第二章 材料與方法
2.1 激素及藥品配製
2.1.1 PPARαagonists (Fenofibrate)
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0027g 之 Fenofibrate 粉末，
加入 1.87 ml DMSO 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮液 實驗濃度: 取 10 μl 之 PPARαagonists 濃縮液加入 990μl 之 M199 培養
液，使實驗濃度成為 10-5 M
2.1.2 PPARβagonists
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0043g 之 PPARβagonists 粉 末，加入 3.21 ml DMSO 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮 液
實驗濃度: 取 10 μl 之 PPARαagonists 濃縮液加入 990μl 之 M199 培養 液，使實驗濃度成為 10-5 M
2.1.3 PPARγagonists (Troglitazone)
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.005g 之 Troglitazone 粉末，
加入 5.66 ml DMSO 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮液
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實驗濃度: 取 10 μl 之 PPARαagonists 濃縮液加入 990μl 之 M199 培養 液，使實驗濃度成為 10-5 M
2.1.4 ECGs (Endothelial Cell Growth supplements)
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.003g 之 ECGs 粉末，加入 1ml PBS 溶解，配製成濃度 3μg /μl 濃縮液
實驗濃度: 取 25 μl、50 μl、100 μl 之 ECGs 濃縮液，分別加入 975 μl、
950 μl、900 μl 之 M199 培養液中
2.1.5 硫化鋅 (Zinc Sulfide)
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.002g 之硫化鋅粉末，加入 21.528 ml PBS 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮液 實驗濃度: 將 10-3 M 硫化鋅濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M 及 10-5 M 之濃
縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl 之 M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-5 M、10-6 M、10-7 M
2.1.6 氯化鈷 (Cobalt chloride)
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0026g 之氯化鈷粉末，加入 11 ml PBS 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮液
實驗濃度: 將 10-3 M 氯化鈷濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M 及 10-5 M 之濃
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縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990 μl 之 M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-5 M、10-6 M、10-7 M
2.1.7 硫酸銅 (Copper sulfate)
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0023g 硫酸銅粉末，加入 9.212 ml PBS 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮液
實驗濃度: 將 10-3 M 硫酸銅濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M 及 10-5 M 之濃 縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl 之 M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-5 M、10-6 M、10-7 M
2.1.8 睪固酮 (Testosterone)
*來源: 購自 Fluka Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0023g 睪固酮粉末，加入 798μl 酒精溶解，配製成濃度 10-2 M 濃縮液 實驗濃度: 將 10-2 M 睪固酮濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M、 10-5 M 及
10-6M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl 之 M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-6 M、10-7 M、10-8 M
2.1.9 雌二醇(β- Estradiol)
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0022g 之β- Estradiol 粉末，
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加入 735μl 酒精溶解，配製成濃度 10-2 M 濃縮液 實驗濃度: 將 10-2 M 雌二醇濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M、 10-5 M 及 10-6M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl 之 M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-6 M、10-7 M、
10-8 M
2.1.10 黃體酮 (Progesterone)
*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0023g 之 Progesterone 粉末，
加入 732μl 酒精溶解，配製成濃度 10-2 M 濃縮液 實驗濃度: 將 10-2 M 黃體酮濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M、10-5 M 及
10-6M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-6 M、10-7 M、10-8 M
2.1.11 吳郭魚類胰島素生長因子-1 (Tilapia Insulin-Like growth factor-1)
*來源: 吳郭魚 IGF-1 (純度 90%，由中央研究院吳金洌老師提供)
濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.001g 之 IGF-1 粉末，加入 1ml PBS 溶解，配製成濃度 10-4 M 濃縮液
實驗濃度: 將 10-2 M 的 IGF-1 濃縮液另外分管稀釋成 10-5 M、10-6 M 及 10-7M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-7 M、10-8 M、10-9M
2.1.12 胰島素(Insulin)
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*來源: 購自 Sigma-Aldrich Co.
濃縮液(stock)配製: 原瓶內之溶液濃度為 10 mg / ml，即濃度 10-3 M 溶液，
其中取出 10μl 溶於 990μl PBS，配製成濃度為 10-5 M 濃縮液
實驗濃度: 將 10-3 M 的胰島素濃縮液另外分管稀釋成 10-5 M、10-6 M 及 10-7M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-7 M、10-8 M、10-9M
2.1.13 鹼性纖維母細胞生長因子 ( Basic fibroblast growth factor )
*來源: 購自 ProSpec Tany Technogene Co.
濃縮液(stock)配製: 原管內含 0.05 mg 之 bFGF 粉末，加入 0.5ml PBS 後 並上下搖晃至均勻，濃度為 10-6 M 濃縮液
實驗濃度: 將 10-6 M 的 bFGF 濃縮液另外分管稀釋成 10-7M 及 10-8 M 之 濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 100μl 加入 990μl M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-7 M、10-8 M、10-9M
2.2 日本鰻(Anguilla japonica)來源與馴養環境以及活體外源激素 處理
本實驗所使用的鰻魚購自本地的鰻魚養殖場，為生長一至二年的日 本鰻(Anguilla japonica)，實驗前先在人工海水中馴養約一星期，不予餵 食。同時間本地其他養殖場的泰國鯰魚，取出腦下垂體(每顆約 4.2mg，
保存於丙酮中)，將其磨碎後，以適量的 pH 7.4 之磷酸鹽緩衝溶液
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(Phosphate Buffered Saline；PBS)混合均勻後，儲存於-20℃中。作為日本 鰻催熟劑量約 2 顆腦下垂體/每公斤魚重。將養殖池中的 60 隻鰻魚撈出，
以 0.05%的乙二醇苯醚( 2-phenoxyethanol)麻醉數分鐘後，在日本鰻腹部 注射 1mL 泰國鯰魚腦下垂體萃取液(Catfish Pituitary Exacts；CPE)，每週 注射一次，並在日本鰻未注射泰國鯰魚腦下垂體萃取液前以及在注射泰 國鯰魚腦下垂體萃取液第 3、6、9 針後的 72 小時採集卵巢和紅體組織。
另外，在所有採樣之日本鰻中，隨機挑出其中 10 隻以晶片植入做記號，
每週另外再注射 0.5mL 睪固酮 (Testosterone)一次，並在日本鰻未注射泰 國鯰魚腦下垂體萃取液和睪固酮第 9 針後的 72 小時採集卵巢和紅體組 織。
2.3 GSI 及 RMI 的測量
將鰻魚麻醉後，以電子天秤測量鰻魚體重後，利用解剖器具將雌鰻 總卵巢、紅體組織取出後，以微量電子天秤稱重，利用下列公式計算出 GSI 和 RMI :
生殖腺質量指數(Gonado-Somatic Index ; GSI)
*GSI (%) = 100×(生殖腺重/體重) 紅體質量指數(Rete Mirabile Index ; RMI)
*RMI (‰) = 1000×(紅體總重/體重)
2.4 紅體細胞的取得與培養
各取 0.008g 胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin，0.25mg/ml)、膠原蛋白酶
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(collagenase，0.25mg/ml)和蛋白酶(dispase，0.25mg/ml)溶解於 20ml 磷酸 鹽緩衝溶液中，再經由0.2μm 的無菌過濾膜至 50ml 離心管後，置於冰上 備用。在內含 PBS 滅菌玻璃皿中使用滅菌解剖剪將紅體組織剪成細碎狀 後，移入配製好的酵素混合液中，於 4℃下過夜(overnight)作用後，再於 室溫中作用ㄧ小時後，將其移至冰上使反應停止並沉澱。以無菌滴管吸 除酵素後，加入 7 mL PBS，以 1mL 針筒(拔除針頭部分)抽吸作用組織碎 塊，再以濾網(70μm)過濾，約反覆一到二次後，置入 15ml 離心管， 以 4500rpm，在 4℃下，離心 8 分鐘。以無菌吸管吸除上清液至剩 2mL，加 入含 10%胎牛血清培養液(M199)懸浮細胞，使細胞和 10 %胎牛血清培養 液(M199)混合均勻(此處添加量以細胞量及實驗設計而定)。取出 100μl 的 細胞懸浮液與100μl 的 trypan blue solution 均勻混合，再吸取細胞混合液 10μl 放入血球細胞計數器（hemacytometer）中，計算細胞計數器九宮格 裡最外面四個大格的細胞數目。如果是死細胞會被 trypan blue solution 染 成藍色，如果是活細胞則會不呈色，因此只要計算活細胞即可。細胞總 數= (細胞計數器上四大格的活細胞總數/4) ×2×104×細胞懸浮液之總體積。
經細胞計數之後的細胞總數，再調整成約每毫升 105~106的細胞數，將其 平均種入 12 孔細胞培養盤中，並以含 10% 胎牛血清的培養液培養三天。
每三天更換新培養液，並培養於 25℃，5% CO 2培養箱，直到細胞長滿 於培養盤，即可加入欲處理的外源激素。另外，培養的前一天，12 孔細 胞培養盤需貼附(coating)ㄧ層明膠(1%的 gelatin)約 12 小時以上，使紅體 血管內皮細胞專一貼附，之後吸除明膠，待乾燥後即可使用。
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2.5 卵巢和紅體的 RNA 分離
在 1.5ml eppendorf 管內加入 0.5ml TRI® Reagent 與研磨珠(此研磨珠 泡於 DEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水中，於 37℃水浴 6 小時，將 DEPC 水倒掉，再以高溫高壓下滅菌 20 分鐘後，置於 70℃烘箱中烘乾，然後保 存於 4℃以備使用)，將取樣組織約 60mg 放入上述之 eppendorf 管中，以 震盪均質機(homogenizer)磨碎後放置冰上，再以 12000rpm，4℃的條件離 心 10 分鐘。使用微量吸管取上清液，移入新 1.5ml eppendorf 管中，加入 200μl BCP (1-bromo-3-chloropropane) ，以取代毒性較高的氯坊
(chloroform)，降低分離 RNA 的污染，輕輕搖晃混合均勻後並，室溫靜置 10 分鐘後，以 12000rpm， 4℃離心 15 分鐘。此時上層為水相(內含 RNA)，
下層為有機相，兩相之間有白色的蛋白質層且包含 DNA，小心地吸取上 清液，移入新 1.5ml eppendorf 中，加入500μl 異丙醇混合均勻後，以同 樣條件離心 10 分鐘。移去上清液，以 1ml 75%酒精清洗白色沉澱，吸除 酒精後，放置無菌操作臺中自然乾燥白色沉澱物，待其變透明後，以 65
℃~70℃的 miniQ 經高溫高壓滅菌水溶解，保存於-70℃。
2.6 紅體細胞 RNA 分離
利用 Viogene 公司的 total RNA Mini kit 抽取全 RNA。首先，吸除培 養液並以 PBS 沖洗兩次。12-well 的培養盤中，每個 well 加入 350μl 的 RX buffer(每一毫升的 RX buffer 含有10μl 的 β-mercaptoethanol)
( β-mercaptoethanol 可有效降低雙硫鍵對蛋白質的破壞)，輕輕敲打後靜置 5 分鐘。將作用後的 RX 混合液吸取至 1.5ml 微量離心管後，加入同體積
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(350μl) 75%酒精消毒(需以高純度酒精配置)並均勻混合，將混合液置入 Total RNA Mini column 中，於 4℃下離心 13000 rpm、1 分鐘。離心後去 除洗滌液，加入 0.5ml WF buffer 反應於 4℃下離心 13000 rpm、1 分鐘 (WF 的作用為使 RNA 鍵結於 column)。離心後去除洗滌液，加入 0.7ml WS buffer 反應於 4℃下離心 13000 rpm、1 分鐘(WF 的作用為洗未鍵結於 column 的物質)。離心後去除洗滌液，空管於 4℃下離心 13000rpm、3 分 鐘後(此步驟目的在於更完全去除酒精成分)，將 column 放入新的 1.5ml 微量離心管中並加入 15μl 的 RNase-free ddH2O(盡量加至 column 中央)，
靜置 1 分鐘後反應於室溫下離心 9000 rpm、2 分鐘。離心後的洗滌液即 為細胞全 RNA，需置於-70℃下保存。
2.7 組織與細胞之 cDNA 的製備
取出 2μl 之全 RNA 溶液並以二次水稀釋二百倍，以分光光度計量測 260nm 與 280nm UV 波長吸光值，計算出 RNA 的濃度(RNA 量μg/ml=
O.D.260×40×稀釋倍數)。個別算出含有 5 μg RNA 所需的 RNA 溶液體積，
以規格化(Normalize)所有的樣本，利用 SuperScript™ II Reverse
Transcriptase Kit (Invitrogen Corporation, USA)透過反轉錄作用合成所有 mRNA 的 First-strand cDNAs：首先在 RNase-free 之 200μl PCR eppendorf 中依序加入5μg total RNA 後，用滅菌水將總體積補至 11μl，最後加入 1μl 引子及1μl 2.5mM dNTP mix，將此反應溶液混合均勻後，置於 PCR 反應 器中。以 65℃加熱 5 分鐘後，快速置於冰上冷卻 1 分鐘後，加入4μl 5X First-strand buffer、2.5μl 0.1M DTT 及 0.5μl SuperScript™II RTase(總反應
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體積20μl)，混合均勻並短暫離心後於 PCR 反應器中，反應條件為 42℃- 52 分鐘，70℃- 15 分鐘。最後產物即為 cDNAs。
2.8 PCR (Polymerase Chain Reaction)分析
將不同處理的實驗鰻或實驗細胞抽取全 RNA 反轉錄為 cDNA 後，以 cDNA 為模板及欲分析基因的專一性引子經由 Thermal Hybaid™公司所 生產之聚合酶連鎖反應機，進行 PCR 反應以提升樣品濃度並進行分析。
PCR 反應產物經 DNA 電泳分析後，利用 Ezlab 膠片影像分析軟體比較實 驗組與對照組之間表現量差異。其中，以 cytochrome b 作標準基因(Internal standard) ，以除去由於 RNA 濃度不同所造成定量上的差異。最後，以 Sigma Plot 軟體進行數據分析。
各分析基因之引子如下：
eelcytb rv：5’-GTAAAGGTATGAGCCGTAGTAAAG-3’
Cytochrome b
eelcytb fw：5’-CACAAATCCTTACAGGACTATTCC-3’
反 應 條件 為 ： (1) 94℃- 3 分 鐘 (denaturing), 1 cycle (2) 94℃-30 秒 (denaturing), 55℃- 30 秒(annealing),72℃- 25 秒(elongation) , 26 cycles ; (3)72℃- 10 分鐘, 1 cycle。
F 148 : 5’-CCG AAC AGA CAC GGA AAC-3’
Angiopoietin-1
R 778 : 5’-CCA AAG CCC ATC TTA TAC TC-3’
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反應條件為：(1) 94℃- 3 分鐘, 1 cycle (2) 94℃-30 秒, 50℃- 30 秒,72℃- 40 秒, 33 cycles ; (3)72℃- 10 分鐘, 1 cycle。
F 12 : 5’- ATGAACTTTGCTGCCAGCTTG -3’
VEGF
R 340: 5’-AATTGTGTTGCGTCACATGC -3’
反應條件為：(1) 94℃- 3 分鐘, 1 cycle (2) 94℃-30 秒, 55℃- 30 秒, 72℃- 40 秒, 35 cycles ; (3)72℃- 10 分鐘, 1 cycle。
F 216: 5’-TCC CCG AGA CCG ACT TAG ACT GG -3’
FLK
R 628: 5’- GCT GGG CGA ACT TCC TGT GCT-3’
反應條件為：(1) 94℃- 3 分鐘, 1 cycle (2) 94℃-30 秒, 55℃- 30 秒, 72℃- 40 秒(elongation) , 35 cycles ; (3)72℃- 10 分鐘, 1 cycle。
F 64: 5’-CGC CCT GCT GGC CGT GAT AAT C -3’
Podocalyxin
R 342: 5’-GGA AAG GGC GTG GCC TAC AGG TG -3’
反應條件為：(1) 94℃- 3 分鐘, 1 cycle (2) 94℃-30 秒, 55℃- 30 秒, 72℃- 30 秒, 33 cycles ; (3)72℃- 10 分鐘, 1 cycle。
Eph
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F 120: 5’-CCACACTCGCTA CCA TGA AA -3’
R 478: 5’-TTGTTTCACTACGGCAGGTG -3’
反應條件為：(1) 94℃- 3 分鐘, 1 cycle (2) 94℃-30 秒, 55℃- 30 秒, 72℃- 40 秒, 35 cycles ; (3)72℃- 10 分鐘, 1 cycle。
2.9 Angiopoietin-1 基因選殖
將欲選殖基因利用 NCBI 以物種同源性做比對，挑選斑馬魚 (Danio
將欲選殖基因利用 NCBI 以物種同源性做比對，挑選斑馬魚 (Danio