第四章 討論
4.3 催熟處理對於日本鰻紅體之 Angiopoietin -1 與相關血管生長因
雄鰻的 RMI 值在注射腦下垂體萃取液第三針達高峰(圖 25.)，
Angiopoietin-1 在催熟過程表現量逐漸上升，在注射腦下垂體萃取液第六 針時達高峰(圖 27.)，至第九針時表現量下降。採樣個體之 Angiopoietin-1 表現量與 RMI 值呈正相關，顯示與日本鰻紅體生長與 Angiopoietin-1 表 現有相關性。其他相關血管生長因子 VEGF、FLK、DLL-4、Adam、Eph 與紅體生長比例增加其表現量有上升趨勢，顯示上述因子活化途徑對於
日本鰻紅體血管新生的調控有一定程度的貢獻。
雌鰻的 RMI 值在注射腦下垂體萃取液第六針時有升高趨勢，在催熟 過程中紅體發育完備時間可能較雄鰻晚，但 Angiopoietin-1 表現在第六針
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有升高趨勢，亦在催熟後期表現逐漸上升且與雌鰻紅體生長比率呈正相 關，不同的 是 FLK 與 RMI 值間關係趨勢呈負相關，推測可能雌鰻生理內 分泌與雄鰻有所不同，是否為雌激素、黃體酮或睪固酮在鰻魚中分泌量 的差異造成此現象產生，需進一步探討。此外，樣本個體之 VEGF 與 Angiopoietin-1、Podocalyxin 等因子表現關係呈正相關趨勢，代表在血管 新生過程中各因子表現雖有時間上差異，但仍有相當程度關聯性，各因 子間訊息傳遞路徑可能會相互調控，如: 在人類動脈血管內皮細胞中，
VEGF 與 FLK 結合後活化 PI3K-Akt 路徑，會引發 Notch / DLL-4、Ephrin / Eph…等多種下游信息傳遞表現(Ruhrberg, 2003)以維持血管內皮細胞活 性及促進血管生成 (Li et al., 2003) (Hellstrom et al., 2007) 。
4.4 催熟處理及合併使用睪固酮 (Testosterone)催熟日本鰻之卵 巢對於 Angiopoietin-1 與相關血管生長因子表現
注射腦下垂體萃取液之日本鰻卵巢 GSI 值隨注射針數增加而上升，
催熟過程中腦下垂體刺激分泌促性腺激素，促性腺激素可刺激雌鰻卵母 細胞增生並刺激雌鰻卵巢合成雌性素(Estradiol-17β)與排卵，以完成生殖 腺的成熟(Li and Ford, 1998)，實驗中可看出催熟之鰻魚卵巢生長比例增 加，以利進入生殖階段。卵巢發育期間，為了供給足夠養份需要大量血 管新生，相關研究中發現卵巢中發現許多血管新生相關因子，如: VEGF 等 因 子 大 量 表 現 於 黃 體 (corpus luteum) 與 濾 泡 (follicle) 的 發 育 期 (Augustin et al., 1995) ，顯示血管新生因子與卵巢生長應該是有高度相關 性，但在本實驗中發現卵巢之 VEGF、FLK、Angiopoietin-1、DLL-4 表
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現情形與 GSI 值增加呈負相關趨勢(圖 50.) (圖 51.) (圖 53-1.)，推測可能 是採樣的日本鰻是以人工繁殖的方式所培育，需經由外源性注射激素以 達成熟目的，然而性腺發育為需要精準調控的過程，故以此種方式卵巢 發育可能有不均勻的現象(韓等, 2003)，可能由於血管生長分布不完全所 致。以往研究中發現雄性素(Androgen)，可促進初期濾泡發育，並增加卵 巢之顆粒細胞(granulosa cell)與鞘細胞(theca cell)生長，促進卵巢發育 (Vendola et al., 1998) 。本實驗中另外注射睪固酮九針的組別發現其血管 生長因子 VEGF、FLK、Adam、DLL-4、Podocalyxin、Eph 表現量較僅 注射腦下垂體九針之組別高，由卵巢組織切片染色亦可看出 VEGF 在額 外注射睪固酮組別其表現量提升(圖 75.)。顯示睪固酮可能透過結合至卵 巢上的受器以活化 PI3K/Akt 路徑(Kang et al., 2003)，間接增加 VEGF 等 因子表現而促使卵巢濾泡與顆粒細胞週邊血管新生，獲得更充足之氧氣 與養份使卵巢發育更完善，在本實驗中由亦可看出注射睪固酮確實能增 加卵巢的 GSI 值並提升血管新生因子表現量。
4.5 紅體細胞無加藥刺激培養 2 至 8 週，Angiopoietin-1 與相關 血管生長因子表現
在紅體細胞培養過程中表現量在五週至六週可能為各因子表現量之 分界點，VEGF、FLK、Podocalyxin、Eph 表現量趨勢在五週之前高於第 六週後的表現趨勢，代表上述因子在血管新生前期所活化的訊息傳遞路 徑如: PI3K-Akt 路徑等，可能與血管內皮細胞之有絲分裂、遷移並形成管 脈有較大相關性(Klagsbrun and D’Amore, 1996)，而其中只有
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Angiopoietin-1 表現量在第六週後沒有降低，反而有升高之趨勢(圖 61.B)，
在紅體細胞培養過程的後期 Angiopoietin-1 扮演角色與可能與前述因子 有所差異，在許多哺乳類研究中 Angiopoietin-1 與其受器 Tie2 的表現確 實在血管新生後期表現量提升，促使周邊細胞補充與遷徙以利血管成熟 (Thurston et al., 2005)，並與 VEGF 表現趨勢有互補現象(Wakui et al., 2006)。
本實驗中 Angiopoietin-1 在日本鰻血管內皮細胞中的調控角色與哺乳類 動物研究類似，推測在哺乳類和魚類中 Angiopoietin-1 在細胞調控中屬於 後期表現才會提升的因子，也是 VEGF 及 FLK 表現趨勢不同之處。
4.6 紅體細胞以 PPAR agonists 處理 12 小時，Angiopoietin-1 與 相關血管生長因子表現
PPARs (Peroxisome proliferator-activated receptors ) 為核內受體，其 配體多屬於多元不飽和或氧化型脂肪酸，為參與脂肪酸的氧化及代謝重 要因子，對於內皮細胞增生與血管生成亦有影響。實驗中發現 PPAR β agonist會刺激VEGF、FLK、Angiopoietin-1與Eph表現量升高。在紅體細 胞免疫螢光染色部分，PPAR β agonist可刺激Angiopoietin-1蛋白質表現 (圖73-1); PPARγagonist刺激VEGF表現，而抑制Angiopoietin-1、FLK的 表現量; PPAR α agonist刺激VEGF，對其他因子無明顯影響。在哺乳類相 關研究中發現，大鼠的血管平滑肌細胞中一種前列腺素- 15d-PGJ2
(15-deoxy-D12,14-prostaglandin J2)為強效的PPARγagonist，可刺激相關 VEGF轉錄因子的表現以加強轉錄速度並增加其表現量(Jozkowicz et al., 2000) (Cho et al., 2004)，另外在大鼠心肌纖維細胞研究中PPARγagonist
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可促進VEGF表現 (Chintalgattu et al., 2007) ，但在人類臍帶血靜脈內皮 細胞中，15d-PGJ2與PPARγ結合後負調控Angiopoietin-1表現使內皮細胞 遷移與管脈形成受抑制 (Fu et al., 2006)。PPAR β agonist作用後，透過磷 酸化Akt後活化訊息傳遞路徑以增強VEGF表現，使血管內皮細胞增殖促 進癌症細胞的血管新生(Hollingshead et al., 2007)。Angiopoietin-1所調控的 訊息傳遞經過PI3K-Akt路徑，可能也受到PPAR β agonist的正向調控;相關 研究發現 PPAR α agonist可抑制腫瘤細胞的血管新生(Panigrahy et al., 2007)。在哺乳類動物中，同一類PPAR agonist對於血管內皮細胞生長之 促進或抑制，有其差異性存在，推測與研究中使用細胞來源有所不同造 成之。本系統中加入PPAR β 與PPARγagonist對於VEGF有較好的刺激效 用，在鰻魚紅體組織可作為促進血管內皮細胞生長的促進劑。
4.7 紅體細胞以內皮細胞生長補充劑 (ECGs)處理 12 小時、24 小時，Angiopoietin-1 與相關血管生長因子表現
內皮細胞生長補充劑為胎牛腦下垂體抽出物，包含許多生長促進因 子，用來做為血管內皮細胞培養之添加劑以促使細胞分裂，可視為一種 有絲分裂原(mitogen)或細胞活體外培養之催熟劑。實驗中發現處理 12 小 時後，Angiopoietin-1、VEGF、FLK 表現量在 ECGs 濃度 150 μg 與 300 μg 隨著升高; 處理 24 小時後，Angiopoietin-1、VEGF 在 ECGs 濃度 75 μg 時表現最高，在濃度 150 μg 以上其刺激效果反而下降，推測可能是 ECGs 濃度已達飽和。實驗中發現在 ECGs 濃度 300 μg 並處理 12 小時後
Angiopoietin-1 與相關生長因子表現量最高，顯示在此條件下 ECGs 刺激
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紅體細胞生長因子表現效果最佳。
4.8 紅體細胞以金屬離子處理 72 小時，Angiopoietin-1 與相關血 管生長因子表現
4.8.1 以鈷離子(Co
2+)處理
在大鼠腎臟血管研究中鈷離子在活體外可模擬缺氧狀態(Peters et al., 2004)，引起血管內皮細胞上一種由α、 β次單元組成的二聚體
(heterodimer)所構成之轉錄因子HIF (hypoxia-inducible factor)表現，使細 胞能適應於缺氧狀態下(Huang et al., 2003)，在含氧量充足情形下，HIF 的α次單元經由脯胺酸(Prolines) 402 與564 氫氧化(Hydroxylation)後使 HIF處於穩定狀態(Jaakkola et al., 2001)，並結合至Hippel–Lindau腫瘤抑制 蛋白上，進一步被泛素化 (ubiquitination)而被蛋白酶體複合物(proteasome complex)降解(Maxwell et al., 1999)，而在缺氧狀態下，α次單元上的氫氧 基被除去並結合至β次單元，使轉錄因子HIF由核膜移至核內進行轉錄作 用，透過轉錄VEGF、erythropoietin (EPO)等目標基因(Goldberg et al., 1994) 以促進各種生理作用，包含血管新生(Tanaka et al., 2005)，直接增進VEGF 基因轉錄表現。本實驗中可觀察出VEGF表現在鈷離子濃度10-5M時受刺 激且Podocalyxin表現亦有提升趨勢，但Angiopoietin-1表現不受鈷離子濃 度增加影響，顯示在鰻魚紅體細胞中鈷離子調控VEGF表現與哺乳類結果 類似，Angiopoietin-1可能不受鈷離子活化之路徑影響。在本實驗中鈷離 子是否誘發HIF作用而增加VEGF表現，需進一步探討。
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4.8.2 以銅離子(Cu
2+)處理
在人類角蛋白細胞(human keratinocytes)，在含氧量充足狀態下，銅 離子可抑制 HIF 之α 次單元氫氧化使其無法被蛋白酶體複合物降解，累 積大量 HIF α 次單元使其結合至 β 次單元以增強轉錄 VEGF 基因並刺激 VEGF 表現，其作用機制與鈷離子在缺氧狀態下所引發之路徑類似(Martin et al., 2005)。此外銅離子會活化與血管新生與細胞外基質(extracellular matrix)重塑(remodeling)的相關途徑以增加皮膚創傷癒合的速度(Ellison et al., 2002)。在鰻魚紅體細胞中，各血管新生因子表現似乎不受銅離子濃 度增加影響，與哺乳類研究有所差異，推測銅離子誘導鰻魚紅體內皮細 胞血管生長因子表現，與哺乳類動物相較之下較不敏感，其中機制需再 深入探討。
4.8.3 以鋅離子(Zn
2+)處理
在哺乳類相關研究中，MVZ+426 鋅指蛋白(zinc finger protein- ZFP) 轉錄因子以基因工程方式殖入大鼠體內，可促使VEGF大量表現而改善大 鼠四肢血管局部缺血的現象(Lei et al., 2006) 。鋅離子為調節細胞功能一 種重要物質(Vallee et al., 1993)，可活化多種訊息傳遞路徑包含: 酪胺酸激 酶受器及非酪胺酸激酶受器 (receptor or non-receptor tyrosine kinases)、
Ras/mitogen-activated protein kinases (MAPKs)與PI3K-Akt訊息傳遞路徑 (Wu et al., 2002) (Zhang et al., 2002)，另外由Angiopoietin-1引起的抗發炎 途徑中，ABIN-2 (A20 binding inhibitor of NF-κB activation-2)與鋅指蛋白 - A20作用以抑制引起發炎及抗細胞凋亡的NF-κB路徑(Tadros et al.,
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2003) 。本實驗中Angiopoietin-1在鋅離子濃度10-7M 時表現明顯上升;
VEGF、FLK與Podocalyxin分別在濃度10-7M、10-6M 時表現受刺激; Eph 表現在鋅離子濃度10-6M 時明顯升高。推測鰻魚紅體細胞中以鋅離子調 控下，與哺乳類的內皮細胞研究類似，可能藉由活化PI3K-Akt、MAPKs 傳遞路徑，誘導Angiopoietin-1、VEGF、FLK及Podocalyxin表現。此外，
在本系統中，鋅離子對於鰻魚紅體內皮細胞之血管新生因子的刺激效果，
與鈷離子和銅離子相較之下，刺激作用較佳。
4.9 紅體細胞以類固醇(Steroids)處理 72 小時，Angiopoietin-1 與 相關血管生長因子表現
4.9.1 以睪固酮 (Testosterone)處理
相關研究中，人 類臍帶靜脈血管內皮細胞(HUVEC)以睪固酮處理後，
發現到了晚期(數天)時會誘發細胞凋亡(Ling et al., 2002) 。另有研究指出 血管內皮細胞上的 VEGF 受體如果被抑制，VEGF 無法和 VEGF 受體結 合，會造成血管內皮細胞誘發細胞凋亡(Hamada et al., 2005)。但睪固酮是 否經由抑制 VEGF 受體而誘發細胞凋亡，目前仍無報告指出，需進一步 研究。在鰻魚紅體細胞中，VEGF 表現量下降推測可能是受到睪固酮抑 制其受器 FLK，產生細胞凋亡現象; Angiopoietin-1 表現量在睪固酮濃度 10-7M 時上升，是否與哺乳類研究類似，因細胞凋亡現象促使
Angiopoietin-1 表現量升高以維持細胞活性，仍需進一步探討。
4.9.2 以雌二醇 (β-Estradiol)處理
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哺乳類研究中發現雌二醇透過結合至受器 ER (Estrogen receptor)- α，
刺激被切除卵巢的雌鼠大腦中 Angiopoietin-1 mRNA 表現，增加血管結構
刺激被切除卵巢的雌鼠大腦中 Angiopoietin-1 mRNA 表現，增加血管結構