日本鰻血管生成素(Angiopoietin)-1基因選殖與血管新生相關因子在紅體組織及卵巢表現調控之研究

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(1)國立高雄大學生物科技研究所碩士論文. 日本鰻血管生成素(Angiopoietin) -1 基因選殖與血管新生相關因子在紅體組織及卵巢表現調控之研究 Cloning of Angiopoietin-1 gene and study of the regulation on angiogenic factors in the rete mirabile and ovary in Japanese eel (Anguilla japonica). 研究生: 張宸瑋撰指導教授: 施能朗博士黃永森博士. 中華民國 98 年 7 月.

(2) 謝誌兩年研究所時光過的飛快，過程中有太多需要感謝的人，首先感謝黃永森博士細心的指導，傳授我許多研究中的精隨，並使我了解許多在實驗室中待人接物的觀念。感謝施能朗博士對於我在論文寫作及口頭報告上該注意之細節，使我受益匪淺，感謝兩位老師對我的包容與鼓勵。感謝高雄海洋科技大學陳鳴泉老師、中山大學戴明泓老師與高雄大學溫秋明老師在口試中，對於論文的指教評點，使我獲益良多。感謝林園養殖場的盧尚賦老師與東港水產試驗所的李彥宏所長，熱情提供我們實驗所需之養殖池，使我們可以順利實驗。另外，也要感謝高雄海洋科技大學的鄭絢如老師及實驗室的同學們，在採樣的時大力幫忙，不分你我。感謝實驗室的夥伴雅玫，在這兩年中不時提醒我實驗容易疏忽的細節，並耐心的教我各項實驗技巧。也要感謝彥霆及昀岱、承桓及許多幫助過我的好同學們，在實驗與課業上的幫忙，使我順利度過這兩年時光。也要感謝仕成、媛婷及家緯在實驗室裡互相幫忙，並不時提供實驗室歡樂的笑聲。最後，感謝父母親對我無微不至的關懷與照顧，沒有你們的栽培就沒有今天的我，謹以此文獻給我敬愛的雙親。.

(3) 目錄中文摘要 ...................................................... 1 英文摘要 ...................................................... 3 第一章前言 ................................................... 5 1.1 血管新生之機制 ........................................... 5 1.2 血管生成素 (Angiopoietins) ................................. 6 1.2.1 (Angiopoietins-1) ......................................... 7 1.2.2 (Angiopoietins-2) ......................................... 8 1.3 血管生成素之受器-Tie (Tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains) .................... 8 1.4 血管生成素-1(Angiopoietin-1)與其受器 Tie2 結合後引發之相關訊息傳遞路徑 ............................................ 9 1.4.1 維持血管內皮細胞的的存活(survival) ....................... 10 1.4.2 血管內皮細胞的遷移(migration) ........................... 10 1.4.3 血管內皮細胞的通透性(permeability) .................... 11 1.4.4 抗發炎(anti-inflammatory)訊息傳遞 ......................... 11 1.4.5 血管成熟及進入穩定期................................... 11 1.5 Angiopoietin-1 表現的調控 ................................. 12 1.6 其它血管新生相關因子 .................................... 12 1.7 為何以日本鰻為模型 ...................................... 13 1.8 日本鰻的人工養殖及所逪遇的困難 .......................... 14 實驗目的 ................................................... 16 I.

(4) 第二章材料與方法 ............................................ 17 2.1 激素及藥品配製 .......................................... 17 2.2 日本鰻(Anguilla japonica)來源與馴養環境以及活體外源激素處理 ...................................................... 21 2.3 GSI 及 RMI 的測量 ....................................... 22 2.4 紅體細胞的取得與培養 .................................... 22 2.5 卵巢和紅體的 RNA 分離 ................................... 24 2.6 紅體細胞 RNA 分離 ....................................... 24 2.7 組織與細胞之 CDNA 的製備 ............................... 25 2.8 PCR (polymarase chain reaction)分析......................... 26 2.9 Angiopoietin -1 基因選殖 .................................. 28 2.10 Angiopoietin -1 5’/3’RACE ................................ 30 2.10.1 Angiopoietin -1 5’RACE ................................ 30 2.10.2 Angiopoietin -1 3’RACE ................................ 31 2.11 卵巢石蠟組織切片染色 ................................... 31 2.11.1 石蠟包埋............................................. 31 2.11.2 石蠟切片............................................. 32 2.11.3 石蠟切片染色......................................... 33 2.12 紅體細胞活體外(in vitro)免疫染色法(immunostaining) .......... 33 2.13 統計方法 .............................................. 34 第三章. 結果 ................................................. 35. 3.1 日本鰻 Angiopoietin -1 基因片段之擴增及分析鑑定與比對....... 35 II.

(5) 3.2 Angiopoietin -1 與相關血管生長因子在不同體重日本鰻的紅體之表現 ............................................... 35 3.3 Angiopoietin -1 與相關血管生長因子在催熟日本鰻的紅體之表現 ..................................................... 37 3.4 血管生長因子在催熟處理及合併使用睪固酮 (Testosterone)催熟日本鰻的卵巢之表現 ................................... 37 3.5 Angiopoietin -1 與相關血管生長因子在日本鰻紅體細胞無加藥刺激培養 2 至 8 週的表現 ................................. 38 3.6 Angiopoietin -1 與相關血管生長因子在紅體細胞以 PPAR agonists 處理 12 小時後的表現 ............................. 40 3.7 Angiopoietin -1 與相關血管生長因子在紅體細胞以內皮細胞生長補充劑 (ECGS；endothelial cells growth supplements)處理 12 小時、24 小時後的表現................................... 41 3.8 Angiopoietin -1 與相關血管生長因子在紅體細胞以金屬離子處理 72 小時後的表現 ...................................... 43 3.8.1 以鈷離子(Co2+)處理 72 小時後的表現....................... 44 3.8.2 以銅離子(Cu2+)處理 72 小時後的表現....................... 44 3.8.3 以鋅離子(Zn2+)處理 72 小時後的表現 ....................... 45 3.9 Angiopoietin -1 與相關血管生長因子在紅體細胞以類固醇 (steroids)處理 72 小時後的表現............................. 46 3.9.1 以睪固酮(testosterone)處理 72 小時後的表現 ................. 46 3.9.2 以雌二醇(estradiol)處理 72 小時後的表現 ................... 47 3.9.3 以黃體酮(progesterone)處理 72 小時後的表現 ................ 48 III.

(6) 3.10 Angiopoietin -1 與相關血管生長因子在紅體細胞以生長因子處理 24 小時後的表現 ................................... 49 3.10.1 以胰島素(insulin)處理 24 小時後的表現 .................... 49 3.10.2 以吳郭魚類胰島素生長因子-1(Tilapia insulin-like growth factor-1)處理 24 小時後的表現 ........................... 50 3.10.3 以鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor)處理 24 小時後的表現 .................................... 51 圖表 ....................................................... 53 第四章討論 ................................................. 132 4.1 Angiopoietin -1 日本鰻的組織分佈 ........................ 132 4.2 Angiopoietin -1 與相關血管生長因子在不同體重日本鰻之紅體的表現 .............................................. 132 4.3 催熟處理對於日本鰻紅體之 Angiopoietin -1 與相關血管生長因子的表現 .............................................. 133 4.4 催熟處理及合併使用睪固酮催熟日本鰻之卵巢對於 Angiopoietin -1 與相關血管生長因子的表現 ................. 134 4.5 紅體細胞無加藥刺激培養 2 至 8 週，Angiopoietin -1 與相關血管生長因子表現 ........................................ 135 4.6 紅體細胞以 PPAR agonists 處理 12 小時，Angiopoietin -1 與相關血管生長因子表現 .................................... 136 4.7 紅體細胞以內皮細胞生長補充劑 (ECGS)處理 12 小時、24 小時，Angiopoietin -1 與相關血管生長因子表現 ............... 137 IV.

(7) 4.8 紅體細胞以金屬離子處理 72 小時，Angiopoietin -1 與相關血管生長因子表現 .......................................... 138 4.8.1 以鈷離子(Co2+)處理..................................... 138 4.8.2 以銅離子(Cu2+)處理..................................... 139 4.8.3 以鋅離子(Zn2+)處理 ..................................... 139 4.9 紅體細胞以類固醇(Steroids)處理 72 小時，Angiopoietin -1 與相關血管生長因子表現 .................................... 140 4.9.1 以睪固酮(testosterone)處理 ............................... 140 4.9.2 以雌二醇(estradiol)處理 ................................. 140 4.9.3 以黃體酮(progesterone)處理 .............................. 141 4.10 在紅體細胞以生長因子處理 24 小時，Angiopoietin -1 與相關血管生長因子的表現 ..................................... 142 4.10.1 以胰島素(insulin)處理 .................................. 142 4.10.2 以鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor)處理 .................................................. 142 4.10.3 以吳郭魚類胰島素生長因子-1(Tilapia insulin-like growth factor-1)處理 ......................................... 143 總結 ...................................................... 145 未來展望 .................................................. 148 第五章參考文獻 ............................................. 149. V.

(8) 表目錄表 1. 日本鰻紅體細胞以外加因子處理後血管新生相關因子表現 .... 55. VI.

(9) 圖目錄圖 1. 分析引子 Cytochrome-b 作聚合酶連鎖反應(PCR)之循環數 ..... 56 圖 2. 分析引子 Angiopoietin-1 作聚合酶連鎖反應(PCR)之循環數 .... 57 圖 3. 分析引子 VEGF 作聚合酶連鎖反應(PCR)之循環數 ........... 58 圖 4. 分析引子 FLK 作聚合酶連鎖反應(PCR)之循環數 ............ 59 圖 5. 分析引子 Eph 作聚合酶連鎖反應(PCR)之循環數 ............. 60 圖 6. Angiopoietin-1 的結構 .................................... 61 圖 7. 血管系形成與血管新生示意圖 ............................ 62 圖 8. 血管內皮細胞、周邊細胞與頂細胞示意圖 .................. 63 圖 9. Angiopoietin-1 / Tie 訊息傳遞路徑 .......................... 64 圖 10. Notch 訊息傳遞路徑 .................................... 65 圖 11. VEGF/FLK 與 Notch/DLL-4 訊息傳遞路徑與血管新生的關係 .. 66 圖 12. 日本鰻 Angiopoietin-1 核酸序列 .......................... 67 圖 13. 日本鰻 Angiopoietin-1 胺基酸序列 ........................ 68 圖 14. Angiopoietin-1 之物種樹狀親緣分析 ....................... 69 圖 15. Angiopoietin-1 在日本鰻之組織分布 ....................... 70 圖 16. 不同體重日本鰻之體重與 RMI 值......................... 71 圖 17. 不同體重日本鰻之體重與紅體 Angiopoietin-1 表現量 ........ 72 圖 18. 不同體重日本鰻之體重與紅體 VEGF 表現量 ............... 73 圖 19. 不同體重日本鰻之體重與紅體 FLK 表現量................. 74 圖 20 不同體重日本鰻之體重與紅體 Eph 表現量 ................. 75 圖 21. 不同體重日本鰻之體重與紅體 Podo 表現量 ................ 76 圖 22-1. 不同體重日本鰻之個體紅體之 RMI 值與 VEGF 表現量 ..... 77 VII.

(10) 圖 22-2. 不同體重日本鰻之個體紅體之 RMI 值與 FLK 表現量 ...... 77 圖 23. 不同體重日本鰻之個體紅體之 RMI 值與 EPH 表現量 ........ 78 圖 24-1. 不同體重日本鰻之個體紅體之 Podo 表現量與 Angiopoietin-1 表現量 ................................. 79 圖 24-2. 不同體重日本鰻之個體紅體之 Podo 表現量與 VEGF 表現量 .................................................. 79 圖 25. 以腦下垂體萃取液催熟雄鰻的紅體之 RMI 值............... 80 圖 26. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的紅體之 RMI 值............... 81 圖 27. 以腦下垂體萃取液催熟雄鰻的紅體之 Angiopoietin-1 表現量 .. 82 圖 28. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的紅體之 Angiopoietin-1 表現量 .. 83 圖 29. 以腦下垂體萃取液催熟雄鰻的紅體之 Angiopoietin-1 表現量與 RMI 值 ............................................ 84 圖 30. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的紅體之 Angiopoietin-1 表現量與 RMI 值 ............................................ 85 圖 31. 以腦下垂體萃取液催熟雄鰻的紅體之 VEGF 表現量與 RMI 值 ................................................... 86 圖 32. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的紅體之 VEGF 表現量與 RMI 值 ................................................... 87 圖 33. 以腦下垂體萃取液催熟雄鰻的紅體之 FLK 表現量與 RMI 值 .. 88 圖 34. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的紅體之 FLK 表現量與 RMI 值 .. 89 圖 35. 以腦下垂體萃取液催熟雄鰻的紅體之 Podo 表現量與 RMI 值 ..................................................... 90 圖 36. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的紅體之 Podo 表現量與 RMI 值 VIII.

(11) ....................................................... 91 圖 37. 以腦下垂體萃取液催熟雄鰻的紅體之 Eph 表現量與 RMI 值 .. 92 圖 38. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的紅體之 Eph 表現量與 RMI 值 .. 93 圖 39. 以腦下垂體萃取液催熟雄鰻的紅體之 DLL-4 表現量與 RMI 值 ................................................... 94 圖 40 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的紅體之 DLL-4 表現量與 RMI 值 ................................................... 95 圖 41. 以腦下垂體萃取液催熟雄鰻的紅體之 Adam 表現量與 RMI 值 ................................................... 96 圖 42. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的紅體之 Adam 表現量與 RMI 值 ................................................... 97 圖 43. 以腦下垂體萃取液催熟雄鰻的紅體之 VEGF 表現量與 Angiopoietin-1 表現 .................................... 98 圖 44. 以腦下垂體萃取液催熟雄鰻的紅體之 VEGF 表現量與 Podo 表現 ................................................. 99 圖 45. 以腦下垂體萃取液催熟雄鰻的紅體之 VEGF 表現量與 Eph 表現 .................................................. 100 圖 46. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的紅體之 VEGF 表現量與 Angiopoietin-1 表現 ................................... 101 圖 47. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的紅體之 VEGF 表現量與 Podo 表現 ................................................ 102 圖 48. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的紅體之 Angiopoietin-1 表現量與 Podo 表現 ......................................... 103 IX.

(12) 圖 49. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的卵巢之 GSI 值 .............. 104 圖 50. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的卵巢之 Angiopoietin-1 表現量與 GSI 值 ............................................ 105 圖 51-1. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的卵巢之 VEGF 表現量與 GSI 值 ................................................ 106 圖 51-2. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的卵巢之 FLK 表現量與 GSI 值 ................................................ 106 圖 52-1. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的卵巢之 Podo 表現量與 GSI 值 ................................................ 107 圖 52-2. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的卵巢之 Eph 表現量與 GSI 值 .................................................. 107 圖 53-1. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的卵巢之 DLL-4 表現量與 GSI 值 ................................................ 108 圖 53-2. 以腦下垂體萃取液催熟雌鰻的卵巢之 Adam 表現量與 GSI 值 ................................................ 108 圖 54. 以腦下垂體萃取液與睪固酮催熟雌鰻的卵巢之 GSI 值 ...... 109 圖 55. 以腦下垂體萃取液與睪固酮催熟雌鰻的卵巢之 VEGF 表現量 .................................................... 110 圖 56. 以腦下垂體萃取液與睪固酮催熟雌鰻的卵巢之 FLK 表現量 ...111 圖 57. 以腦下垂體萃取液與睪固酮催熟雌鰻的卵巢之 Podo 表現量 . 112 圖 58. 以腦下垂體萃取液與睪固酮催熟雌鰻的卵巢之 Eph 表現量 .. 113 圖 59. 以腦下垂體萃取液與睪固酮催熟雌鰻的卵巢之 DLL-4 表現量 .................................................... 114 X.

(13) 圖 60. 以腦下垂體萃取液與睪固酮催熟雌鰻的卵巢之 Adam 表現量 .................................................... 115 圖 61. 紅體細胞無加藥刺激培養 2 至 8 週之 Angiopoietin-1 與相關生長因子表現 ........................................ 116 圖 62. 紅體細胞以 PPAR agonists (10-5M) 處理 12 小時之 Angiopoietin-1 與相關因子表現 ......................... 117 圖 63-1. 紅體細胞以內皮細胞生長補充劑(ECGS)處理 12 小時、24 小時之 Angiopoietin-1、VEGF 與 FLK 表現 ............. 118 圖 63-2. 紅體細胞以內皮細胞生長補充劑(ECGS)處理 12 小時、24 小時之 Podo、DLL-4、Adam 與 Eph 表現 .............. 119 圖 64. 紅體細胞以二價鈷離子處理 72 小時之 Angiopoietin-1 與相關因子表現 ............................................ 120 圖 65. 紅體細胞以二價銅離子處理 72 小時之 Angiopoietin-1 與相關因子表現 ............................................ 121 圖 66. 紅體細胞以二價鋅離子處理 72 小時之 Angiopoietin-1 與相關因子表現 ............................................ 122 圖 67. 紅體細胞以不同濃度睪固酮處理 72 小時之 Angiopoietin-1 與相關因子表現 ........................................ 123 圖 68. 紅體細胞以不同濃度黃體酮處理 72 小時之 Angiopoietin-1 與相關因子表現 ........................................ 124 圖 69. 紅體細胞以不同濃度雌二醇處理 72 小時之 Angiopoietin-1 與相關因子表現 ........................................ 125 圖 70. 紅體細胞以不同濃度胰島素處理 24 小時之 Angiopoietin-1 與 XI.

(14) 相關因子表現 ........................................ 126 圖 71. 紅體細胞以不同濃度 IGF-1 處理 24 小時之 Angiopoietin-1 與相關因子表現 ........................................ 127 圖 72. 紅體細胞以不同濃度 bFGF 處理 24 小時之 Angiopoietin-1 與相關因子表現 ........................................ 128 圖 73-1. 以 PPAR beta agonist 處理 12 小時之紅體細胞， Angiopoietin-1 細胞免疫螢光染色 ..................... 129 圖 73-2. 以 bFGF 處理 24 小時之紅體細胞，Angiopoietin-1 細胞免疫螢光染色 ........................................ 129 圖 74-1. 以胰島素處理 24 小時之紅體細胞，Angiopoietin-1 細胞免疫螢光染色 ........................................ 130 圖 74-2. 以 IGF-1 處理 24 小時之紅體細胞，Angiopoietin-1 細胞免疫螢光染色 ........................................ 130 圖 75. 以腦下垂體萃取液催熟 0 針及 9 針與合併注射睪固酮 9 針之雌鰻的卵巢之 VEGF 蛋白質表現量 ...................... 131. XII.

(15) 日本鰻血管生成素(Angiopoietin) -1 基因選殖與血管新生相關因子在紅體組織及卵巢表現調控之研究指導教授: 施能朗博士、黃永森博士國立高雄大學生物科技研究所學生:張宸瑋國立高雄大學生物科技研究所摘要血管新生為動物體內一受到高度調控之生理功能。在外在環境刺激，如: 傷口癒合、缺氧等情形下，刺激血管內皮細胞活化多種血管生長因子表現。其中血管生成素-1 在血管新生後期與其受器結合後，可活化 PI3K-Akt 等多種訊息傳遞路徑，誘導血管成熟相關功能表現，故推測血管生成素-1 與血管之生長分化和成熟有關。本研究以斑馬魚血管生成素-1 mRNA 序列為標的來設計引子，選殖日本鰻(Anguilla japonica)血管生成素 -1 的部份片段(812 bps)。其胺基酸序列與斑馬魚血管生成素-1 有 80%的相似性，採用選殖出之片段設計引子並運用聚合酶連鎖反應分析鰻魚組織及活體外細胞之血管生成素 -1 表現量，以日本鰻之 Angiopoietin-1(Ang-1) mRNA 序列探討血管生成素-1 與相關血管生長因子在此類原始脊椎動物出生後，發育成熟至可降海繁殖階段的生理功能。在活體(in vivo)實驗有三部分，一、取樣體重 100 克至 400 克之日本鰻，並分析其紅體組織的相關血管生長因子表現量，發現體重 300 克至 400 克組別，血管生成素-1 mRNA 表現量最高，顯示在體型較大之日本鰻其血管生成素-1 表現較多。推測在體型較大鰻魚之血管新生較趨近成熟。二、日本鰻每週注射鯰魚腦下垂體萃取液催熟(Catfish Pituitary Exacts, CPE)，於第 0 週、第 3 週、第 6 週、第 9 週後取紅體組織分析。血管生成素-1 在第六週表現達高峰且與紅體生長呈正相關。推測在催熟後血管生成素-1 表現逐漸達高 1.

(16) 峰。三、日本鰻每週注射鯰魚腦下垂體萃取液催熟，於第 0 週、第 3 週、第 6 週、第 9 週後取卵巢分析，並由其中隨機挑出十隻合併注射睪固酮，發現僅注射腦下垂體萃取液組別其相關血管生長因子與 GSI 值呈負相關，但合併注射睪固酮 9 針之組別與注射腦下垂體萃取液 9 針之組別，GSI 值有明顯提升且各血管生長因子表現亦增加，顯示睪固酮可刺激卵巢內血管生長因子表現而促進卵巢發育。在活體外(in vitro)實驗部分，日本鰻初代紅體細胞以不同濃度 PPAR agonists、內皮細胞生長補充劑(ECGs)、類固醇、生長因子、金屬離子等處理特定時間後，調查紅體細胞內血管生成素-1 及相關生長因子受調控情形。發現 PPAR γ agonist 刺激 VEGF 表現; ECGs 刺激 Ang-1、VEGF 與 FLK 表現; 鋅離子亦可刺激 Ang-1、VEGF 與 FLK 等因子表現; 鈷離子只能刺激 VEGF 表現;睪固酮刺激 Ang-1 但抑制 VEGF;黃體酮刺激 Ang-1 與 FLK;雌二醇刺激 Ang-1、FLK 與 podocalyxin;胰島素刺激 Ang-1 與 VEGF 表現; IGF-1 刺激 Ang-1、Eph 與 podocalyxin; bFGF 刺激 Ang-1 與 VEGF 表現。了解日本鰻的紅體與卵巢血管新生過程中，血管生成素-1 等因子所扮演角色，期望未來能將血管生成素-1 製成重組蛋白以改善日本鰻人工繁殖中，由於血管生長不完全而導致卵巢發育不良與幼鰻發育缺陷的問題。. 關鍵字: 血管生成素-1、血管新生、血管內皮細胞、腦下垂體萃取液、紅體. 2.

(17) Cloning of Angiopoietin-1 gene and study of the regulation on angiogenic factors in the rete mirabile and ovary in Japanese eel (Anguilla japonica) Advisors: Dr. Neng-Lang Shih、Dr. Yung-Sen Huang Institute of Biotechnology National University of Kaohsiung Student: Chen-Wei Chang Institute of Biotechnology National University of Kaohsiung ABSTRACT Angiogenesis is a highly regulated physiological process in animals. Among the different angiogenic factors, angiopoietin-1 combines with its receptor to induce many signal transduction pathways related to vessel maturation including PI3K-Akt pathway in late phase of angiogenesis, which maintain endothelial cells survival through anti-apoptosis function, recruit pericytes supplements and migration and make compact interaction with vessel tubes. Angiopoietin-1 is highly associated with vessel maturation. We designed degenerate primers from Angiopoietin-1 of zebrafish and cloned a part of nucleic sequence from Anguilla japonica (812 bp), and its amino acid sequence has 80% similarity with Angiopoietin-1 of zebrafish. I used this segment to design specific primers to analyze Angiopoietin-1 expression in tissue or cells of Anguilla japonica with polymerase chain reaction (PCR), investigating physiological function of Angiopoietin-1 and relating angiogenic factors during development after birth in such a primitive vertebrate.. 3.

(18) In in vivo experiments - I sampled Anguilla japonica that weight range from 100g to 400g and then analyzed Angiopoietin-1 and relating angiogenic factors expression in the rete mirabile. And I found that Angiopoietin-1 express uppermost in the group that weight range from 300g ~ 400g, it suggests Angiopoietin-1 express higher in the larger eels and their angiogenesis is near to maturation. 2. Rete mirabile from Anguilla japonica injected with catfish pituitary exacts (CPE) once every week, and sampled on the week one、week three、 week six、week nine. After analyzing, we found Angiopoietin-1 increase gradually and express uppermost on the sixth week and decrease on the ninth week. We suggest Angiopoietin-1 express higher in the late phase of injecting CPE to promote vessel maturation in rete mirabile. 3. Japanese eel injected with CPE once every week, and sampled on the week one、week three、week six、week nine. The expression of Ang-1 and other angiogenic factors decrease with increasing GSI index, but the GSI index increase obviously and angiogenic factors expression rescue in the group that extra injecting testosterone. It reveals that testosterone may stimulate angiogenic factor activity and promote ovary growth. In in vitro, rete mirabile cells were treated with various PPAR agonists、endothelial cell growth supplement (ECGs)、steroid、growth factor、metal ions, and we investigate how Angiopoietin-1 and relating angiogenic factors being regulated. We expect to find out the characters of Angiopoietin-1 and other angiogenic factors during angiogenesis in the rete mirabile and ovary from Anguilla japonica. Furthermore, we apply to solve the problem in eel artificial reproduction due to incomplete blood vessel development. Keywords: angiopoietin-1, angiogenesis, endothelial cells, Catfish Pituitary Exacts (CPE), rete mirabile. 4.

(19) 第一章、前言血管新生(angiogenesis)為高度調控的過程。在正常生理情況，如:發育期、生殖期與傷口癒合狀態下，和某些疾病，包括:癌症、糖尿病性視網膜病變、類風濕性關節炎等，都扮演相當重要的角色。初生血管叢 (primary vascular plexus)必須受到局部刺激活化血管生長因子表現，促進血管內皮細胞大量增殖並向外遷徙才會形成血管分支。血管新生後期，血管周邊細胞(pericytes)與血管內皮細胞形成緊密的細胞接合，與血管脈形成穩定包覆而達到成熟 (Risau, 1997) 。目前已知的血管生成因子有 VEGF (vasalcular endothelial growth factor)、FGF (fibroblast growth factor)、 TGF-β(transforming growth factor-β)、PDGF (platelet-derived growth factor)和 Angiopoietins-1 (Otrock et al., 2007)。其中 Angiopoietin-1 在血管新生後期的功能顯著，將 Angiopoietin-1 基因剔除之小鼠胚胎在胚胎發育第 12 天時雖然初生血管叢有形成，但缺少高度分支結構且血管管脈與周邊細胞間接合不良(Suri et al., 1996)。此外，因 Angiopoietin-1 不具有活化蛋白酶 (protease)以分解基底膜(basement membrane)的特性，故使血管內皮細胞累積在局部而造成血管直徑增加(Rudge et al., 2005)。在哺乳類動物血管新生後期 Angiopoietin-1 所活化之訊息傳遞路徑與血管成熟有關，在日本鰻紅體血管中，我們推測 Angiopoietin-1 亦有類似角色。. 1.1 血管新生之機制動物體內各器官及組織遍佈血管網以供應充足之氧氣與養份，及傳遞各類化學訊息分子至各個細胞以完成各項生理功能。在胚胎發育時期，. 5.

(20) 旺盛之血管形成稱為血管系形成(vasculogenesis) 。由中胚層細胞 (mesodermal cells)分化形成血管內皮細胞與血管母細胞(hemangioblasts)，血管母細胞再形成 angioblasts，聚集形成血島 (blood islands)，各血島群融合形成初生血管叢 (primary vascular plexus)，此時微血管已有形成動脈或靜脈的特性 (Coultas et al., 2005)。(圖 7.) 次階段的血管新生以初生血管叢為基礎，在受到環境刺激後，向外形成更廣泛的分支血管網絡。首先 VEGF 刺激血管內皮細胞增殖並活化 Matrix metalloproteinases (MMPs)以分解細胞之基底膜，以利血管內皮細胞遷移並聚集形成管狀結構。VEGF 被刺激分泌後，有一群細胞稱為”頂細胞(tip cells)”之內皮細胞，受到 VEGF 濃度影響而導引血管內皮細胞向所需之方向生長(圖 8.)。頂細胞會產生外部構造變化，並先佔據新血管生長的空間，引導血管內皮細胞移動的方向及空間，以利管脈形成 (Golding et al.,2003) 。由於血管脈的生成，使血流通過並攜帶氧氣，使缺氧狀態消失而降低 VEGF 表現量，因而使血管內皮細胞停止增殖遷移。進入後期成熟階段，頂細胞停止遷移並與血管脈結合緊密，血管脈與周邊細胞 (pericytes)、平滑肌細胞(smooth muscle cels)、纖維母細胞(fibroblasts)形成緊密的結合包覆。依微血管特性不同 (如: 動脈需承受較大血壓故其平滑肌細胞比例需增加) ，管脈外包覆之細胞型態組成比例會有所差異。. 1.2 血管生成素 (Angiopoietins) 血管生成素(Angiopoietins)於 1990 年代中期被確立。人類有 Angiopoietin-1 (Ang-1)、Angiopoietin-2 (Ang-2)、Angiopoietin-3 (Ang-3)、. 6.

(21) Angiopoietin-4 (Ang-4)四類。其組成由 N 端之 coiled-coiled domain 與 C 端之 fibrinogen-like domain 兩大功能性結構所組成(圖 6.)。coiled-coiled domain 主要參與配體多聚化( ligand multimerization )。Ang-1 與 Ang-2 可形成三聚體(trimer)以上之異源多聚體 (multimer) (Kim et al.,2005)，為活化受器所必須，而 C 端之 fibrinogen-like domain 為與受器結合的結構 (Wong et al., 2007)。Angiopoietin-3 主要表現於嚙齒類，Angiopoietin-4 主要表現於人類肺部，其中以 Angiopoietin-1、Angiopoietin-2 相關研究較多，兩者結構相似度高(約 60%)，且皆與受器 Tie2(1.3 節有詳述)有高度親和力，故會競爭受器結合位。依其細胞類型或局部環境的差異， Angiopoietin-2 可選擇性作為 Angiopoietin-1 的增效劑(agonist)或拮抗劑 (antagonist) (Maisonpierre et al, 1997)，但兩者相互調控 Tie 2 確切機制目前尚不明(Paul et al., 1999) 。. 1.2.1 Angiopoietin-1 在小鼠研究中 Angiopoietin-1 分子量約為 75 kDa，其基因位於小鼠 8q22 染色體上(Jones et al., 1997) 。由平滑肌細胞與其他周邊細胞所分泌之，對於血管內皮細胞作用為旁分泌 (paracrine)，亦存在於視神經元細胞內(Risau et al., 1998)。有四種 splice variants，其中 1.5 kb 與 1.3 kb 之 mRNA splice variants 所轉譯出之蛋白質與受器結合，最後會引發受器自磷酸化(autophosphorylation) (Lin et al., 2005)。將 Angiopoietin-1 基因剔除後的小鼠在胚胎期第 11 天至第 12 天會死亡(Suri et al., 1996)。其症狀為血管周邊細胞相當稀少且血管網發育不良，與 Tie2 受器基因剔除後有類. 7.

(22) 似特徵，證實 Angiopoietin-1 與血管成熟有重要關聯性。在血管新生後期主要調控周邊細胞的遷移、細胞間連結與血管內皮細胞活性之因子為 Angiopoietin-1，與 VEGF、FLK 等相關血管生長因子在血管新生前期的功能相互協調制衡，以維持正常血管生成(Wakui et al., 2006)。. 1.2.2 Angiopoietin-2 在小鼠研究中 Angiopoietin-2 分子量約為 75 kDa，其基因位於小鼠 8q23 染色體上(Jones et al., 1997) 。儲存於血管內皮細胞的 Weibel-Palade bodies (WPB) (Fiedler et al., 2004)，透過自分泌(autocrine)與血管內皮細胞作用。也存在於視網膜神經元細胞內(Ozaki et al., 2000)。血管新生為一受到精密調控的過程，一般在正常成體內血管處於穩定狀態，研究指出 Ang-2 會因缺氧而受到正向調控(Oh et al., 1999)，在正常生理或某些病理情況(如: 癌細胞)下，外在刺激形成時 Ang-2 與 VEGF 共同調控血管進入不穩定期，可拮抗 Ang-1 所維持之血管穩定狀態，Angiopoietin-2 使周邊細胞與內皮細胞間的細胞連結(cell junction)鬆散以利血管向外分支生長，加上 VEGF 作用使內皮細胞生長並向外遷徙，血管便停止生長並與周邊細胞重新結合，重新進入穩定期。但在缺乏 VEGF 情形下，Angiopoietin-2 會使血管退化，甚至產生細胞凋亡的現象(Suri et al., 1997)。. 1.3 血管生成素之受器-Tie (tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains ). 8.

(23) Tie 受器分為 Tie1 及 Tie2 兩種。Tie1 約 135 kDa，Tie 2 約 150 kDa，皆屬於酪胺酸激酶受器(receptor tyrosine kinase)家族(Risau et al., 1993)。其細胞外結構由包含三個側邊接有 immunoglobulin (Ig) –like domain 之 EGF (epidermal growth factor) homology domain 2 與三個 fibronectin type III (FNIII) repeats 所組成。Tie1 和 Tie2 之細胞外結構(extracellular domain) 相似度約 33%，其中 Tie 2 受器中第一個 Ig - like domain 與 EGF homology domain 2 為和 Ang-1 和 Ang-2 結合的重要結構(Koidl et al., 2003)。而 Tie 受器之細胞內結構包含許多磷酸化與蛋白質結合位(Shewchuk et al., 2000)，細胞內酪胺酸激酶結構相似度達 76% ( Fiedler et al., 1996)。Tie1 及 Tie2 受器主要表現於血管內皮細胞及淋巴內皮細胞上，在胚胎期即有表現(Dumont et al., 1992)，Tie2 在胚胎發育期第 7.5 天；Tie1 在胚胎發育期第 8 天，少數研究發現在其他組織或某些疾病中，包括平滑肌細胞、纖維母細胞、單核球、神經元細胞等(Nakayama et al., 2005) 亦存在。在小鼠胚胎時期將 Tie2 受器基因剔除後，發現在胚胎發育第八天至第九天時，由於多重組織的血管畸形而造成個體死亡(Sato et al., 1995)，或造成血管內皮細胞凋亡而導致局部缺血(Jones et al., 2001)，與 Ang-1 基因剔除後有類似結果，故 Ang-1/Tie2 系統對於血管新生與成熟之相關訊息傳遞有其重要性，研究推測 Tie 2 在血管新生時大量表現，並與 Ang-1 結合後自磷酸化活化細胞內訊息傳遞路徑，提供血管網形成所需的因子與並鞏固其結構穩定性。. 1.4 血管生成素-1 (Angiopoietin-1) 與其受器 Tie 2 結合後引發. 9.

(24) 之相關訊息傳遞路徑 Angiopoietin-1 與 Tie2 結合後，會引發一系列與血管內皮細胞與血管周邊細胞遷徙(cell migration) (Fujikawa et al., 2002) (Graupera et al., 2008)、細胞間交互作用(cell-cell interaction)、抗細胞凋亡(anti-apoptosis) (Papapetropoulos et al., 2000)、抗通透性(anti-permeability) (Gavard et al., 2008)及抗發炎(anti-inflammatory) (Tadros et al., 2003)等相關之訊息傳遞路徑。. 1.4.1 維持血管內皮細胞的存活 (survival) Ang-1 與 Tie2 受器結合後導致 Tie2 自磷酸化，使接合蛋白 GRB 2 (receptor-bound protein 2)不斷補充且將 PI3-kinase 的 p85 次單位磷酸化 (Jones et al., 1999)，增加 PI3-kinase 的表現，使 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2)磷酸化形成 Phosphatidylinositol (3,4,5) trisphosphate (PIP3)，磷酸根再轉移至蛋白激酶 Akt 之活化位 Thr 308 與 Ser 473 的 COOH 端(Downward, 1995)，活化 Akt 而增加 survivin 與 eNOS (endothelial Nitric Oxide Synthase)表現並抑制 caspase 9 和 BAD (Bcl-2-associated death promoter)，以維持血管內皮細胞活性。若將 PI3K-AKT 路徑抑制後，會活化 FOXO1(forkhead transcription factor)使 Ang-2 表現增加以拮抗 Ang-1，使血管內皮細胞處於不穩定狀態。. 1.4.2 血管內皮細胞的遷移 (migration) Ang-1 與 Tie2 受器結合後，Tie2 自磷酸化後活化 PI3K 路徑，使接合. 10.

(25) 蛋白 GRB 14 與 SHP 2(SH2 domain-containing Tyr phosphatase 2)的不斷補充，另外 Dok-R (Dok-related docking protein)與接合蛋白 NCK2 與 PAK (p21-activated kinase)引發 Ras signaling，為調控細胞骨架以促進細胞遷徙主要訊息傳遞路徑。. 1.4.3 血管內皮細胞的通透性 (permeability) 血管內皮細胞間之細胞連結有 adheren junction 與 tight junction，兩者調控內皮細胞與周邊細胞間的通透性。Ang-1 與 Tie2 受器結合後可刺激 GTPase RhoA 及活化其下游效應蛋白(effector protein)- mDia(mammalian diaphanous)，mDia 會與 VEGF 受器 FLK 引發的下游因子- Src 酪胺酸激酶結合，抑制 VEGF 對血管之通透性，使血管內皮細胞間連結較緊密。. 1.4.4 抗發炎(anti-inflammatory)訊息傳遞 Ang-1 與 Tie2 受器結合後亦刺激 ABIN-2 蛋白表現以干擾 zinc-finger 蛋白- A20 以抑制發炎(inflammatory)反應(Jeon et al., 2003)。. 1.4.5 血管成熟及進入穩定期維持血管內皮細胞與周邊細胞之穩定結合為血管進入靜止期的重要表徵，Tie2 磷酸化後可不斷補充周邊細胞並調控其遷徙，使與內皮細胞結合緊密。此外 Tie2 活化後引發 HB-EGF(endothelial heparin-binding epidermal-like growth factor)，HB-EGF 以旁分泌方式刺激平滑肌細胞遷徙 (Kobayashi et al., 2006)，另外 HGF (hepatocyte growth factor)與 serotonin. 11.

(26) 也媒介 Ang-1 引起之平滑肌細胞向內皮細胞遷移途徑 (Sullivan et al., 2003)。除了 Angiopoietin-1 外，PDGF ( platelet-derived growth factor)對於周邊細胞遷移及補充亦有重要貢獻，但 Ang1/Tie2 與 PDGF/PDGFR 系統間無任何因子與兩系統皆有關連，將 PDGF 訊息傳遞以抗體抑制，期望能減少周邊細胞存在，但發現在 Ang1/Tie2 系統在此情形下仍可補充血管成熟所需之周邊細胞，維持血管成熟 (Uemura et al., 2002) 。. 1.5 Angiopoietin-1 表現的調控相關研究指出，在牛的視網膜周邊細胞中，缺氧環境不只能活化 VEGF，並且可刺激 Angiopoietin-1 及 Tie2 的表現(Park et al., 2003)。類固醇也會經由血管內皮細胞的細胞膜上特異性受體作用(Suzuki et al., 2003)，而引發一連串的信息傳遞，會活化 G protein (GTP binding protein)並產生 GTP，進行一連串的信息傳遞(Suzuki et al., 2003) ; 當血管內皮細胞受到傷害時，會分泌細胞激素，如 tumor necrosis factor-α (TNF-α)、 interleukin-1α (IL-1α)、interleukin-8 (IL-8)等，因為白血球上有細胞激素受體，因此白血球與細胞激素結合，引發一連串的發炎反應(Rietschel et al., 1996)，而在人類血管平滑肌細胞中 IL-1α 負調控 Angiopoietin-1 並使 Tie2 去磷酸化 (Fan et al., 2004) 。. 1.6 其他血管新生相關因子 VEGF 是血管內皮細胞生長的重要因子，藉由與酪胺酸激酶受體FLK 結合，可活化 PI3K-Akt 等訊息傳遞路徑，調控血管內皮細胞增生、血管. 12.

(27) 新生、脈管生成和血管通透(Klagsbrun and D’Amore, 1996)。Eph receptor 為酪胺酸激酶受體的一種，與配體 Ephrins 結合作用後，活化 PI3K -Akt 等路徑而刺激內皮細胞生長、遷移與神經元發育，對於胚胎發育及血管系形成與早期血管新生皆有貢獻(Brantley et al., 2002) 。另外，Notch 為一穿膜受器，與配體 DLL-4 (Delta-like 4)結合後，首先經由 Adam10 (A Disintegrin And Metallopeptidase 10) 在 N 端穿膜區域產生蛋白水解 (proteolytic)，接著γ-secretase 將 DLL-4 次單位釋放出，移動至細胞核內活化與細胞連結相關轉錄作用途徑(Ndiaye et al., 2003)，以維持血管穩定性，在視網膜血管內皮細胞研究中，VEGF 可誘導 DLL-4 表現，DLL-4 作為一負回饋調控因子以平衡由 VEGF 引起之正向信息(positive signal)， VEGF/FLK 與 Notch/DLL-4 信息傳遞系統分別有不同的作用，共同調控血管新生(Lobov et al., 2007) (圖 10.)。. 1.7 為何以日本鰻為模型鰻魚屬於鰻鱺科(Anguillidae)，鰻屬(Anguillus)，演化上屬於原始脊椎動物，生長到不同時期時會有變態發生而改變外觀。在卵孵化之後，最先形成柳葉鰻(letocephalus)，然後變態成玻璃鰻(glass eel)、再來是鰻線 (elvers)、黃鰻(yellow eel)，最後再變態成銀鰻(silver eel)而成熟後降海產卵(Tzeng et al., 2000)，因其特殊的生活史，使鰻魚體型和外觀改變，其體內各項生理機能也隨之改變，其中較有明顯變化的是紅體 (rete mirabile)，紅體位於魚鳔內，由許多動脈和靜脈的微血管網組成，為調控魚類氣體分泌的一個器官，由於鰻魚要降海繁殖時，魚鰾必須變大來應. 13.

(28) 付深海高壓力的環境，因此紅體內微血管也會跟著增生，紅體也跟著變大(Yamada et al., 2001)。因為紅體血管內皮細胞較易取得，所以非常適合做為血管新生研究的模型(Garrick, 2000)。另外，雌鰻卵巢隨降海繁殖而 (Muller et al., 發育成熟。由於血管新生，可觀察到鰻魚的卵巢裡佈滿微血管 2004)，因此，鰻魚卵巢是活體(in vivo)研究血管新生很好的模型。. 1.8 日本鰻的人工養殖及所遭遇的困難日本鰻為台灣重要的養殖魚種之一，養鰻產業極度依賴天然鰻線之供給，形成產業發展上之主要瓶頸。近年來受到河川污染、水庫建造、棲息地被破壞，氣候變遷以及天然鰻線過漁等諸多因素的影響，導致鰻線產量之長期趨勢有下降之現象 (Tzeng et al., 1995)。因此，進行日本鰻人工繁殖技術的研發，為鰻魚養殖產業永續發展之關鍵所在。但不論是捕獲之野生或人工飼養之鰻，皆無法在人為環境下自然成熟，此一特徵使得鰻魚人工催熟必須依賴長期注射異源性激素，方能強迫鰻魚生殖腺的進一步發育、成熟。探討鰻魚人工繁殖迄今未能突破的原因，可能有以下因素: 1. 鰻魚之催熟過程冗長，導致受精率與孵化率之不穩定: 以異源性激素直接刺激生殖腺的發育，然而性腺的發育是需要精準的調控，因此卵質的優劣不太穩定。一般對其他魚類採行的人工催熟方法，係先使其能自行發育至成熟階段，然後再以高劑量的異源性激素促使其進入最後成熟階段，而達到排卵的目的，在此情況下卵的品質無虞。至於鰻魚則否，要達到自行發育至成熟階段，只能依靠長期多次的注射異源性促性腺激. 14.

(29) 素催熟。利用此種方式催熟所得到之卵粒，可能本身即有缺陷，因此即使能受精孵化，仔魚的正常發育也受到某種影響。 2. 仔魚的生長不穩定: 在得到受精卵後，孵化及仔魚的培育即成為另一種重要的課題，人工培育之仔魚可能有某些方面之缺陷，則可能是人工培育環境並無法滿足仔魚之生長需求(韓等, 2003)。此外，在鰻魚人工繁殖過程中，其胚胎在14天內死亡率相當高，推測可能與胚胎內血管發育不完全，可能為其中因素之一，需進一步的探討改進，以達改善之目的。. 15.

(30) 實驗目的在許多哺乳類動物相關研究中了解 Angiopoietin-1 為血管生成和血管新生的必須調控因子，尤其與血管新生後期成熟階段有關，故進一步探討 Angiopoietin-1 在日本鰻此類較原始的脊椎動物中，在長時間的演化下，出生後發育的生理功能，在紅體組織與卵巢發育時所扮演的角色，以了解 Angiopoietin-1 是否在血管新生後期表現情形與 VEGF 等因子是否有所差異。此外，探討紅體細胞活體外培養中，受外在因子(如: 類固醇、生長因子、金屬離子…等)調控後，Angiopoietin-1 與相關血管生長因子的表現情形，以確立 Angiopoietin-1 在日本鰻紅體之血管新生所扮演的角色，期望未來能應用於鰻魚催熟以改善日本鰻人工繁殖，因血管生長不完全而導致卵巢發育不良與幼鰻發育缺陷的問題。. 16.

(31) 第二章、材料與方法 2.1 激素及藥品配製 2.1.1 PPARαagonists (Fenofibrate) *來源: 購自 Sigma-Aldrich Co. 濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0027g 之 Fenofibrate 粉末，加入 1.87 ml DMSO 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮液實驗濃度: 取 10 μl 之 PPARαagonists 濃縮液加入 990μl 之 M199 培養液，使實驗濃度成為 10-5 M. 2.1.2 PPARβagonists *來源: 購自 Sigma-Aldrich Co. 濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0043g 之 PPARβagonists 粉末，加入 3.21 ml DMSO 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮液實驗濃度: 取 10 μl 之 PPARαagonists 濃縮液加入 990μl 之 M199 培養液，使實驗濃度成為 10-5 M. 2.1.3 PPARγagonists (Troglitazone) *來源: 購自 Sigma-Aldrich Co. 濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.005g 之 Troglitazone 粉末，加入 5.66 ml DMSO 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮液. 17.

(32) 實驗濃度: 取 10 μl 之 PPARαagonists 濃縮液加入 990μl 之 M199 培養液，使實驗濃度成為 10-5 M 2.1.4 ECGs (Endothelial Cell Growth supplements) *來源: 購自 Sigma-Aldrich Co. 濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.003g 之 ECGs 粉末，加入 1ml PBS 溶解，配製成濃度 3μg /μl 濃縮液實驗濃度: 取 25 μl、50 μl、100 μl 之 ECGs 濃縮液，分別加入 975 μl、 950 μl、900 μl 之 M199 培養液中. 2.1.5 硫化鋅 (Zinc Sulfide) *來源: 購自 Sigma-Aldrich Co. 濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.002g 之硫化鋅粉末，加入 21.528 ml PBS 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮液實驗濃度: 將 10-3 M 硫化鋅濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M 及 10-5 M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl 之 M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-5 M、10-6 M、10-7 M. 2.1.6 氯化鈷 (Cobalt chloride) *來源: 購自 Sigma-Aldrich Co. 濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0026g 之氯化鈷粉末，加入 11 ml PBS 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮液實驗濃度: 將 10-3 M 氯化鈷濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M 及 10-5 M 之濃. 18.

(33) 縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990 μl 之 M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-5 M、10-6 M、10-7 M. 2.1.7 硫酸銅 (Copper sulfate) *來源: 購自 Sigma-Aldrich Co. 濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0023g 硫酸銅粉末，加入 9.212 ml PBS 溶解，配製成濃度 10-3 M 濃縮液實驗濃度: 將 10-3 M 硫酸銅濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M 及 10-5 M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl 之 M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-5 M、10-6 M、10-7 M. 2.1.8 睪固酮 (Testosterone) *來源: 購自 Fluka Co. 濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0023g 睪固酮粉末，加入 798μl 酒精溶解，配製成濃度 10-2 M 濃縮液實驗濃度: 將 10-2 M 睪固酮濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M、 10-5 M 及 10-6M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl 之 M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-6 M、10-7 M、10-8 M. 2.1.9 雌二醇(β- Estradiol) *來源: 購自 Sigma-Aldrich Co. 濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0022g 之β- Estradiol 粉末，. 19.

(34) 加入 735μl 酒精溶解，配製成濃度 10-2 M 濃縮液實驗濃度: 將 10-2 M 雌二醇濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M、 10-5 M 及 10-6M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl 之 M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-6 M、10-7 M、 10-8 M 2.1.10 黃體酮 (Progesterone) *來源: 購自 Sigma-Aldrich Co. 濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.0023g 之 Progesterone 粉末，加入 732μl 酒精溶解，配製成濃度 10-2 M 濃縮液實驗濃度: 將 10-2 M 黃體酮濃縮液另外分管稀釋成 10-4 M、10-5 M 及 10-6M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-6 M、10-7 M、10-8 M. 2.1.11 吳郭魚類胰島素生長因子-1 (Tilapia Insulin-Like growth factor-1) *來源: 吳郭魚 IGF-1 (純度 90%，由中央研究院吳金洌老師提供) 濃縮液(stock)配製: 以微量電子天秤量取 0.001g 之 IGF-1 粉末，加入 1ml PBS 溶解，配製成濃度 10-4 M 濃縮液實驗濃度: 將 10-2 M 的 IGF-1 濃縮液另外分管稀釋成 10-5 M、10-6 M 及 10-7M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-7 M、10-8 M、10-9M. 2.1.12 胰島素(Insulin). 20.

(35) *來源: 購自 Sigma-Aldrich Co. 濃縮液(stock)配製: 原瓶內之溶液濃度為 10 mg / ml，即濃度 10-3 M 溶液，其中取出 10μl 溶於 990μl PBS，配製成濃度為 10-5 M 濃縮液實驗濃度: 將 10-3 M 的胰島素濃縮液另外分管稀釋成 10-5 M、10-6 M 及 10-7M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 10μl 加入 990μl M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-7 M、10-8 M、10-9M. 2.1.13 鹼性纖維母細胞生長因子 ( Basic fibroblast growth factor ) *來源: 購自 ProSpec Tany Technogene Co. 濃縮液(stock)配製: 原管內含 0.05 mg 之 bFGF 粉末，加入 0.5ml PBS 後並上下搖晃至均勻，濃度為 10-6 M 濃縮液實驗濃度: 將 10-6 M 的 bFGF 濃縮液另外分管稀釋成 10-7M 及 10-8 M 之濃縮液，再個別取此三種濃度之濃縮液 100μl 加入 990μl M 199 培養液中，使實驗濃度分別為 10-7 M、10-8 M、10-9M. 2.2 日本鰻(Anguilla japonica)來源與馴養環境以及活體外源激素處理本實驗所使用的鰻魚購自本地的鰻魚養殖場，為生長一至二年的日本鰻(Anguilla japonica)，實驗前先在人工海水中馴養約一星期，不予餵食。同時間本地其他養殖場的泰國鯰魚，取出腦下垂體(每顆約 4.2mg，保存於丙酮中)，將其磨碎後，以適量的 pH 7.4 之磷酸鹽緩衝溶液. 21.

(36) (Phosphate Buffered Saline；PBS)混合均勻後，儲存於-20℃中。作為日本鰻催熟劑量約 2 顆腦下垂體/每公斤魚重。將養殖池中的 60 隻鰻魚撈出，以 0.05%的乙二醇苯醚( 2-phenoxyethanol)麻醉數分鐘後，在日本鰻腹部注射 1mL 泰國鯰魚腦下垂體萃取液(Catfish Pituitary Exacts；CPE)，每週注射一次，並在日本鰻未注射泰國鯰魚腦下垂體萃取液前以及在注射泰國鯰魚腦下垂體萃取液第 3、6、9 針後的 72 小時採集卵巢和紅體組織。另外，在所有採樣之日本鰻中，隨機挑出其中 10 隻以晶片植入做記號，每週另外再注射 0.5mL 睪固酮 (Testosterone)一次，並在日本鰻未注射泰國鯰魚腦下垂體萃取液和睪固酮第 9 針後的 72 小時採集卵巢和紅體組織。. 2.3 GSI 及 RMI 的測量將鰻魚麻醉後，以電子天秤測量鰻魚體重後，利用解剖器具將雌鰻總卵巢、紅體組織取出後，以微量電子天秤稱重，利用下列公式計算出 GSI 和 RMI : 生殖腺質量指數(Gonado-Somatic Index ; GSI) *GSI (%) = 100×(生殖腺重/體重) 紅體質量指數(Rete Mirabile Index ; RMI) *RMI (‰) = 1000×(紅體總重/體重). 2.4 紅體細胞的取得與培養各取 0.008g 胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin，0.25mg/ml)、膠原蛋白酶. 22.

(37) (collagenase，0.25mg/ml)和蛋白酶(dispase，0.25mg/ml)溶解於 20ml 磷酸鹽緩衝溶液中，再經由 0.2μm 的無菌過濾膜至 50ml 離心管後，置於冰上備用。在內含 PBS 滅菌玻璃皿中使用滅菌解剖剪將紅體組織剪成細碎狀後，移入配製好的酵素混合液中，於 4℃下過夜(overnight)作用後，再於室溫中作用ㄧ小時後，將其移至冰上使反應停止並沉澱。以無菌滴管吸除酵素後，加入 7 mL PBS，以 1mL 針筒(拔除針頭部分)抽吸作用組織碎塊，再以濾網(70μm)過濾，約反覆一到二次後，置入 15ml 離心管，以 4500rpm，在 4℃下，離心 8 分鐘。以無菌吸管吸除上清液至剩 2mL，加入含 10%胎牛血清培養液(M199)懸浮細胞，使細胞和 10 %胎牛血清培養液(M199)混合均勻(此處添加量以細胞量及實驗設計而定)。取出 100μl 的細胞懸浮液與 100μl 的 trypan blue solution 均勻混合，再吸取細胞混合液 10μl 放入血球細胞計數器（hemacytometer）中，計算細胞計數器九宮格裡最外面四個大格的細胞數目。如果是死細胞會被 trypan blue solution 染成藍色，如果是活細胞則會不呈色，因此只要計算活細胞即可。細胞總數= (細胞計數器上四大格的活細胞總數/4) ×2×104×細胞懸浮液之總體積。經細胞計數之後的細胞總數，再調整成約每毫升 105~106 的細胞數，將其平均種入 12 孔細胞培養盤中，並以含 10% 胎牛血清的培養液培養三天。每三天更換新培養液，並培養於 25℃，5% CO 2 培養箱，直到細胞長滿於培養盤，即可加入欲處理的外源激素。另外，培養的前一天，12 孔細胞培養盤需貼附(coating)ㄧ層明膠(1%的 gelatin)約 12 小時以上，使紅體血管內皮細胞專一貼附，之後吸除明膠，待乾燥後即可使用。. 23.

(38) 2.5 卵巢和紅體的 RNA 分離在 1.5ml eppendorf 管內加入 0.5ml TRI® Reagent 與研磨珠(此研磨珠泡於 DEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水中，於 37℃水浴 6 小時，將 DEPC 水倒掉，再以高溫高壓下滅菌 20 分鐘後，置於 70℃烘箱中烘乾，然後保存於 4℃以備使用)，將取樣組織約 60mg 放入上述之 eppendorf 管中，以震盪均質機(homogenizer)磨碎後放置冰上，再以 12000rpm，4℃的條件離心 10 分鐘。使用微量吸管取上清液，移入新 1.5ml eppendorf 管中，加入 200μl BCP (1-bromo-3-chloropropane) ，以取代毒性較高的氯坊 (chloroform)，降低分離 RNA 的污染，輕輕搖晃混合均勻後並，室溫靜置 10 分鐘後，以 12000rpm， 4℃離心 15 分鐘。此時上層為水相(內含 RNA)，下層為有機相，兩相之間有白色的蛋白質層且包含 DNA，小心地吸取上清液，移入新 1.5ml eppendorf 中，加入 500μl 異丙醇混合均勻後，以同樣條件離心 10 分鐘。移去上清液，以 1ml 75%酒精清洗白色沉澱，吸除酒精後，放置無菌操作臺中自然乾燥白色沉澱物，待其變透明後，以 65 ℃~70℃的 miniQ 經高溫高壓滅菌水溶解，保存於-70℃。. 2.6 紅體細胞 RNA 分離利用 Viogene 公司的 total RNA Mini kit 抽取全 RNA。首先，吸除培養液並以 PBS 沖洗兩次。12-well 的培養盤中，每個 well 加入 350μl 的 RX buffer(每一毫升的 RX buffer 含有 10μl 的 β-mercaptoethanol) ( β-mercaptoethanol 可有效降低雙硫鍵對蛋白質的破壞)，輕輕敲打後靜置 5 分鐘。將作用後的 RX 混合液吸取至 1.5ml 微量離心管後，加入同體積. 24.

(39) (350μl) 75%酒精消毒(需以高純度酒精配置)並均勻混合，將混合液置入 Total RNA Mini column 中，於 4℃下離心 13000 rpm、1 分鐘。離心後去除洗滌液，加入 0.5ml WF buffer 反應於 4℃下離心 13000 rpm、1 分鐘 (WF 的作用為使 RNA 鍵結於 column)。離心後去除洗滌液，加入 0.7ml WS buffer 反應於 4℃下離心 13000 rpm、1 分鐘(WF 的作用為洗未鍵結於 column 的物質)。離心後去除洗滌液，空管於 4℃下離心 13000rpm、3 分鐘後(此步驟目的在於更完全去除酒精成分)，將 column 放入新的 1.5ml 微量離心管中並加入 15μl 的 RNase-free ddH2O(盡量加至 column 中央)，靜置 1 分鐘後反應於室溫下離心 9000 rpm、2 分鐘。離心後的洗滌液即為細胞全 RNA，需置於-70℃下保存。. 2.7 組織與細胞之 cDNA 的製備取出 2μl 之全 RNA 溶液並以二次水稀釋二百倍，以分光光度計量測 260nm 與 280nm UV 波長吸光值，計算出 RNA 的濃度(RNA 量 μg/ml= O.D.260×40×稀釋倍數)。個別算出含有 5 μg RNA 所需的 RNA 溶液體積，以規格化(Normalize)所有的樣本，利用 SuperScript™ II Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen Corporation, USA)透過反轉錄作用合成所有 mRNA 的 First-strand cDNAs：首先在 RNase-free 之 200μl PCR eppendorf 中依序加入 5μg total RNA 後，用滅菌水將總體積補至 11μl，最後加入 1μl 引子及 1μl 2.5mM dNTP mix，將此反應溶液混合均勻後，置於 PCR 反應器中。以 65℃加熱 5 分鐘後，快速置於冰上冷卻 1 分鐘後，加入 4μl 5X First-strand buffer、2.5μl 0.1M DTT 及 0.5μl SuperScript™II RTase(總反應. 25.

(40) 體積 20μl)，混合均勻並短暫離心後於 PCR 反應器中，反應條件為 42℃52 分鐘，70℃- 15 分鐘。最後產物即為 cDNAs。. 2.8 PCR (Polymerase Chain Reaction)分析將不同處理的實驗鰻或實驗細胞抽取全 RNA 反轉錄為 cDNA 後，以 cDNA 為模板及欲分析基因的專一性引子經由 Thermal Hybaid™公司所生產之聚合酶連鎖反應機，進行 PCR 反應以提升樣品濃度並進行分析。 PCR 反應產物經 DNA 電泳分析後，利用 Ezlab 膠片影像分析軟體比較實驗組與對照組之間表現量差異。其中，以 cytochrome b 作標準基因(Internal standard) ，以除去由於 RNA 濃度不同所造成定量上的差異。最後，以 Sigma Plot 軟體進行數據分析。各分析基因之引子如下： Cytochrome b eelcytb rv：5’-GTAAAGGTATGAGCCGTAGTAAAG-3’ eelcytb fw：5’-CACAAATCCTTACAGGACTATTCC-3’ 反應條件為： (1) 94 ℃- 3 分鐘 (denaturing), 1 cycle (2) 94℃-30 秒 (denaturing), 55℃- 30 秒(annealing),72℃- 25 秒(elongation) , 26 cycles ; (3)72℃- 10 分鐘, 1 cycle。. Angiopoietin-1 F 148 : 5’-CCG AAC AGA CAC GGA AAC-3’ R 778 : 5’-CCA AAG CCC ATC TTA TAC TC-3’. 26.

(41) 反應條件為：(1) 94℃- 3 分鐘, 1 cycle (2) 94℃-30 秒, 50℃- 30 秒,72℃- 40 秒, 33 cycles ; (3)72℃- 10 分鐘, 1 cycle。. VEGF F 12 : 5’- ATGAACTTTGCTGCCAGCTTG -3’ R 340: 5’-AATTGTGTTGCGTCACATGC -3’ 反應條件為：(1) 94℃- 3 分鐘, 1 cycle (2) 94℃-30 秒, 55℃- 30 秒, 72℃- 40 秒, 35 cycles ; (3)72℃- 10 分鐘, 1 cycle。. FLK F 216: 5’-TCC CCG AGA CCG ACT TAG ACT GG -3’ R 628: 5’- GCT GGG CGA ACT TCC TGT GCT-3’ 反應條件為：(1) 94℃- 3 分鐘, 1 cycle (2) 94℃-30 秒, 55℃- 30 秒, 72℃- 40 秒(elongation) , 35 cycles ; (3)72℃- 10 分鐘, 1 cycle。. Podocalyxin F 64: 5’-CGC CCT GCT GGC CGT GAT AAT C -3’ R 342: 5’-GGA AAG GGC GTG GCC TAC AGG TG -3’ 反應條件為：(1) 94℃- 3 分鐘, 1 cycle (2) 94℃-30 秒, 55℃- 30 秒, 72℃- 30 秒, 33 cycles ; (3)72℃- 10 分鐘, 1 cycle。. Eph. 27.

(42) F 120: 5’-CCACACTCGCTA CCA TGA AA -3’ R 478: 5’-TTGTTTCACTACGGCAGGTG -3’ 反應條件為：(1) 94℃- 3 分鐘, 1 cycle (2) 94℃-30 秒, 55℃- 30 秒, 72℃- 40 秒, 35 cycles ; (3)72℃- 10 分鐘, 1 cycle。. 2.9 Angiopoietin-1 基因選殖將欲選殖基因利用 NCBI 以物種同源性做比對，挑選斑馬魚 (Danio rerio)基因作為設計變性引子的參考。之後以日本鰻 cDNA 作為模板及由斑馬魚而來設計之變性引子進行聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction)，步驟為：以 Thermal Hybaid™公司所生產之聚合酶連鎖反應機，調整至溫度梯度程式，以測試適合的引子之黏合(annealing)溫度 (若反應無條帶出現則返回重新設計引子或更換不同組織 cDNA) ↓ 若有符合片段大小之條帶出現時，則進行 Ligation，以 yT&A 載體進行 T-A 選殖 (Invitrogen TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen Co., USA). ↓ 以 Primers(M13F 及 M13R)進行 PCR 篩選菌落 ↓ 選殖出之菌落經培養後抽取質體，並以質體為模板分別作三管 PCR 反應，其引子分別為(目標基因 Forward+Reverse ; 僅有目標基因 Forward ; 僅有. 28.

(43) 目標基因 Reverse)，此目的可檢驗三種可能結果： 1. 確定選殖基因為該設計引子所選殖出。 2. 排除可能在相同位子大小的條帶是由單一引子 Forward 所選殖出。 3. 排除可能在相同位子大小的條帶是由單一引子 Reverse 所選殖出。挑選檢驗長度大小無誤的質體送定序公司分析查核結果(若結果經分析不重新設計引子)。定序結果若成功選殖出所需基因，則進行 5’RACE 及 3’RACE 實驗(Clontech.)。其中日本鰻 Angiopoietin-1 基因選殖出 812 bps 片段的引子是由斑馬魚的序列(GeneBank accession number : AF 379602.1)中設計出，引子序列為： Forward: 5' - CCG AAC AGA CAC GGA AAC - 3' Reverse: 5' - CCA AAG CCC ATC TTA TAC TC - 3' 反應條件為： (1) 94 ℃- 3 分鐘 (denaturing), 1 cycle (2) 94℃-30 秒 (denaturing), 50℃- 30 秒(annealing), 72℃-40 秒(elongation) , 33 cycles ; (3)72℃- 10 分鐘,1 cycle。. 反應物. 體積(ul). cDNA. 1. 2.5mM dNTPs. 0.8. Taq polymerase. 0.2. 10X Buffer. 1. Angiopoietin-1 f 148 (5μM). 1. 29.

(44) Angiopoietin-1 R778 (5μM). 1. ddH2O. 5. 反應總體積. 10. 2.10 Angiopoietin-1 之 5’/3’RACE. 2.10.1 Angiopoietin-1 之 5’RACE 首先在 RNase-free 之 200 μl PCR tube 中依序加入 1~3μl total RNA 後，再加入 1 μl 的 5’-CDS primer A 及 1 μl 的 SMART II A oligo，用滅菌水將總體積補至 5μl，將此反應溶液混合均勻後，置於 PCR 反應器中以 70℃ 加熱 2 分鐘後，快速置於冰上冷卻 2 分鐘後，加入 2 μl 5X First-strand buffer、 1 μl 20mM DTT、1 μl 10mM dNTP Mix 及 1 μl 之 MMLV reverse transcriptase，共 10μl，混合均勻並短暫離心後，移入 PCR 反應器中，反應條件為 42℃反應 90 分鐘，反應後快速置於冰上冷卻 2 分鐘後，再加入 20μl 之 Tricine-EDTA buffer(總反應體積為 30 μl )，混合均勻並短暫離心後，移入 PCR 反應器中，反應條件為 72℃反應 7 分鐘。最後產物即為 double-strand cDNAs，保存於-20oC，供作基因選殖之用。設計特異性 reverse 引子，以全組織 RNA 所反轉錄的 cDNA 為模板(利用 SMART 系統)，接著加入 2.2μl 滅菌水、1μl 10X Advantage 2 PCR buffer、 0.8μl dNTP Mix(10mM)、2μl cDNA、2μl UPM (10X)、1μl 之特異性 reverse 引子(10μM)、1μl Taq polymerase，共 10μl 進行 PCR 反應。往後步驟如同 2.10 選殖基因方法。. 30.

(45) 2.10.2 Angiopoietin-1 之 3’RACE 首先在 RNase-free 之 200 μl PCR tube 中依序加入 1~3μl total RNA 後，再加入 1 μl 5’-CDS primer A，用滅菌水將總體積補至 5μl，將此反應溶液混合均勻後，置於 PCR 反應器中以 70℃加熱 2 分鐘後，快速置於冰上冷卻 2 分鐘後，加入 2 μl 5X First-strand buffer、1 μl 20mM DTT、1 μl 10mM dNTP Mix 及 1 μl 之 MMLV reverse transcriptase，共 10μl，混合均勻並短暫離心後，移入 PCR 反應器中，反應條件為 42℃反應 90 分鐘，反應後快速置於冰上冷卻 2 分鐘，再加入 20μl 之 Tricine-EDTA buffer (總反應體積為 30 μl )，混合均勻並短暫離心後，移入 PCR 反應器中，反應條件為 72℃反應 7 分鐘。最後產物即為 double-strand cDNAs，保存於-20oC，可用於基因選殖。設計特異性 forward 引子，以全組織 RNA 所反轉錄的 cDNA 為模板 (利用 SMART 系統)，接著加入 2.2μl 滅菌水、1μl 10X Advantage 2 PCR buffer、0.8μl dNTP Mix(10mM)、2μl cDNA、2μl UPM (10X)、1μl 之特異性 forward 引子(10μM)、1μl Taq polymerase，共 10μl 進行 PCR 反應。往後步驟如同 2.10 選殖基因方法。. 2.11 卵巢石蠟組織切片染色 2.11.1 石蠟包埋 2.11.1.1 將部份組織浸泡於固定液中存放於 4℃(Bouin’s fluid)過夜。隔天，使用 50%酒精洗滌數次，之後浸泡於 50%酒精 4 小時且放置平衡儀搖晃(此步驟目的為移除苦味酸(picric acid)以防傷害組織)，. 31.

(46) 完成後儲存於 70%酒精中。 2.11.1.2 進行修片(Trimming)步驟，修整組織厚度為 3mm 後置於脫水器內充分水洗。 2.11.1.3 脫水(Dehydration)步驟，以 70%酒精浸泡 1 小時、80%酒精浸泡 1 小時、95%酒精浸泡 1 小時、100%酒精浸泡 50min(因酒精會使組織皺縮或變形，因此不能浸泡於高濃度酒精過久，尤其是 100%酒精)，以上皆需放置平衡儀搖晃。 2.11.1.4 清洗(Cleaning)步驟，使用二甲苯(Xylene)浸泡組織，於室溫 1 小時以脫除酒精部份，且二甲苯可溶於石蠟中。 2.11.1.5 浸潤(Infiltration)步驟，將浸泡二甲苯於室溫 1 小時的組織換至 65℃二甲苯中浸泡 1 小時，之後，換至二甲苯：石蠟(1：1) 的比例混和液中於 65℃浸泡 1 小時，最後，換至全蠟中於 65℃ 浸泡 1 小時(次步驟為使用硬石蠟(溶點 52~62℃)，若石蠟過熱，組織與石蠟將產生裂痕)。 2.11.1.6 包埋(Embedding)步驟，首先，將溫熱石蠟倒入包埋模內，約一半量(避免產生氣體)，接著置放包埋模於冷盤中，待包埋模底部開始冷凝時置入組織(切面朝下)，隨後立即加入溫石蠟補足包埋模約八分滿使其冷卻靜置，冷卻成形後將石蠟塊取出整修成梯型狀。. 2.11.2 石蠟切片首先，使用石蠟切片機，調整切片厚度間距為 5μm 進行切片。第二，. 32.

(47) 以鑷子輕輕夾取完整蠟片置入 40℃水槽中，使切片完全展開，以塗抹蛋白之乾淨玻片撈取並貼附。第三，置於水槽周邊加熱板上乾燥 (不可過熱過久，將導致石蠟溶解) ，之後即可進行染色。. 2.11.3 石蠟切片染色首先，將玻片放置於 65℃烘箱內 30 分鐘後，待冷卻後進行脫蠟步驟，先以二甲苯浸泡 10 分鐘，再換另一槽二甲苯浸泡 10 分鐘，之後再換至 100%酒精浸泡 2 分鐘、90%酒精浸泡 2 分鐘、80%酒精浸泡 2 分鐘、70% 酒精浸泡 2 分鐘，浸泡於水中 5 分鐘，泡在 PBS 中，加入過氧化氫 5 分鐘後以 PBS 清洗 3 次(每次 2 分鐘)，加入 1/100 之一級抗體 3 小時，在以 PBS 清洗 3 次(每次 2 分鐘)後，加入 1/ 750 之二級抗體 30 分鐘，在以 PBS 清洗 3 次(每次 2 分鐘)後，加入 DAB buffer (1ml 的 DAB buffer 內含一滴呈色劑 chromogen) 5 分鐘後，浸泡於流動水 5 分鐘，再換至 70%酒精浸泡 10 秒鐘、80%酒精浸泡 10 秒鐘、90%酒精浸泡 10 秒鐘、100%酒精浸泡 10 秒鐘，再將玻片放置於 70℃烘箱內 10 分鐘後，待冷卻後浸泡二甲苯中後即可封片觀察。. 2.12 紅體細胞活體外(in vitro)免疫染色法（Immunostaining）先將24 well plate放入經滅菌的圓形蓋玻片，然後coating一層1%明膠 (gelatin)，之後以滅菌水清洗後，待乾燥後將適量的細胞種入有玻璃片的 well中，以含10%血清的M199，25℃、5% CO2培養三天。之後將玻璃片放入新鮮配製的3.7% 三聚甲醛溶液(paraformaldehyde溶於PBS, Sigma,. 33.

(48) USA)中，固定15分鐘。之後加入PBS搖晃洗滌三次，每次10分鐘後，以填塞緩衝液(Blocking buffer) (填塞緩衝液的配製為1％gelatin、1％Triton X-100、兩者溶於PBS之中) 處理30分鐘。加入一級抗體(用填塞緩衝液進行1:200稀釋)，於室溫下搖晃反應一小時。以填塞緩衝液搖晃洗滌三次，每次10分鐘，加入二級抗體（用填塞緩衝液進行1:200稀釋），於室溫下搖擺反應30分鐘。再以PBS搖晃洗滌三次，每次10分鐘。最後利用相位差顯微鏡中觀察其免疫螢光染色的情形。. 2.13 統計方法實驗數據計算的表示方法為平均值±標準誤差(mean± SD)，實驗數據結果以 GraphPad Prism 5 軟體的 t-test 分析統計。當 P < 0.05 (P value)時，視為有統計上的差異。. 34.

(49) 第三章、結果 3.1 日本鰻 Angiopoietin-1 基因片段之擴增及分析鑑定與比對以斑馬魚(Danio rerio)的 Angiopoietin-1 為標的設計變性引子 (degenerate primers)，經 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)作用，結果擴增出日本鰻(Anguilla japonica) Angiopoietin-1 的部份片段(812 bps) (圖 12.)，其核酸序列親緣分析與斑馬魚 Angiopoietin-1 有 77%以上的相似性；氨基酸序列親緣分析與斑馬魚 Angiopoietin-1 有 80%的相似性(圖 13.)。之後採用此片段的序列設計專一性引子並運用 RT-PCR 技術進行鰻魚組織及細胞 Angiopoietin-1 表現量之分析。. 3.2 Angiopoietin-1 與相關血管生長因子在不同體重日本鰻的紅體之表現採樣之日本鰻體重範圍在 100g ~ 400g，以一百公克為間距，分為三組，各組皆為六隻，採取其紅體並抽取組織 RNA 後，進行 RT-PCR 分析血管生長因子表現。由鰻魚體重與 RMI 值(圖 16.)可了解在鰻魚體重 100 ~ 200g 時 RMI 值為 0.237± 0.051 o/oo (mean ± SD)，鰻魚體重 200 ~ 300g 時 RMI 值為體重 100g~200g 時之 1.2 倍，並達到高峰，而在鰻魚體重 300 ~ 400g 時維持與體重 200 ~ 300g 相近之 RMI 值 (0.281±0.028 o/oo)。以各基因表現與不同組別體重看出 Angiopoietin-1 在鰻魚體重 100 ~ 200g 時其表現為 1.280± 0.555 unit，鰻魚體重 200 ~ 300g 時為體重 100g~200g 時 Angiopoietin-1 表現量之 0.91 倍，值得. 35.

(50) 注意的是 Angiopoietin-1 在鰻魚體重 300 ~ 400g 時表現量達高峰，提升至 1.92±0.290 unit，為體重 100g~200g 時 Angiopoietin-1 表現量之 1.5 倍(圖 17.)。而 VEGF、FLK 表現於體重 200 ~ 300g 時達高峰，表現趨勢類似(圖 18.、圖 19.) (VEGF=1.92±0.345 unit，為體重 100g~200g 時 VEGF 表現量之 1.7 倍; FLK=1.72±0.334 unit，為體重 100g~200g 時 FLK 表現量之 1.35 倍)，VEGF 在體重 300 ~ 400g 時期表現量並無太大差異(VEGF=1.86±0.287 unit) 但 FLK 在體重 300 ~ 400g 下降 (FLK=1.28±0.292 unit)，VEGF 與 FLK 表現量與 RMI 值可看出有一正向變化趨勢存在(圖 22.)。血管內皮細胞膜上之醣蛋白 Podocalyxin 在鰻魚體重 100 ~ 200g 時其表現為 0.577±0.171 unit，體重 200 ~ 300g 時為 0.617±0.032 unit (為體重 100g~200g 時 Podocalyxin 表現量之 1.1 倍)，體重 300 ~ 400g 時表現量達高峰為 0.796±0.189 unit (為體重 100g~200g 時 Podocalyxin 表現量之 1.4 倍) (圖 21.)。Eph 主要為一酪胺酸激酶受器，可調控細胞遷徙及神經系統發育，對於早期之血管生成有重要貢獻，調控在血管內皮細胞間的連結，在本實驗中可明顯看出在日本鰻體重 100 ~ 200g 時期 Eph 表現量很高(1.372± 0.139 unit)，到體重 200 ~ 400g 表現量明顯下降(0.338±0.093 unit，為體重 100g~200g 時 Eph 表現量之 0.25 倍) (0.362±0.034 unit，為體重 100g~200g 時 Eph 表現量之 0.26 倍) (圖 20.)，其中 Eph 亦是唯一表現量與 RMI 值呈現負向趨勢的因子(圖 23.)。其中 Podocalyxin 表現量與 Angiopoietin-1 和 VEGF 表現皆呈正相關趨勢(圖 24.)，但與 Angiopoietin-1 之相關係數較大。. 36.

(51) 3.3. Angiopoietin-1 與相關血管生長因子在催熟日本鰻的紅體之表現日本鰻每週經腹部注射鯰魚腦下垂體研磨液催熟，於第 0 週、第 3. 週、第 6 週、第 9 週時取樣，抽取紅體組織 RNA 後，以 RT-PCR 分析其紅體組織中 Angiopoietin-1 與血管新生因子相關基因的表現。以採樣個體之 RMI 值與基因表現中了解在雄鰻的 RMI 值在注射腦下垂體 3 針時達高峰(圖 25.)，Angiopoietin-1 表現量在催熟 0 針至 6 針過程中逐漸上升，於第六針達高峰後下降(圖 27.) ，Angiopoietin-1 表現隨 RMI 值增加而呈正相關(圖 29.); FLK、DLL-4、Adam 表現亦與 RMI 值呈正相關(圖 33、圖 39.、圖 41.)，此外雄鰻之 VEGF 與 Angiopoietin-1、Podocalyxin 二因子之表現相關性較高(圖 43、圖 44.)但與 Eph 表現呈負相關(圖 45.)。在雌鰻的 RMI 值在注射腦下垂體 6 針時達高峰(圖 26.)，Angiopoietin-1 表現量亦在第六針有升高趨勢後下降(圖 28.)，Angiopoietin-1 表現隨 RMI 值增加呈正相關(圖 30.); VEGF 表現與 RMI 值呈正相關(圖 32.)，其中雌鰻 FLK 表現與 RMI 值呈負相關(圖 34.)，此外雌鰻之 VEGF 表現與 Angiopoietin-1、 Podocalyxin 二因子表現相關性較高(圖 46、圖 47.)。. 3.4 血管生長因子在催熟處理及合併使用睪固酮 (Testosterone) 催熟日本鰻的卵巢之表現日本鰻每週經腹部注射鯰魚腦下垂體研磨液催熟，第 0 週、第 3 週、第 6 週、第 9 週時取樣，另外在所有採樣鰻魚，挑出其中 10 隻植入晶片. 37.

(52) 做記號，每週另外再注射 0.5mL 睪固酮 (Testosterone)一次，第九週時採樣，抽取卵巢組織 RNA 後，以 RT-PCR 分析其卵巢組織中 Angiopoietin-1 與血管新生因子相關基因的表現。由注射腦下垂體針數與 GSI 值看出 GSI 值隨注射針數增加而上升(圖 49.)，只注射腦下垂體萃取液的樣本個體之 Angiopoietin-1、VEGF、FLK、DLL-4 與 GSI 值呈現負相關趨勢(圖 50、圖 51、圖 53-1.)，而 Podocalyxin、Eph 表現與 GSI 值呈低度正相關(圖 52)， Adam 表現變化與 GSI 值之間無明顯關係(圖 53-2.)。額外注射 9 針睪固酮組別之 GSI 值較僅注射 9 針腦下垂體萃取液組別之 GSI 值高出 1.67 倍(P <0.05) (圖 54.)，而相關血管生長因子 VEGF、 FLK、Podocalyxin、Eph、DLL-4、Adam…等表現量皆較無注射睪固酮之組別高(圖 55. ~ 圖 60.)。. 3.5 Angiopoietin-1 與相關血管生長因子在日本鰻紅體細胞無加藥刺激培養 2 至 8 週的表現將紅體細胞培養於 M 199 培養液中(內含 10% 胎牛血清)，培養八週，每隔三天更換一次培養液，從第二週起每週抽取紅體細胞 RNA，以 RT-PCR 分析其 Angiopoietin-1 與相關血管新生因子的表現。(圖 61.) Angiopoietin-1 在第二周表現量為 1.572±0.447 unit (mean ± SD)、第三周表現量為 2.112±0.601 unit (為第二周表現量之 1.34 倍)、第四周表現量為 2.581±0.120 unit (為第二周表現量之 1.64 倍) (P < 0.05)、第五周表現量為 2.526±0.257 unit (為第二周表現量之 1.60 倍) (P < 0.05)、第六周表現量為 2.520±0.391 unit(為第二周表現量之 1.60 倍) (P < 0.05)、第七周表現量為. 38.