第二章 材料與方法
2.9 Angiopoietin -1 基因選殖
將欲選殖基因利用 NCBI 以物種同源性做比對，挑選斑馬魚 (Danio rerio)基因作為設計變性引子的參考。之後以日本鰻 cDNA 作為模板及由
斑馬魚而來設計之變性引子進行聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction)，步驟為：
以 Thermal Hybaid™公司所生產之聚合酶連鎖反應機，調整至溫度梯度 程式，以測試適合的引子之黏合(annealing)溫度
(若反應無條帶出現則返回重新設計引子或更換不同組織 cDNA)
↓
若有符合片段大小之條帶出現時，則進行 Ligation，以 yT&A 載體進行 T-A 選殖
(Invitrogen TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen Co., USA).
↓
以 Primers(M13F 及 M13R)進行 PCR 篩選菌落
↓
選殖出之菌落經培養後抽取質體，並以質體為模板分別作三管 PCR 反應，
其引子分別為(目標基因 Forward+Reverse ; 僅有目標基因 Forward ; 僅有
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目標基因 Reverse)，此目的可檢驗三種可能結果：
1. 確定選殖基因為該設計引子所選殖出。
2. 排除可能在相同位子大小的條帶是由單一引子 Forward 所選殖出。
3. 排除可能在相同位子大小的條帶是由單一引子 Reverse 所選殖出。
挑選檢驗長度大小無誤的質體送定序公司分析查核結果(若結果經分析不 重新設計引子)。定序結果若成功選殖出所需基因，則進行 5’RACE 及 3’RACE 實驗(Clontech.)。
其中日本鰻 Angiopoietin-1 基因選殖出 812 bps 片段的引子是由斑馬 魚的序列(GeneBank accession number : AF 379602.1)中設計出，引子序列 為：
Forward: 5' - CCG AAC AGA CAC GGA AAC - 3' Reverse: 5' - CCA AAG CCC ATC TTA TAC TC - 3'
反 應 條件 為 ： (1) 94℃- 3 分 鐘 (denaturing), 1 cycle (2) 94℃-30 秒 (denaturing), 50℃- 30 秒(annealing), 72℃-40 秒(elongation) , 33 cycles ; (3)72℃- 10 分鐘,1 cycle。
cDNA 1 反應物 體積(ul)
2.5mM dNTPs 0.8 Taq polymerase 0.2 10X Buffer 1 Angiopoietin-1 f 148 (5μM) 1
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Angiopoietin-1 R778 (5μM) 1 ddH2O 5 反應總體積 10
2.10 Angiopoietin-1 之 5’/3’RACE
2.10.1
Angiopoietin-1 之 5’RACE
首先在 RNase-free 之200 μl PCR tube 中依序加入 1~3μl total RNA 後，
再加入1 μl 的 5’-CDS primer A 及 1 μl 的 SMART II A oligo，用滅菌水將 總體積補至5μl，將此反應溶液混合均勻後，置於 PCR 反應器中以 70℃
加熱 2 分鐘後，快速置於冰上冷卻 2 分鐘後，加入 2 μl 5X First-strand buffer、
1 μl 20mM DTT、1 μl 10mM dNTP Mix 及 1 μl 之 MMLV reverse
transcriptase，共10μl，混合均勻並短暫離心後，移入 PCR 反應器中，反 應條件為 42℃反應 90 分鐘，反應後快速置於冰上冷卻 2 分鐘後，再加入 20μl 之 Tricine-EDTA buffer(總反應體積為 30 μl )，混合均勻並短暫離心 後，移入 PCR 反應器中，反應條件為 72℃反應 7 分鐘。最後產物即為 double-strand cDNAs，保存於-20oC，供作基因選殖之用。
設計特異性 reverse 引子，以全組織 RNA 所反轉錄的 cDNA 為模板(利 用 SMART 系統)，接著加入2.2μl 滅菌水、1μl 10X Advantage 2 PCR buffer、
0.8μl dNTP Mix(10mM)、2μl cDNA、2μl UPM (10X)、1μl 之特異性 reverse 引子(10μM)、1μl Taq polymerase，共 10μl 進行 PCR 反應。往後步驟如同 2.10 選殖基因方法。
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2.10.2 Angiopoietin-1 之 3’RACE
首先在 RNase-free 之200 μl PCR tube 中依序加入 1~3μl total RNA 後，
再加入1 μl 5’-CDS primer A，用滅菌水將總體積補至 5μl，將此反應溶液 混合均勻後，置於 PCR 反應器中以 70℃加熱 2 分鐘後，快速置於冰上冷 卻 2 分鐘後，加入2 μl 5X First-strand buffer、1 μl 20mM DTT、1 μl 10mM dNTP Mix 及1 μl 之 MMLV reverse transcriptase，共 10μl，混合均勻並短 暫離心後，移入 PCR 反應器中，反應條件為 42℃反應 90 分鐘，反應後 快速置於冰上冷卻 2 分鐘，再加入20μl 之 Tricine-EDTA buffer (總反應體 積為30 μl )，混合均勻並短暫離心後，移入 PCR 反應器中，反應條件為 72℃反應 7 分鐘。最後產物即為 double-strand cDNAs，保存於-20oC，可 用於基因選殖。
設計特異性 forward 引子，以全組織 RNA 所反轉錄的 cDNA 為模板 (利用 SMART 系統)，接著加入2.2μl 滅菌水、1μl 10X Advantage 2 PCR buffer、0.8μl dNTP Mix(10mM)、2μl cDNA、2μl UPM (10X)、1μl 之特異 性 forward 引子(10μM)、1μl Taq polymerase，共 10μl 進行 PCR 反應。往 後步驟如同 2.10 選殖基因方法。
2.11 卵巢石蠟組織切片染色 2.11.1 石蠟包埋
2.11.1.1 將部份組織浸泡於固定液中存放於 4℃(Bouin’s fluid)過夜。隔天，
使用 50%酒精洗滌數次，之後浸泡於 50%酒精 4 小時且放置平 衡儀搖晃(此步驟目的為移除苦味酸(picric acid)以防傷害組織)，
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完成後儲存於 70%酒精中。
2.11.1.2 進行修片(Trimming)步驟，修整組織厚度為 3mm 後置於脫水器 內充分水洗。
2.11.1.3 脫水(Dehydration)步驟，以 70%酒精浸泡 1 小時、80%酒精浸 泡 1 小時、95%酒精浸泡 1 小時、100%酒精浸泡 50min(因酒 精會使組織皺縮或變形，因此不能浸泡於高濃度酒精過久，尤 其是 100%酒精)，以上皆需放置平衡儀搖晃。
2.11.1.4 清洗(Cleaning)步驟，使用二甲苯(Xylene)浸泡組織，於室溫 1 小時以脫除酒精部份，且二甲苯可溶於石蠟中。
2.11.1.5 浸潤(Infiltration)步驟，將浸泡二甲苯於室溫 1 小時的組織換 至 65℃二甲苯中浸泡 1 小時，之後，換至二甲苯：石蠟(1：1) 的比例混和液中於 65℃浸泡 1 小時，最後，換至全蠟中於 65℃
浸泡 1 小時(次步 驟為使用硬石蠟(溶點 52~62℃)，若石蠟過 熱，組織與石蠟將產生裂痕)。
2.11.1.6 包埋(Embedding)步驟，首先，將溫熱石蠟倒入包埋模內，約一 半量(避免產生氣體)，接著置放包埋模於冷盤中，待包埋模底部 開始冷凝時置入組織(切面朝下)，隨後立即加入溫石蠟補足包埋 模約八分滿使其冷卻靜置，冷卻成形後將石蠟塊取出整修成梯型 狀。
2.11.2 石蠟切片
首先，使用石蠟切片機，調整切片厚度間距為 5μm 進行切片。第二 ，
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以鑷子輕輕夾取完整蠟片置入 40℃水槽中，使切片完全展開，以塗抹蛋 白之乾淨玻片撈取並貼附。第三，置於水槽周邊加熱板上乾燥 (不可過 熱過久，將導致石蠟溶解) ，之後即可進行染色。
2.11.3 石蠟切片染色
首先，將玻片放置於 65℃烘箱內 30 分鐘後，待冷卻後進行脫蠟步驟，
先以二甲苯浸泡 10 分鐘，再換另一槽二甲苯浸泡 10 分鐘，之後再換至 100%酒精浸泡 2 分鐘、90%酒精浸泡 2 分鐘、80%酒精浸泡 2 分鐘、70%
酒精浸泡 2 分鐘，浸泡於水中 5 分鐘，泡在 PBS 中，加入過氧化氫 5 分 鐘後以 PBS 清洗 3 次(每次 2 分鐘)，加入 1/100 之一級抗體 3 小時，在以 PBS 清洗 3 次(每次 2 分鐘)後，加入 1/ 750 之二級抗體 30 分鐘，在以 PBS 清洗 3 次(每次 2 分鐘)後，加入 DAB buffer (1ml 的 DAB buffer 內含一滴 呈色劑 chromogen) 5 分鐘後，浸泡於流動水 5 分鐘，再換至 70%酒精浸 泡 10 秒鐘、80%酒精浸泡 10 秒鐘、90%酒精浸泡 10 秒鐘、100%酒精浸 泡 10 秒鐘，再將玻片放置於 70℃烘箱內 10 分鐘後，待冷卻後浸泡二甲 苯中後即可封片觀察。
2.12 紅體細胞活體外(in vitro)免疫染色法（Immunostaining）
先將24 well plate放入經滅菌的圓形蓋玻片，然後coating一層1%明膠 (gelatin)，之後以滅菌水清洗後，待乾燥後將適 量的細胞種入有玻璃片的 well中，以含10%血清的M199，25℃、5% CO2培養三天。之後將玻璃片 放入新鮮配製的3.7% 三聚甲醛溶液(paraformaldehyde溶於PBS, Sigma,
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USA)中，固定15分鐘。之後加入PBS搖晃洗滌三次，每次10分鐘後，以 填塞緩衝液(Blocking buffer) (填塞緩衝液的配製為1％gelatin、1％Triton X-100、兩者溶於PBS之中) 處理30分鐘。加入一級抗體(用填塞緩衝液進 行1:200稀釋)，於室溫下搖晃反應一小時。以填 塞緩衝液搖晃洗滌三次，
每次10分鐘，加入二級抗體（用填 塞緩衝液進行1:200稀釋），於室溫下搖 擺反應30分鐘。再以PBS搖晃洗滌三次，每次10分鐘。最後 利用相位差顯 微鏡中觀察其免疫螢光染色的情形。
2.13 統計方法
實驗數據計算的表示方法為平均值±標準誤差(mean± SD)，實驗數據 結果以 GraphPad Prism 5 軟體的 t-test 分析統計 。當 P < 0.05 (P value)時，
視為有統計上的差異。
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第三章、結果
3.1 日本鰻 Angiopoietin-1 基因片段之擴增及分析鑑定與比對
以斑馬魚(Danio rerio)的 Angiopoietin-1 為標的設計變性引子 (degenerate primers)，經 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)作用，結果擴增出日本鰻(Anguilla japonica) Angiopoietin-1 的部 份片段(812 bps) (圖 12.)，其核酸序列親緣分析與斑馬魚 Angiopoietin-1 有 77%以上的相似性；氨基酸序列親緣分析與斑馬魚 Angiopoietin-1 有 80%的相似性(圖 13.)。之後採用此片段的序列設計專一性引子並運用 RT-PCR 技術進行鰻魚組織及細胞 Angiopoietin-1 表現量之分析。
3.2 Angiopoietin-1 與相關血管生長因子在不同體重日本鰻的 紅體之表現
採樣之日本鰻體重範圍在 100g ~ 400g，以一百公克為間距，分 為三組，各組皆為六隻，採取其紅體並抽取組織 RNA 後，進行 RT-PCR 分析血管生長因子表現。由鰻魚體重與 RMI 值(圖 16.)可了解在鰻魚 體重 100 ~ 200g 時 RMI 值為 0.237± 0.051 o/oo (mean ± SD)，鰻魚體重 200 ~ 300g 時 RMI 值為體重 100g~200g 時之 1.2 倍，並達到高峰，
而在鰻魚體重 300 ~ 400g 時維持與體重 200 ~ 300g 相近之 RMI 值 (0.281±0.028 o/oo)。以各基因表現與不同組別體重看出 Angiopoietin-1 在鰻魚體重 100 ~ 200g 時其表現為 1.280± 0.555 unit，鰻魚體重 200 ~ 300g 時為體重 100g~200g 時 Angiopoietin-1 表現量之 0.91 倍，值得
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注意的是 Angiopoietin-1 在鰻魚體重 300 ~ 400g 時表現量達高峰，提 升至 1.92±0.290 unit，為體重 100g~200g 時 Angiopoietin-1 表現量之 1.5 倍(圖 17.)。而 VEGF、FLK 表現於體重 200 ~ 300g 時達高峰，表 現趨勢類似(圖 18.、圖 19.) (VEGF=1.92±0.345 unit，為體重 100g~200g 時 VEGF 表現量之 1.7 倍; FLK=1.72±0.334 unit，為體重 100g~200g 時 FLK 表現量之 1.35 倍)，VEGF 在體重 300 ~ 400g 時期表現量並無 太大差異(VEGF=1.86±0.287 unit) 但 FLK 在體重 300 ~ 400g 下降 (FLK=1.28±0.292 unit)，VEGF 與 FLK 表現量與 RMI 值可看出有一 正向變化趨勢存在(圖 22.)。血管內皮細胞膜上之醣蛋白 Podocalyxin 在鰻魚體重 100 ~ 200g 時其表現為 0.577±0.171 unit，體重 200 ~ 300g 時為 0.617±0.032 unit (為體重 100g~200g 時 Podocalyxin 表現量之 1.1 倍)，體重 300 ~ 400g 時表現量達高峰為 0.796±0.189 unit (為體重 100g~200g 時 Podocalyxin 表現量之 1.4 倍) (圖 21.)。Eph 主要為一酪 胺酸激酶受器，可調控細胞遷徙及神經系統發育，對於早期之血管生 成有重要貢獻，調控在血管內皮細胞間的連結，在本實驗中可明顯看 出在日本鰻體重 100 ~ 200g 時期 Eph 表現量很高(1.372± 0.139 unit)，
到體重 200 ~ 400g 表現量明顯下降(0.338±0.093 unit，為體重 100g~200g 時 Eph 表現量之 0.25 倍) (0.362±0.034 unit，為體重
100g~200g 時 Eph 表現量之 0.26 倍) (圖 20.)，其中 Eph 亦是唯一表現 量與 RMI 值呈現負向趨勢的因子(圖 23.)。其中 Podocalyxin 表現量與 Angiopoietin-1 和 VEGF 表現皆呈正相關趨勢(圖 24.)，但與
Angiopoietin-1 之相關係數較大。
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3.3 Angiopoietin-1 與相關血管生長因子在催熟日本鰻的紅體 之表現
日本鰻每週經腹部注射鯰魚腦下垂體研磨液催熟，於第 0 週、第 3 週、第 6 週、第 9 週時取樣，抽取紅體組織 RNA 後，以 RT-PCR 分析其 紅體組織中 Angiopoietin-1 與血管新生因子相關基因的表現。以採樣個體 之 RMI 值與基因表現中了解在雄鰻的 RMI 值在注射腦下垂體 3 針時達高 峰(圖 25.)，Angiopoietin-1 表現量在催熟 0 針至 6 針過程中逐漸上升，於 第六針達高峰後下降(圖 27.) ，Angiopoietin-1 表現隨 RMI 值增加而呈正 相關(圖 29.); FLK、DLL-4、Adam 表現亦與 RMI 值呈正相關(圖 33、圖 39.、圖 41.)，此外雄鰻之 VEGF 與 Angiopoietin-1、Podocalyxin 二因子 之表現相關性較高(圖 43、圖 44.)但與 Eph 表現呈負相關(圖 45.)。在雌鰻 的 RMI 值在注射腦下垂體 6 針時達高峰(圖 26.)，Angiopoietin-1 表現量 亦在第六針有升高趨勢後下降(圖 28.)，Angiopoietin-1 表現隨 RMI 值增 加呈正相關(圖 30.); VEGF 表現與 RMI 值呈正相關(圖 32.)，其中雌鰻 FLK 表現與 RMI 值呈負相關(圖 34.)，此外雌鰻之 VEGF 表現與 Angiopoietin-1、
Podocalyxin 二因子表現相關性較高(圖 46、圖 47.)。
3.4 血管生長因子在催熟處理及合併使用睪固酮 (Testosterone) 催熟日本鰻的卵巢之表現
日本鰻每週經腹部注射鯰魚腦下垂體研磨液催熟，第 0 週、第 3 週、
第 6 週、第 9 週時取樣，另外在所有採樣鰻魚，挑出其中 10 隻植入晶片
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做記號，每週另外再注射 0.5mL 睪固酮 (Testosterone)一次，第九週時採 樣，抽取卵巢組織 RNA 後，以 RT-PCR 分析其卵巢組織中 Angiopoietin-1 與血管新生因子相關基因的表現。由注射腦下垂體針數與 GSI 值看出 GSI 值隨注射針數增加而上升(圖 49.)，只注射腦下垂體萃取液的樣本個體之 Angiopoietin-1、VEGF、FLK、DLL-4 與 GSI 值呈現負相關趨勢(圖 50、
圖 51、圖 53-1.)，而 Podocalyxin、Eph 表現與 GSI 值呈低度正相關(圖 52)，
Adam 表現變化與 GSI 值之間無明顯關係(圖 53-2.)。
額外注射 9 針睪固酮組別之 GSI 值較僅注射 9 針腦下垂體萃取液組 別之 GSI 值高出 1.67 倍(P <0.05) (圖 54.)，而相關血管生長因子 VEGF、
FLK、Podocalyxin、Eph、DLL-4、Adam…等表現量皆較無注射睪固酮之 組別高(圖 55. ~ 圖 60.)。
3.5 Angiopoietin-1 與相關血管生長因子在日本鰻紅體細胞無加 藥刺激培養 2 至 8 週的表現
將紅體細胞培養於 M 199 培養液中(內含 10% 胎牛血清)，培養八週，
每隔三天更換一次培養液，從第二週起每週抽取紅體細胞 RNA，以
每隔三天更換一次培養液，從第二週起每週抽取紅體細胞 RNA，以