第一章 前言
1.5 Angiopoietin-1 表現的調控
相關研究指出，在牛的視網膜周邊細胞中，缺氧環境不只能活化 VEGF，並且可刺激 Angiopoietin-1 及 Tie2 的表現(Park et al., 2003)。類固 醇也會經由血管內皮細胞的細胞膜上特異性受體作用(Suzuki et al., 2003)，
而引發一連串的信息傳遞，會活化 G protein (GTP binding protein)並產生 GTP，進行一連串的信息傳遞(Suzuki et al., 2003) ; 當血管內皮細胞受到 傷害時，會分泌細胞激素，如 tumor necrosis factor-α (TNF-α)、
interleukin-1α (IL-1α)、interleukin-8 (IL-8)等，因為白血球上有細胞激素受 體，因此白血球與細胞激素結合，引發一 連串的發炎反應(Rietschel et al., 1996)，而在人類血管平滑肌細胞中 IL-1α 負調控 Angiopoietin-1 並使 Tie2 去磷酸化 (Fan et al., 2004) 。
1.6 其他血管新生相關因子
VEGF 是血管內皮細胞生長的重要因子，藉由與 酪胺酸激酶受體FLK 結合，可活化 PI3K-Akt 等訊息傳遞路徑，調控血管內皮細胞增生、血管
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新生、脈管生成和血管通透(Klagsbrun and D’Amore, 1996)。Eph receptor 為酪胺酸激酶受體的一種，與配體 Ephrins 結合作用後，活化 PI3K -Akt 等路徑而刺激內皮細胞生長、遷移與神經元發育，對於胚胎發育及血管 系形成與早期血管新生皆有貢獻(Brantley et al., 2002) 。另外，Notch 為 一穿膜受器，與配體 DLL-4 (Delta-like 4)結合後，首先經由 Adam10 (A Disintegrin And Metallopeptidase 10) 在 N 端穿膜區域產生蛋白水解
(proteolytic)，接著γ-secretase 將 DLL-4 次單位釋放出，移動至細胞核內 活化與細胞連結相關轉錄作用途徑(Ndiaye et al., 2003)，以維持血管穩定 性，在視網膜血管內皮細胞研究中，VEGF 可誘導 DLL-4 表現，DLL-4 作為一負回饋調控因子以平衡由 VEGF 引起之正向信息(positive signal)，
VEGF/FLK 與 Notch/DLL-4 信息傳遞系統分別有不同的作用，共同調控 血管新生(Lobov et al., 2007) (圖 10.)。
1.7 為何以日本鰻為模型
鰻魚屬於鰻鱺科(Anguillidae)，鰻屬(Anguillus)，演化上屬於原始脊 椎動物，生長到不同時期時會有變態發生而改變外觀。在卵孵化之後，
最先形成柳葉鰻(letocephalus)，然後變態成玻璃鰻(glass eel)、再 來是鰻線 (elvers)、黃鰻(yellow eel)，最後再變態成銀鰻(silver eel)而成熟後降海產 卵(Tzeng et al., 2000)，因其特殊的生活史，使鰻魚體型和外觀改變，其 體內各項生理機能也隨之改變，其中較有明顯變化的是紅體 (rete
mirabile)，紅體位於魚鳔內，由許多動脈和靜脈的微血管網組成，為調控 魚類氣體分泌的一個器官，由於鰻魚要降海繁殖時，魚鰾必須變大來應
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付深海高壓力的環境，因此紅體內微血管也會跟著增生，紅體也跟著變 大(Yamada et al., 2001)。因為紅體血管內皮細胞較易取得，所以非常適合 做為血管新生研究的模型(Garrick, 2000)。另外，雌鰻卵巢隨降海繁殖而 發育成熟。由於血管新生，可觀察到鰻魚的 卵巢裡佈滿微血管(Muller et al., 2004)，因此，鰻魚卵巢是活體(in vivo)研究血管新生很好的模型。
1.8 日本鰻的人工養殖及所遭遇的困難
日本鰻為台灣重要的養殖魚種之一，養鰻產業極度依賴天然鰻線之 供給，形成產業發展上之主要瓶頸。近年來受到河川污染、水庫建造、
棲息地被破壞，氣候變遷以及天然鰻線過漁等諸多因素的影響，導致鰻 線產量之長期趨勢有下降之現象 (Tzeng et al., 1995)。因此，進行日本鰻 人工繁殖技術的研發，為鰻魚養殖產業永續發展之關鍵所在。但不論是 捕獲之野生或人工飼養之鰻，皆無法在人為環境下自然成熟，此一特徵 使得鰻魚人工催熟必須依賴長期注射異源性激素，方能強迫鰻魚生殖腺 的進一步發育、成熟。探討鰻魚人工繁殖迄今未能突破的原因，可能有 以下因素:
1. 鰻魚之催熟過程冗長，導致受精率與孵化率之不穩定: 以異源性激素 直接刺激生殖腺的發育，然而性腺的發育是需要精準的調控，因此卵質 的優劣不太穩定。一般對其他魚類採行的人工催熟方法，係先使其能自 行發育至成熟階段，然後再以高劑量的異源性激素促使其進入最後成熟 階段，而達到排卵的目的，在此情況下卵的品質無虞。至於鰻魚則否，
要達到自行發育至成熟階段，只能依靠長期多次的注射異源性促性腺激
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素催熟。利用此種方式催熟所得到之卵粒，可能本身即有缺陷，因此即 使能受精孵化，仔魚的正常發育也受到某種影響。
2. 仔魚的生長不穩定: 在得到受精卵後，孵化及仔魚的培育即成為另一 種重要的課題，人工培育之仔魚可能有某些方面之缺陷，則可能是人工 培育環境並無法滿足仔魚之生長需求(韓等, 2003)。此外，在鰻魚人工繁 殖過程中，其胚胎在14天內死亡率相當高，推測可能與胚胎內血管發育 不完全，可能為其中因素之一，需進一步的探討改進，以達改善之目的。
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實驗目的
在許多哺乳類動物相關研究中了解 Angiopoietin-1 為血管生成和血 管新生的必須調控因子，尤其與血管新生後期成熟階段有關，故進一步 探討 Angiopoietin-1 在日本鰻此類較原始的脊椎動物中，在長時間的演化 下，出生後發育的生理功能，在紅體組織與卵巢發育時所扮演的角色，
以了解 Angiopoietin-1 是否在血管新生後期表現情形與 VEGF 等因子是否 有所差異。此外，探討紅體細胞活體外培養中，受外在因子(如: 類固醇、
生長因子、金屬離子…等)調控後，Angiopoietin-1 與相關血管生長因子的 表現情形，以確立 Angiopoietin-1 在日本鰻紅體之血管新生所扮演的角色，
期望未來能應用於鰻魚催熟以改善日本鰻人工繁殖，因血管生長不完全 而導致卵巢發育不良與幼鰻發育缺陷的問題。
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第二章、材料與方法
2.1 激素及藥品配製
2.1.1 PPARαagonists (Fenofibrate)
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0027g 之 Fenofibrate 粉末，
加入 1.87 ml DMSO 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮液 實驗濃度: 取 10 μl 之 PPARαagonists 濃縮液加入 990μl 之 M199 培養
液，使實驗濃度成為 10-5 M
2.1.2 PPARβagonists
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0043g 之 PPARβagonists 粉 末，加入 3.21 ml DMSO 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮 液
實驗濃度: 取 10 μl 之 PPARαagonists 濃縮液加入 990μl 之 M199 培養 液，使實驗濃度成為 10-5 M
2.1.3 PPARγagonists (Troglitazone)
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.005g 之 Troglitazone 粉末，
加入 5.66 ml DMSO 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮液
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實驗濃度: 取 10 μl 之 PPARαagonists 濃縮液加入 990μl 之 M199 培養 液，使實驗濃度成為 10-5 M
2.1.4 ECGs (Endothelial Cell Growth supplements)
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.003g 之 ECGs 粉末，加入 1ml PBS 溶解，配製成濃度 3μg /μl 濃縮液
實驗濃度: 取 25 μl、50 μl、100 μl 之 ECGs 濃縮液，分別加入 975 μl、
950 μl、900 μl 之 M199 培養液中
2.1.5 硫化鋅 (Zinc Sulfide)
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.002g 之硫化鋅粉末，加入 21.528 ml PBS 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮液 實驗濃度: 將 10-3 M 硫化鋅濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M 及 10-5 M 之濃
縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl 之 M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-5 M、10-6 M、10-7 M
2.1.6 氯化鈷 (Cobalt chloride)
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0026g 之氯化鈷粉末，加入 11 ml PBS 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮液
實驗濃度: 將 10-3 M 氯化鈷濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M 及 10-5 M 之濃
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縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990 μl 之 M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-5 M、10-6 M、10-7 M
2.1.7 硫酸銅 (Copper sulfate)
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0023g 硫酸銅粉末，加入 9.212 ml PBS 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮液
實驗濃度: 將 10-3 M 硫酸銅濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M 及 10-5 M 之濃 縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl 之 M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-5 M、10-6 M、10-7 M
2.1.8 睪固酮 (Testosterone)
*來源: 購自 Fluka Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0023g 睪固酮粉末，加入 798μl 酒精溶解，配製成濃度 10-2 M 濃縮液 實驗濃度: 將 10-2 M 睪固酮濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M、 10-5 M 及
10-6M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl 之 M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-6 M、10-7 M、10-8 M
2.1.9 雌二醇(β- Estradiol)
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0022g 之β- Estradiol 粉末，
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加入 735μl 酒精溶解，配製成濃度 10-2 M 濃縮液 實驗濃度: 將 10-2 M 雌二醇濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M、 10-5 M 及 10-6M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl 之 M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-6 M、10-7 M、
10-8 M
2.1.10 黃體酮 (Progesterone)
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0023g 之 Progesterone 粉末，
加入 732μl 酒精溶解，配製成濃度 10-2 M 濃縮液 實驗濃度: 將 10-2 M 黃體酮濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M、10-5 M 及
10-6M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-6 M、10-7 M、10-8 M
2.1.11 吳郭魚類胰島素生長因子-1 (Tilapia Insulin-Like growth factor-1)
*來源: 吳郭魚 IGF-1 (純度 90%，由中央研究院吳金洌老師提供)
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.001g 之 IGF-1 粉末，加入 1ml PBS 溶解，配製成濃度 10-4 M 濃縮液
實驗濃度: 將 10-2 M 的 IGF-1 濃縮液另外分管稀釋成 10-5 M、10-6 M 及 10-7M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-7 M、10-8 M、10-9M
2.1.12 胰島素(Insulin)
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*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 原瓶內之溶液濃度為 10 mg / ml，即濃度 10-3 M 溶液，
其中取出 10μl 溶於 990μl PBS，配製成濃度為 10-5 M 濃縮液
實驗濃度: 將 10-3 M 的胰島素濃縮液另外分管稀釋成 10-5 M、10-6 M 及 10-7M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-7 M、10-8 M、10-9M
2.1.13 鹼性纖維母細胞生長因子 ( Basic fibroblast growth factor )
*來源: 購自 ProSpec Tany Technogene Co.
濃縮液(stock)配製: 原管內含 0.05 mg 之 bFGF 粉末，加入 0.5ml PBS 後 並上下搖晃至均勻，濃度為 10-6 M 濃縮液
實驗濃度: 將 10-6 M 的 bFGF 濃縮液另外分管稀釋成 10-7M 及 10-8 M 之 濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 100μl 加入 990μl M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-7 M、10-8 M、10-9M
2.2 日本鰻(Anguilla japonica)來源與馴養環境以及活體外源激素 處理
本實驗所使用的鰻魚購自本地的鰻魚養殖場，為生長一至二年的日 本鰻(Anguilla japonica)，實驗前先在人工海水中馴養約一星期，不予餵 食。同時間本地其他養殖場的泰國鯰魚，取出腦下垂體(每顆約 4.2mg，
保存於丙酮中)，將其磨碎後，以適量的 pH 7.4 之磷酸鹽緩衝溶液
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(Phosphate Buffered Saline；PBS)混合均勻後，儲存於-20℃中。作為日本 鰻催熟劑量約 2 顆腦下垂體/每公斤魚重。將養殖池中的 60 隻鰻魚撈出，
以 0.05%的乙二醇苯醚( 2-phenoxyethanol)麻醉數分鐘後，在日本鰻腹部 注射 1mL 泰國鯰魚腦下垂體萃取液(Catfish Pituitary Exacts；CPE)，每週 注射一次，並在日本鰻未注射泰國鯰魚腦下垂體萃取液前以及在注射泰 國鯰魚腦下垂體萃取液第 3、6、9 針後的 72 小時採集卵巢和紅體組織。
另外，在所有採樣之日本鰻中，隨機挑出其中 10 隻以晶片植入做記號，
每週另外再注射 0.5mL 睪固酮 (Testosterone)一次，並在日本鰻未注射泰 國鯰魚腦下垂體萃取液和睪固酮第 9 針後的 72 小時採集卵巢和紅體組 織。