.3.2 偵測桑葉成分在分配系統中的分佈

在實驗過程中，將所配製的 20 mL 有機-水相系統，加入 10 mg

的桑葉樣品，劇烈的搖晃待至平衡後，上、下層相各取4 毫升，然後

用迴旋減壓蒸餾器把溶劑抽乾，再分別加入1 毫升的 HPLC 動相，之

後進樣HPLC 做分析，可得到上、下層相的層析圖，同一個成分在兩

相的濃度比值，也就是層析峰面積積分比值，可得到桑葉各個成分在 兩相中的分佈(KD)。

Cu ： concentration of solute in the upper phase Cl ： concentration of solute in the lower phase

3.3.3 配製不同的溶劑系統

一開始曾嘗試使用 EA/BuOH/H2O 三項溶劑系統(ternary solvent

一開始曾嘗試使用 EA/BuOH/H2O 三項溶劑系統(ternary solvent