免疫組織化學染色（ IMMUNOHISTOCHEMISTRY STAIN ）

2.3.1 反應原理

免疫組織化學染色，抗原抗體結合反應（antigen-antibody reaction） 之應用，

用以偵測生物分子，在組織中的分布情況。其染色技術採取二次抗體結合，即利 用初級抗體（primary antibody）與細胞上的抗原 （antigen）結合後，再加入生物 素化的次級抗體 （biotinylated secondary antibody）與初級抗體結合，接著藉由鏈

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黴菌卵白素─過氧化氫酶複合物 （streptavidin-peroxidase conjugate）與生物素之間 的強結合力，使之與次級抗體結合，最後加入呈色劑 （chromogen）來偵測並顯 示抗原所在位置。亦可以UltraVision™ Quanto Detection System HRP 檢測系統（非 生物素檢測系統） （Thermo Fisher Scientific, Cheshire, UK）來處理。UltraVision™

Quanto Detection System HRP 檢測系統是一種敏銳度極高的產品，可以在有大量內 源性生物素的組織切片中達到極高的染色質量，並且達到最大程度上地降低背景 染色。以這種方法可以替代抗生物素蛋白鏈黴菌素--生物素機轉，而消除內源性生 物素所引起的背景染色，增加判讀的準確度。

本實驗採取實驗樣本之切片，滴入不加初級抗體之抗體稀釋液 （antibody dilutor），並進行一整套的免疫組織化學染色程序，作為陰性對照組，結果顯示無 任何反應。

2.3.2 初級抗體（primary antibody）的選擇

本實驗所採用的初級抗體為Anti-IDO, clone 10.1 （Millipore, Temecula, CA），

為鼠（mouse）的抗 IDO 之單株抗體（monoclonal antibody）；Anti-human IFN-γ, MD-1

（Biolegend, San Diego, CA），為鼠（mouse）的抗 IDO 之單株抗體（monoclonal antibody）。本實驗將初級抗體，以抗體稀釋液（antibody dilutor, Ventana Medical Systems）分別稀釋成 1:200、1:300、1:500、1：800 等梯次濃度進行試驗性染色，

觀察其呈色效果，而以其中1:200 的稀釋濃度所表現之染色鑑別力適中、反應時間 恰當，故以此濃度進行實驗。在本實驗中，為定量染色強度（Staining Intensity），

所有玻片染色時間均為五分鐘。

2.3.3 抗原抗體結合之偵測系統

本研究中，染色切片以UltraVision™ Quanto Detection System HRP 檢測系統

（非生物素檢測系統） （Thermo Fisher Scientific, Cheshire, UK）來處理。

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UltraVision™ Quanto Detection System HRP 檢測系統擁有高敏銳度，且可有效避開 內源性生物素引起的背景染色，強化染色結果的清晰度與鑑別度。

2.3.4 實驗步驟

（1）脫蠟及復水（deparaffinization and rehydration）

將切片依序分別浸泡於三缸純二甲苯（xylene）溶液中脫蠟，每缸分別浸泡五 分鐘。脫蠟後依序浸泡於濃度遞減之酒精溶液中覆水：100%無水酒精兩缸，95%

及80%酒精各一缸，每缸各浸泡 3 分鐘。而後置於流清水（running water）中沖洗 五分鐘。

（2）組織抗原性恢復處理（antigen retrieval）

包埋成蠟塊的組織切片，欲染色的細胞蛋白在包埋過程中，可能被其他分子 所掩蓋，而喪失其組織抗原性。組織抗原性恢復處理的目的為使用加熱或化學、

生物酵素處理等方法，將細胞表面的抗原再次呈現出來，使抗體得以與之結合。

本研究使用組織抗原性恢復處理為將組織切片浸泡於二百倍稀釋之Trilogy™（Cell Marque, Rocklin, California）下，以微波爐中火加熱十分鐘。而後於流動清水中進 行冷卻，冷卻時間為十分鐘。冷卻後放入三缸PBS 中各潤洗一分鐘。

（3）阻斷內生性過氧化氫酶（blocking endogenous hydrogen peroxidease）

將組織切片滴上Hydrogen peroxide block™（Thermo Fisher Scientific, Cheshire, UK），均勻分佈於標本上後靜置十分鐘，以阻斷內生性過氧化氫酶，防止偽陽性 反應，之後置於二缸的PBS 中各潤洗三分鐘。

（4）阻斷非特異性抗原（non-specific antigen）的結合

於組織切片上分別滴上UltraVision™ Quanto Detection System HRP 中的 Ultra

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V block™（Thermo Fisher Scientific, Cheshire, UK），均勻分佈於標本上後靜置五分 鐘，以阻斷非特異性之背景染色。

（5）初級抗體作用

切片上滴加2 滴（約 0.1 ml）稀釋好的抗體溶液（IDO or IFN-γ，稀釋倍率 1:200），靜置於 4℃下隔夜作用。次日再以 PBS 潤洗三次，每次各為三分鐘。

（6）偵測抗原抗體結合系統

首先滴上UltraVision™ Quanto Detection System HRP 中的 Primary antibody amplifier quato™（Thermo Fisher Scientific, Cheshire, UK），在室溫下作用十分鐘，

用以增加下一劑HRP Polymer Quanto™的作用，接著以 PBS 潤洗三次，每次三分 鐘。其次，滴入HRP Polymer Quanto™，置於室溫下作用十分鐘，後再以 PBS 潤 洗三次，每次各三分鐘，以洗去多餘之次級抗體-過氧化氫酶複合物。

（7）呈色

組織切片所使用之呈色劑為DAB Quanto™ （Thermo Fisher Scientific, Cheshire, UK），配製方式為 1ml DAB Quanto Substrate 加入 30µl DAB Quanto Chromogen，均勻混合後，於組織切片上各滴加 200μmL，置於室溫下作用，呈色

時間控制為5 分鐘。呈色時會出現褐棕色反應產物，待反應時間結束，迅速將玻

片置入PBS 中潤洗二次，每次各三分鐘，以終止呈色反應並洗去多餘之呈色劑。

（8）背景染色（Counter staining）

將切片置於Mayer’s 蘇木紫（hematoxylin）染色液中約四分鐘後，浸入清水 中八次，而後置入PBS 中潤洗一分鐘，再置入流動清水中沖洗三分鐘，將附著之 多餘染劑去除。背景染色的時間會因Mayer’s 蘇木紫（hematoxylin）染色液之濃

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度、室溫高低而有所調整，控制誤差時間小於1 分鐘。切片背景染色的程度，控

制在光學顯微鏡下能夠清楚觀察到切片細胞之細胞核、便於染色細胞之計數

（counting），且其染色程度不蓋過原本的免疫組織化學呈色為準則。

（9）脫水

將玻片浸泡於三缸100％酒精溶液中脫水，每缸各浸泡一分鐘，後依序置入二 甲苯三缸，每缸各浸泡一分鐘，完成脫水步驟。

（10）封片（mounting）

組織切片經脫水後，以組織封片膠（histomount Entelan）進行封片，乾燥後即 完成免疫組織染色，後以顯微鏡觀察染色結果。