影響靜相滯留量的因素

在離心分配層析中，液體靜相在管柱中滯留的多寡影響了分離的 效率，在較高的靜相滯留量下可提高對樣品的承載量和分離的解析度。

影響靜相滯留量及分離的效率的因素分為下列幾點[30]

(a) 溶劑系統：在選擇適當的溶劑系統時必須考慮溶劑極性、對溶質 的選擇性以及溶質在不同溶劑中的溶解度。一般而言，分析物在 兩相溶極間最佳的分配係數 KD需在 0.2 ~ 5 之間，才能獲得較佳的

分離效果。但在二元的溶劑系統中，KD值要落在此範圍不容易，

因此，常藉由加入第三種甚至第四種可溶於原先兩者的溶劑，用

來調和原先溶劑在極性或是界面張力的差異。然後依 KD來判斷分

離結果，並決定動靜相。

(b) 儀器轉速：在較大的轉速下，使靜相越容易滯留在管柱中，且因

層，這兩個結果均可提供較高的靜相滯留量，在有關於離心分配 層析分離效果的研究中，若可以得到靜相滯留量越大，解析度也

較佳，所以在CPC 機械結構可以承受的轉速之下，轉動速度越快，

分離效果越好。

(c) 動相流速：當動相流速越快時，越容易將靜相推出管柱，因此靜 相的滯留量會比較少，分離效果較差。反之動相流速若較慢，會 達到較佳的靜相滯留量，且可提高分離解析度，但相對地分離時 間會變長。

2.3.5 離心分配層析儀的應用

以往 CPC 主要應用在天然物製備分離，曾經有學者研究葡萄籽 與 葡 萄 藤 蔓 中 的 成 分 [31] ， 並 大 量 分 離 出 葡 萄 藤 蔓 中 的 trans-resveratrol，此成分具有降低血小板凝集效果，相當於活血作用，

所以也可以防止血栓，甚至中風等疾病。近年來有學者將CPC 與 chiral selectors 結合，應用在分離鏡像異構物的分子[32]，根據研究結果指 出，CPC 也可成功製備分離鏡像異構物。

3.1

(3) 溶劑

Acetonitrile (ACN), HPLC grade, 99.9%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA) Deionized water, purified from Milli-Q plus, (Bedford, MA, USA)

Methyl t-Butyl Ether (MTBE), HPLC grade, 99.8%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA)

Ethanol, 99.5%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA)

Acetone, HPLC grade, 99.9%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA) Formic acid, 98% up, (ACROS, Geel, Belgium, USA)

Ethyl Acetate (EA), HPLC grade, 99.8%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA) n-Butanol (BuOH), ACS grade, 99.9%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA)

3.2 實驗儀器

(1) 離心分配層析儀

CPC 是由 Sanki (Tokyo, Japan)所生產，型號是 CPC 240，內部主 體由 12 個 disks 所構成，包含 3136 個 channels，最高可耐壓為 6.2×

10⁶ N/m² (900 psi)，管柱總容積大約 220 毫升，此儀器的轉速可以控 制在0 ~ 2000 rpm。藉由轉動外部控制閥，就可輕易選擇 ascending mode 或 descending mode 的操作模式。

(2) 往覆式幫浦

此幫浦為Series II Digital HPLC pump ，流速可由 0.01 mL/min ~ 9.99 mL/min，購買自 Pharma-Tech Research Company (Baltimore, MD, USA)。

(3) 梯度沖提幫浦

梯度控制器LabGrad 是由 Lab Alliance (Apple Valley, MN, USA) 公司製造，並結合了Series III pump，流速設定可由 0.01 mL/min ~ 10.00 mL/min，最多可做四種動相組成的混合梯度。

(4) 高效能液相層析管柱

由Polymer Laboratories 製造的 PLRP-S column (250 mm × 4.6 mm, 15 μm)，屬於 reverse phase column，用於桑葉成分的分析。

(5) 紫外光-可見光偵測器(UV-Visible Detector)

型 號 為 Bio-Rad Model 1801 UV-Visible detector (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)，偵測器外部與個人電腦連接，利用色層分析儀 數據處理系統(訊華公司，台北市)擇取實驗訊號。

(6) 紫外光-可見光譜儀(UV-Visible Spectrophotometer) Hewlett Packard 8453, (Waldronn, Germany)。

(7) 離心機

型號為EBA20 (Hettich, Germany)，最大轉速 6000 rpm，最大離 心力為 3421 g。

(8) 迴旋減壓蒸餾器

廠牌為 Buchi (Switzerland)，型號是 R-114。

(9) 分管收集器

廠牌為Advantec (Tokyo, Japan)，型號是 CHF1215A。

(10) ESI-MS

廠牌為 Micromass (Manchester, England)，型號是 Quattro Micro，

主要使用分子量小於2000 電灑游離法質譜。

(11) NMR 500

此儀器廠牌為美國Varian (Lexington, MA, USA)，型號是 Unity Inova -500。重要規格具有(a)超導體磁鐵、電子控制系統、工作站電 腦(b)雙射頻配合 Z 的脈衝磁場梯度(c)變溫裝置(d)探頭分為 5 mm

SWPFG 正向探頭、5 mm IDPFG 反向探頭、Nano probe 超微量膠態 用。

3.3 實驗流程

3.3.1 桑葉的前處理流程

桑葉前處理的流程如圖3-2 所示

在進入 HPLC 分析前，桑葉樣品必須做前處理的步驟，據由文獻 [35]的研究，作者秤 2.0 g 的乾燥桑葉粉末，嘗試利用 20 mL 不同濃 度的乙醇水溶液(0％、20％、40％、60％、80％、100％，v/v)做兩次 萃取，然後再進行 HPLC 的分離，結果可發現桑葉經由 60％乙醇水 溶液萃取後，所得到的 Flavonol compounds 含量最多，由於我們的研 究目的是想分離出桑葉中的Chlorogenic acid、Isoquercitrin、Astragalin、

Q3MG、K3MG 五種成分如圖 2-1 所示，大部分是屬於 Flavonol compounds，故在桑葉樣品的前處理步驟中，則選用 60％乙醇水溶液 做萃取。

(1) 先用天平秤 20.0 g 的乾燥台灣桑葉 2 號，然後使用 500 mL 的 60%

(v/v)乙醇做萃取，在 40 °C 的水浴中利用磁石攪拌萃取 2 小時，之後 使用抽器過濾來除去殘渣的部分，並保留濾液的部分，再使用迴旋減 壓蒸餾器把溶劑抽乾。由於桑葉中的成分相當複雜，希望藉由初步的

批式萃取除去極性較大的化合物，使分離的目標物單純化。

(2) 把溶劑抽乾後的黏稠物，先溶於 100 mL 的去離子水中，使用 300 mL 的 EA 做批式萃取(圖 3-3)，首先加入 100 mL EA，劇烈搖晃後，

靜置 30 分鐘使兩相達到平衡，之後將下層相轉移至另一個分液漏斗

中，再加入新鮮的100 mL EA 於下層相中，同樣劇烈搖晃後，靜置 30 分鐘使兩相達到平衡，再作一次下層相的轉移，最後加入一次新 的100 mL EA，待至平衡，上述總共做了三次批式萃取，故會得到大 約300 mL 的 EA 相和 100 mL 的水相。保留三次 EA 有機相的部分，

並使用迴旋減壓蒸餾器把溶劑抽乾，當作sample 1。

(3) 經由三次 100 mL 的 EA 做批式萃取後的下層水相，再使用每次 100 mL 的 EA 加 0.5 mL 的甲酸做兩次的批式萃取，總共使用 200 mL

的 EA，保留兩次 EA 有機相的部分，並使用迴旋減壓蒸餾器把溶劑

抽乾，當作 sample 2。加入甲酸的目的是希望萃取到含有-COOH 官 能基的目標物，因為酸可以防止-COOH 官能基解離，而降低化合物 的極性，所以可以使得含有-COOH 官能基的成分從水相被萃取到有 機相中。

Samp

圖 ple 1

圖3-2、桑 Samp

桑葉前處理 ple 2

理的流程

先將

3.3.2 偵測桑葉成分在分配系統中的分佈

在實驗過程中，將所配製的 20 mL 有機-水相系統，加入 10 mg

的桑葉樣品，劇烈的搖晃待至平衡後，上、下層相各取4 毫升，然後

用迴旋減壓蒸餾器把溶劑抽乾，再分別加入1 毫升的 HPLC 動相，之

後進樣HPLC 做分析，可得到上、下層相的層析圖，同一個成分在兩

相的濃度比值，也就是層析峰面積積分比值，可得到桑葉各個成分在 兩相中的分佈(KD)。

Cu ： concentration of solute in the upper phase Cl ： concentration of solute in the lower phase

3.3.3 配製不同的溶劑系統

一開始曾嘗試使用 EA/BuOH/H2O 三項溶劑系統(ternary solvent systems)，經過多組不同比例(表 3-1)測試發現，桑葉中五種目標物都 傾向分佈在有機相，表示樣品分佈不是很理想，所以 EA/BuOH/H2O 組成的溶劑系統不適合應用在CPC 分離桑葉方面。

之後根據文獻[28]的研究，嘗試選用 MTBE/Acetone/H O 三項溶

劑系統，測試多組不同比例(表 3-2)，並得到兩組最佳化的溶劑系統，

分別應用在CPC 分離 sample 1 和 sample 2。桑葉中五種目標物在兩 相中都有理想的分佈。

表3-1 EA/BuOH/H2O三項溶劑系統，測試不同組成比例

EA/BuOH/H₂O 4 : 6 : 10 6 : 4 : 10 9 : 1: 10

表3-2 MTBE/Acetone/H₂O三項溶劑系統，測試不同組成比例

MTBE/Acetone/H₂O 4 : 6 : 10 6 : 4 : 10 8 : 2 : 10

MTBE/Acetone/H₂O 加 formic acid

6 : 4 : 10 加0.2% (v/v)

formic acid

6 : 4 : 10 加0.6% (v/v)

formic acid

6 : 4 : 10 加1.0% (v/v)

formic acid

3.3.4 純度的計算

大部份利用 CPC 或 CCC 儀器應用在製備分離中草藥方面[31；

32]，其純度計算方法，主要是藉由不同物質在 HPLC 層析圖中，單 一物質的波峰面積佔總面積的百分比。

純度的計算：

純度 % 單一成分波峰面積

HPLC 所有層析峰的總面積 100%

3.3.5 回收率的計算

根據文獻[36]提到，回收率的計算方法，首先要確認樣品進樣於 CPC 的重量，然後與 HPLC 層析圖中，單一物質的波峰面積佔總面

積的百分比相乘，就可估算出單一成分的回收量，之後再與CPC 製

備分離實驗後真正得到單一成分的量相除，便可計算出樣品回收率。

回收量估計值的計算：

回收量估計值 mg 樣品進樣量 mg 單一成分波峰面積

HPLC 所有層析峰的總面積

回收率的計算：

回收率 % 回收量實際值 mg

回收量估計值 mg 100%

3.3.6 CPC 製備實驗步驟

CPC 實驗儀器裝置如圖 3-4 所示[27]

(1) 利用量筒量取特定體積溶劑，並置於分液漏斗內，配製成所需的 溶劑系統，然後靜置至兩相分層，分別取出上層與下層相。

(2) CPC 調至 descending 方向，用氮氣把管柱內的去離子水保存液吹 出，之後使用往復式幫浦以流速 8 mL/min 將有機靜相填滿整個管 柱。

(3) 啟動 CPC，使其轉速達到 900 rpm。

(4) 待其轉速穩定後，以流速 1 mL/min 將動相打入 CPC，此時會有

靜相從 CPC 中被推出，動相與靜相會在內部達到一個平衡，直到靜

相不再持續被推出時，紀錄被推出的靜相體積，並可以初步計算出此 溶劑系統的靜相滯留率。

(5) 當有機相不再流出，表示動靜相已達到平衡，開啟 UV-Vis 偵測 器(350 nm)，並等待訊號穩定。

(6) 注入桑葉樣品溶液 5 mL，以下層當動相來沖提，並在樣品注入 的同時紀錄層析訊號。

(7) 每 3 分鐘收集一管，即每管中含有 3 mL 的樣品液。

(8) 實驗完成後，CPC 停止轉動，用氮氣將管柱內的液體吹出並收集，

紀錄有機相和水相的體積，上層有機相的體積與總體積相除就是靜相

滯留率。

(9) 在 CPC 停止轉動的情況下，先以 300 mL 甲醇沖洗管柱，再以 300 mL 去離子水清洗，未流出之去離子水保存在 CPC 中。

圖3-4、CPC實驗儀器裝置

包含了梯度幫浦、CPC 儀器、紫外光偵測器、以及分管收集器。

3.3.5 HPLC 分析收集液實驗步驟

HPLC 實驗儀器裝置如圖 3-5 所示

(1) 使用 reversed phase HPLC 系統，先以純的 Acetonitrile 清洗管柱 15 分鐘，再用 solvent A [Tetrahydrofuran：0.1％(v/v) formic acid = 25：

75 (v/v)]當動相沖提管柱 15 分鐘。

(2)

第四章 結果與討論

4.1 以 HPLC 分析桑葉 2 號萃取出的黏稠物

我們利用 HPLC 可以在 50 分鐘內分析桑葉中的混合物，以波長 350 nm 的偵測器偵測，桑葉中 60% (v/v)乙醇萃取物的層析圖(圖 4-1) 出現許多個波鋒，由於桑葉中的成分相當複雜，所以先為這些波鋒由 a ~ i 標記上編號，其中 a、e、g、h、i 依序分別為 Chlorogenic acid、

Isoquercitrin、Astragalin、Q3MG、K3MG 這五個成分，也就是我們

要製備分離的目標物，這些成分的確認是經由收集之後偵測 ESI-MS

得知。其依序的滯留時間分別為8.2 min、17.8 min、21.1 min、26.3 min 和34.9 min。

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0

50 100 150 200 250

m v

min

a

b c d e

f g

h

i

4.2 以質譜鑑定桑葉成分的結構

藉由 HPLC 分析並收集 a、e、g、h、i 五個目標物，樣品進樣量 由原本的20 μL 換成體積較大的 100 μL，分別收集八次後，再用減壓 迴旋蒸餾把溶劑抽乾，然後進一步由ESI-MS 負電荷做結構鑑定，此 儀器是選用低解析度的模式，準確值到整數位。

4.2.1 以質譜鑑定 Chlorogenic acid 結構

4.2.1 以質譜鑑定 Chlorogenic acid 結構

在文檔中 以離心分配層析法製備分離桑葉中五種有效成分 (頁 35-0)