"Indoleamine 2,3-Dioxygenase及Interferon-gamma於口腔鱗狀細胞癌中之表現"

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國立臺灣大學牙醫專業學院臨床牙醫學研究所碩士論文

Graduate Institute of Clinical Dentistry School of Dentistry

National Taiwan University Master Thesis

Indoleamine 2,3-Dioxygenase及Interferon-gamma於

口腔鱗狀細胞癌中之表現 Expression of Indoleamine 2,3-Dioxygenase and

Interferon-gamma in oral squamous cell carcinoma

何宗訓

Ho, Tsung-Hsun 指導教授﹕

賈景山教授 Prof. Jean-San Chia

李正喆副教授 Associate Prof. Jang-Jaer Lee 中華民國 102 年 6 月

June 2013

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國立臺灣大學碩士學位論文口試委員會審定書

Indoleamine 2,3-Dioxygenase及Interferon-gamma於口腔鱗狀細胞癌中之表現

Expression of Indoleamine 2,3-Dioxygenase and Interferon-gamma in oral squamous cell carcinoma

本論文係何宗訓君（R00422011）在國立臺灣大學臨床牙醫學研究所所完成之碩士學位論文，於民國 102 年 6 月 19 日承下列考試委員審查通過及口試及格，特此證明

口試委員：

賈景山教授（簽名）

李正喆副教授（簽名）

王萬波教授（簽名）

江俊斌教授（簽名）

郭生興教授（簽名）

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誌謝

在此

銘誌各位老師的循循善誘感謝

賈景山老師、李正喆老師、郭生興老師、陳信銘老師、章浩宏老師、鄭世榮老師

感念各位學長姐的無私相授感謝

葉秋月學姐、林鴻穎學長、柯惠馨學姐、周佳璇學姐、楊方瑜學姐、洪孟豪學長、

魏鈴穎學姐、柳依青學姐、彭馨慧學姐、蔡怡欣學姐、翁佳瑜學姐、張勝惟學長

謹記各位同學的風雨同舟感謝

何念恩醫師、林文仁醫師、傅康貴醫師、楊曙亙醫師

最後感謝家人對我的包容提挈還有

所有一路上或有意或無意幫助過我的所有人

何宗訓謹誌於癸巳年仲夏

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中文摘要

背景

Indoleamine 2,3-Dioxygenase（IDO）為控管人體中 Tryptophan（Trp）代謝重要酵素，藉由促進其代謝，產生抑制T cell 的活性及加速 T cell 凋亡的效果，以達免疫抑制之功效。在正常的生理狀態下，IDO 常表現於母體的胎盤內，做為抑制免疫的角色以避免同種異體的胎兒遭受母體免疫系統的攻擊。在惡性腫瘤中，受到了Interferon-gamma（IFN﹣γ）刺激，IDO 的大量表現扮演了幫助腫瘤細胞脫逃出免疫系統的監控與攻擊的角色（immune escape），在人體癌症中如大腸癌、膀胱癌及乳癌等，其表現量都有提高的情形，且與腫瘤的分期（stage）甚至癒後

（prognosis）都有顯著的相關性。本研究欲探討 IDO 與 IFN﹣γ 於口腔鱗狀細胞癌

（OSCC）之病理組織中的表現量，並且分析其臨床各參數和存活時間之關係。

材料與方法

本研究目的在於探討IDO 與 IFN﹣γ 於 62 例 OSCC 中的表現，藉由免疫組織化學染色方法，並以陽性染色指標Labeling index（LI）記錄其染色程度。利用 Student T test 及 ANOVA 分析其平均值差異；點二系列相關（point-biserial correlation）、皮爾森相關（Pearson correlation）、斯皮爾曼相關（Spearman correlation）分析其相關性；Linear regression 分析 IDO 和 IFN﹣γ 之因果關係；Cox proportional hazard regression model 及 Kaplan-Meier 存活率方法來分析口腔鱗狀細胞癌患者臨床病理參數及存活率與IDO 及 IFN﹣γ 的表現之相關性，並分析是否有影響存活時間的獨立預後因子。

結果

在口腔鱗狀細胞癌的組織中，IDO 的平均陽性標記指數為 27.26%，IFN﹣γ 的平均陽性標記指數為55.81%；其中 IDO 高表現（LI≥40）的樣本佔所有樣本之 27.12

﹪，IFN﹣γ（LI≥40）高表現的樣本佔所有樣本之 79.66%。二者陽性標記指數有顯著相關性（p=0.001），相關係數為 0.41，R square 為 0.17。

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IDO 的陽性標記指數與腫瘤的大小（T status）及腫瘤分期（stage）有顯著相關（p=0.22）（p=0.05）。在邊緣侵犯的腫瘤中，IFN﹣γ 的表現量與未侵犯的組別相比有顯著的增加，且有表現量與侵犯與否有相關性；而與周邊淋巴血管侵犯與否有相關性。

其餘各項臨床參數中，都與IDO 和 IFN﹣γ 之表現沒有顯著相關性。在單變量之Cox proportional hazard regression model 中，IDO 之陽性標記指數，淋巴結轉移分期（N status）及腫瘤分化（differentiation）為顯著存活因子。在多變量之 Cox proportional hazard regression model 中，僅淋巴結轉移分期（N status）為其顯著存活因子。

在Kaplan-Meier plots 中，IDO 陽性染色指標顯著地縮短病人之總存活時間

（overall survival），Log-Rank Test 之 p 值為 0.037。IFN﹣γ 陽性染色指標則有縮短病人總存活時間之趨勢，但未達統計意義。

結論

於本研究中，IN﹣γ 的陽性染色指標與 IDO 的陽性染色指標有顯著關聯性。IDO 的陽性染色指標與腫瘤大小及口腔癌分期有顯著關聯性，且與口腔細胞癌患者的存活時間有關。在口腔癌患者中，IDO 的表現量較高者其存活時間較短。

關鍵字：IDO，IFN﹣γ，口腔鱗狀細胞癌

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Abstract

Background

Indoleamine 2,3-Dioxygenase（IDO）regulates the catabolism of Tryptophan（Trp）

and suppresses T cells proliferation and enhances T cells apoptosis by consuming Trp.

In normal physical status, IDO expresses in planceta preventing allogenic fetal rejection by catabolism of Trp. Expression of IDO in malignant tumor, elevated by the effect of IFN-γ, plays an important role in the mechanism of the immune escape which is the cell extrinsic traits of cancers. Many researches reveal increasing IDO level in malignant tumor, including colon cancer, bladder cancer and breast cancer, etc., related to the advanced stage and poor prognosis. The emphasis of this study is on the expressions of IDO and IFN-γ in pathological specimens from oral squamous cell carcinoma（OSCC）

and the correlation between these expressions, clinical and pathologic parameters, and the survival time.

Materials and Methods

The goal in this study is examining the expression of IDO and IFN-γ in 62

specimens diagnosed as OSCC by immunohistochemistry（IHC） staining and recording the grade of positive staining as labeling index（LI）. The correlations between the expression of IDO and IFN-γ, clinical and pathological parameter, the disease-free survival and overall survival were analyzed via student T test, ANOVA, linear

regression, correlation analysis, including point-biserial correlation, Pearson correlation, Spearman correlation, Survival analysis, including Cox proportional hazard regression model and Kaplan-Meier plots.

Results

The average labeling index of IDO in OSCC specimens is 27.26%, and the average labeling index of IFN-Υ is 55.81%. The rate of specimens with high-IDO expression

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（LI≥40） in all OSCC specimens is 27.12% and the rate of the specimens with high-IFN-γ expression is 79.66%. The expressions of IDO and IFN-γ have significant correlation between each over （p=0.001）, R=0.41

The labeling index of IDO has significant correlation between T status and tumor stage （p=0.22）（p=0.05）. In the group with marginal involvement, the labeling index of IFN-γ is elevated significantly and there is a significant correlation between marginal involvement and LI of IFN-γ. The correlation between lymphovascular invasion and LI of IFN-γ is significant too.

There is no correlation between the other clinical parameters and the expression of IDO and IFN-γ. In univariate Cox proportional hazard regression model, LI of IDO, N status and tumor differentiation are statistically significant. In multivariate Cox proportional hazard regression model, only N status is significant.

Kaplan-Meier survival analysis showed that patients had shorter overall survival time with high LI of IDO. The Log-Rank Test p value is 0.037. High LI of IFN-γ indicates the tendency of decreasing overall survival time in OSCC patients, but is not statistically significant.

Conclusions

The labeling index of IDO has significant correlation with the labeling index of IFN-γ, T status of tumor, and tumor stage. In OSCC patients, high expression of IDO indicates shorter overall survival. IDO and IFN-γ may have influence on each other and indicate advanced tumor stage and poor prognosis.

Key Words: IDO，IFN-γ, oral squamous cell carcinoma

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表目錄

表一 IDO 和 IFN-γ 平均陽性標記指數（labeling indices，LI）在口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）之表現 ... 44 表二 IDO 平均陽性標記指數與口腔鱗狀細胞癌病患之臨床參數的關係

... 45 表三 IFN-γ 平均陽性標記指數與口腔鱗狀細胞癌病患之臨床參數的關係

... 46 表四 IDO 和 IFN-γ 平均陽性標記指數與口腔鱗狀細胞癌病患之臨床參

數的相關性 ... 47 表五 IDO 平均陽性標記指數與組織病理切片中危險因子（risk factors）：

腫瘤侵犯切除邊緣（margin involvement）、腫瘤淋巴結外擴散

（extracapsular spread, ECS）、原發腫瘤部位之淋巴或血管侵犯

（lymphovascular invasion, LVI）、腫瘤侵犯神經周邊（perineural invasion, PNI）及頸部局部轉移之淋巴結數目大於等於兩顆

（metastatic lymph nodes≧2, LN≧2）等五項之關係 ... 48 表六 IFN-γ 平均陽性標記指數與組織病理切片中危險因子（risk

factors）：腫瘤侵犯切除邊緣（margin involvement）、腫瘤淋巴結外擴散（extracapsular spread, ECS）、原發腫瘤部位之淋巴或血管侵犯

（metastatic lymph nodes≧2, LN≧2）等五項之關係 ... 49 表七 IDO 和 IFN-γ 平均陽性標記指數與組織病理切片中危險因子（risk

factors）：腫瘤侵犯切除邊緣（margin involvement）、腫瘤淋巴結外擴散（extracapsular spread, ECS）、原發腫瘤部位之淋巴或血管侵犯

（metastatic lymph nodes≧2, LN≧2）等五項之相關性 ... 50 表八以 Cox proportional hazard regression model 進行單變數（Univariate）

分析及多變數（Multivariate）分析 IDO 和 IFN-γ 平均陽性標記指數

（LI）、臨床參數及存活時間的關係 ... 51

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圖目錄

圖一 IDO 和 IFN-γ 於口腔癌（OSCC）細胞之表現 ... 52 圖二 IFN-γ 和 IDO 的線性回歸關係圖 ... 55 圖三 Kaplan-Meier 存活率分析圖─ IDO 陽性標記指數（LI）與累積存活

率的關係 ... 56 圖四 Kaplan-Meier 存活率分析圖─ IFN-γ 陽性標記指數（LI）與累積存

活率的關係 ... 57

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第一章序論及文獻回顧

1.1 口腔鱗狀細胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma, OSCC）概論

1.1.1 口腔鱗狀細胞癌簡介

口腔中的癌症有94﹪為口腔鱗狀細胞癌（Oral squamous cell carcinoma, OSCC），乃起源於口腔上皮組織的鱗狀細胞癌。若正常的鱗狀細胞發生細胞變異

（dysplasia），持續累積細胞不正常的基因與形態，且向下侵犯直至越過基底膜

（base membrane），即為組織病理學所定義之口腔鱗狀細胞癌¹ 。

世界衛生組織所定義口腔鱗狀細胞癌之細胞分化型態可分為三類：良好分化

（well-differentiated），中度分化（moderate-differentiated）及不良分化

（poor-differantiated）。良好分化的鱗狀細胞癌可看到明顯的角質化，常有角質珠

（keratin pearl），與鱗狀上皮結構相似且有大而緊密排列的癌細胞巢（cancer tumor nest）。低度分化之鱗狀細胞癌，其癌細胞排列分散破碎，形成相互分離且小的癌細胞巢，且細胞之核質比增加，核濃染，有高細胞分裂數（high mitotic figures）。

中度分化的鱗狀細胞癌其結構特色則介在前二者之間。

口腔鱗狀細胞癌可依其發生的解剖位置不同而分為以下幾類：舌（tongue）、

頰黏膜（buccal mucosa）、腭黏膜（palatal mucosa）、牙齦（gingiva）、唇（lip）、

舌腹側（ventral surface of tongue）及口底（floor of mouth）。在全球統計中，口腔鱗狀細胞癌在舌的發生率最高，約為75﹪² 。但在台灣的統計中，因受台灣民眾有嚼食檳榔習慣的影響，舌的發生率降至30﹪，頰黏膜的發生率為 30﹪，高於全球統計之數據^3-5 。

口腔鱗狀細胞癌外觀通常呈現紅白色病變，且持續擴大。外型上呈現出疣狀

（verrucous）、斑塊狀（patch）、向外擴展（exophytic）或向內侵犯（endophytic）

之腫塊，可能伴隨有無癒合之潰瘍（ulceration）、周邊硬塊（induration）、疼痛、

出血、惡臭之症狀。腫瘤若是侵犯至週邊齒槽骨，則可能有牙齒動搖鬆脫或是骨

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暴露等症狀。口腔鱗狀細胞癌向下可侵犯至口底肌肉、顎骨、舌基部（tongue base）；向上則可侵犯至咀嚼間隙（masticator space）、咽旁間隙（parapahryngeal space）、

鼻竇（maxillary sinus）及鼻腔（nasal cavity），甚至可至顱底（skull base）。

口腔鱗狀細胞癌之轉移通常經由淋巴組織產生頸部淋巴結轉移（cervical nodal metastasis），常見的局部轉移區域包括頷下（submental）、顎下（submandibular）

及上頸部（upper jugular）淋巴結，同側（ipsilateral）轉移較對側（contralateral）

轉移常見，但舌頭的口腔癌因其位於口腔中央及血管淋巴之交錯分布，發生雙側或對側頸部轉移的比例較高。統計上發生淋巴結轉移的病人預後較差，對側或雙側轉移之預後較同側轉移差。

口腔鱗狀細胞癌之轉移通常會藉由淋巴組織，轉移至頸部淋巴結。常見的頸部淋巴轉移區域包括頷下（submental）、顎下（submandibular）及上頸部（upper jugular）淋巴結。除舌癌外，同側轉移的機率較對側轉移的機會高；而舌癌因其位置在口腔中央及淋巴血管交錯分佈之處，發生對側甚至雙側轉移的比例較高。發生淋巴結轉移的病人在統計上預後較差，而雙側及對側頸部轉移病人之預後較同側轉移病人之預後差。

遠端轉移以肺部發生機率最高，其次為肝、骨及腦部。發生遠端轉移的病人，

其預後最差⁶。

1.1.2 口腔鱗狀細胞癌之流行病學

在全球統計中，口腔鱗狀細胞癌之排名第六之惡性腫瘤，男女發生比例約3：

1，而在黑人男性的發生率較高⁷。口腔鱗狀細胞癌於有嚼食檳榔及吸菸習慣的國家與地區有較高的盛行率，其中發生率與致死率最高的國家為印度，其口腔癌年死亡人數佔癌症年死亡人數90％以上（W.H.O. meeting report,1984 ）。

在台灣地區，依據2011 年的衛生署統計資料，顯示口腔鱗狀細胞癌在不分性別之癌症死亡率排名第五，於男性癌症罹患率及死亡率中排名第四。根據2007 年

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台灣衛生署癌症登記小組統計資料，男性口腔癌之平均死亡年齡為50 至 54 歲。

依據近十年台灣癌症的發生率及死亡率，口腔癌和其它癌症如大腸直腸癌

（colorectal cancer）、攝護腺癌（prostate cancer）相比，平均死亡年齡更低，而發生率及死亡率則逐年提高；其罹病性別以男性為主，且死亡年齡主要分布於中壯年⁸。

1.1.3 口腔鱗狀細胞癌之危險因子及基因變異

（1）與口腔鱗狀細胞癌相關之危險因子

口腔鱗狀細胞癌的致病機轉為多因子（multifactorial）。病因（etiology）可分為內因性（intrinsic）致病因子及外因性（extrinsic）致病因子。

外因性致病因子包含飲酒、嚼食檳榔、抽菸等口腔習慣，還有環境中的酚類

（phenols）、輻射線（radiation）等等。在口腔癌高盛行率國家中，不當的口腔習慣是普遍存在的公共衛生問題。觀察台灣口腔癌的發生率，可發現隨著男性嚼食檳榔比例的提高口腔癌之發生率及死亡率也隨之增加，而嚼食檳榔之年齡層下降，口腔癌罹患的年齡層也隨之降低⁸，顯示嚼食檳榔與台灣口腔癌罹患率有高度的相關性。若同時具有飲酒、抽菸及嚼食檳榔習慣等三種危險因子，罹患口腔癌的機率會較不具危險因子的人高出123 倍³。目前已發現檳榔含有的檳榔鹼

（arecoline）成分以及菸草中尼古丁、焦油等成份，皆容易引發口腔癌。

內生性致病因子包含1. 營養不良，如鐵質缺乏（iron deficiency）及維生素 A 缺乏（vitamin A deficiency）。2. 微生物感染，如口腔念珠菌感染（candida

infection）、致癌病毒（oncogenic viruses）感染、梅毒（syphilis）感染。3. 患者自身條件，如免疫抑制（immunosuppression）以及致癌基因（oncogenes）和腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene）的不正常表現等等。以上都可能促使口腔癌的發生。鐵質缺乏導致的Plummer-Vinson Syndrome（或 Paterson-Kelly Syndrome）

目前已知會提高食道及口咽部鱗狀細胞癌的發生率⁹。維生素A 缺乏症會導致皮膚

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及黏膜過度角質化（keratinization），在口腔黏膜中，會導致癌前病變（pre-cancerous lesion）的發生¹⁰。

微生物感染也可能導致鱗狀細胞癌發生。微生物長期而慢性地感染可能改變細胞周遭環境，並促使基因產生變異，趨向癌化，例如增生性口腔念珠菌感染

（Hyperplastic candidiasis），會在舌背上形成過度角化的白斑病變。在動物實驗中，

特定的念珠菌種會製造nitrosamine，將使小鼠（rat）的腫瘤發生率增加，但在人類身上是否為口腔癌致病因子，目前仍有爭議¹¹。末期梅毒患者則易罹患舌背部

（dorsal surface of tongue）的鱗狀細胞癌¹²。人類乳突瘤病毒（human papilloma virus, HPV）的感染，也有機會導致口腔癌的發生¹³。抑癌基因TP53 的表現會被 HPV E6、

E7 所抑制，促使細胞異常增生及癌化，攜帶此基因的 HPV 病毒，會增加頭頸部癌症的發生率¹⁴。

（2）與口腔鱗狀細胞癌相關之基因變異

致癌基因（oncogene）的活化與過度表現（overexpression），或前驅致癌基因

（proto-oncogene）的轉型（transformation），皆為導致口腔癌的致病因素。前驅致癌基因可能因外在環境的改變，如病毒感染、輻射線或化學致癌物質，而轉型為致癌基因，其基因產物的過度表現，易促使癌症發生（carcinogenesis）；ras、myc、

及c-erbB 等是目前已知與口腔鱗狀細胞癌相關的致癌基因。另一方面，人體內的抑癌基因（tumor suppressor gene）若產生不活化突變（inactivated mutation），無法正常表現時，也會使得細胞內的傳遞路徑失調，增加癌化機率。相關的抑癌基因有p53、pRb 及 E-cadherin 等基因。在頭頸部癌症的研究中發現，約有 60-80%的腫瘤細胞帶有p53 的不活化突變^14,15。

上皮生長因子受器（epithelial growth factor receptor，EGFR）基因之過度表現（over-expression），可藉由活化受器酪氨酸酶（receptor tyrosine kinase, RTK）下游的Ras-MAPK、PI3K-PTEN-AKT 及磷酸酯酶 C（phospholipase C）路徑，進而

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改變細胞內基因表現，在鱗狀細胞的癌化中扮演重要角色。口腔癌患者中的EGFR 表現量，為正常人的1.5 至 3.5 倍¹⁶。

由於台灣口腔癌的流行病學之實況與全球口腔癌的盛行情況略有差異，因此台灣口腔癌患者是否存在著區域性的特殊基因變異，也是目前口腔癌研究專注的議題之一。2009 年 Sheu et al.利用 Functional Genomic analysis 分析台灣口腔癌病患之基因變化，發現31%的病人，其染色體 7q11.2 之基因有放大表現（amplication）

的現象，其所轉譯表現的即是上皮生長因子受器（EGFR）蛋白。而上皮生長因子受器在傳遞訊息時，下游表現的相關基因，如CCND1、KRAS、MAPK 等都有表現放大或突變（mutation）的現象。而 EGFR 蛋白的過度表現，與口腔癌病人的存活率（survival）呈現負相關¹⁶。因此，利用抑制EGFR 的機轉進而抑制口腔癌的腫瘤細胞，可能為未來口腔癌治療的新標的。

1.1.4 口腔鱗狀細胞癌之臨床分期

現行口腔癌之臨床分期以2010 年美國癌症學會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）發表之 TNM 分類系統為主流，根據原發部位之腫瘤大小、侵犯之解剖構造，頸部淋巴結轉移及遠端器官轉移作為分期之依據。

T status 表示原發性腫瘤（primary tumor）之大小：T1 為腫瘤最長徑小於等於兩公分，T2 為大於兩公分小於等於四公分，T3 為大於四公分；T4a 為若腫瘤侵犯至舌深部之外部肌肉（extrinsic musles）、唾液腺如舌下腺（sublingual gland）或顎下腺（submandibular）、牙齦下之顎骨皮質（cortical bone）、上顎竇（maxillary sinus）

或侵犯皮膚（skin）；T4b 為腫瘤侵犯之解剖位置至咀嚼間隙（masticator space）、

翼突板（pterygoid plate）、顱底或侵犯內頸動脈（internal carotid artery）。

N status 代表腫瘤在頸部淋巴結之局部轉移情形：N0 為無頸部淋巴結轉移；

N1 為與原發腫瘤同側（ipslateral）之單一淋巴結轉移，且淋巴結最長徑小於等於三公分；N2a 為與原發腫瘤同側之單一淋巴結轉移，但淋巴結最長徑大於三公分小

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於等於六公分；N2b 為與原發腫瘤同側之多顆淋巴結轉移，其轉移之淋巴結最長徑小於等於六公分；N2c 為頸部雙側（bilateral）或對側（contralateral）之淋巴結轉移，其轉移之淋巴結最長徑小於等於六公分；N3 則表示無論單側或雙側之淋巴結轉移，其中有最長徑大於六公分者。

M status 代表腫瘤遠端轉移的情形：M0 為無遠端轉移，M1 為遠端轉移。

臨床及病理組織之分期則根據TNM 分類分為四期。原發腫瘤大小越大、侵犯周邊的解剖位置，或產生頸部淋巴結轉移、遠端轉移等，臨床分期屬於越晚期。

而越晚期的口腔癌病人，其預後（prognosis）越差。

1.1.5 現行對口腔鱗狀細胞之治療及預後

目前口腔癌之首選治療方式為手術切除，再輔以手術前或手術後之放射線治療（radiotherapy）及化學治療（chemotherapy）。手術前引導化學治療（induction chemotherapy）之應用目前尚在臨床試驗階段，通常應用於腫瘤較大、侵犯區域較廣、較深、不易切除者，並不使用於一般口腔癌患者的常規治療。

National comprehensive cancer network （NCCN）於 2011 年出版之 Clinical practice guidelines of oncology，其中參考了 2004 年發表於 NEJM 的兩個大型臨床試驗RTOG9501 及 EORTC22931、以及 Beriner（2005）所做之分析，制定口腔癌各臨床分期之治療程序。

Beriner 的研究指出，對於臨床分期中較晚期，如第三期、第四期，或具有組織病理之危險因子（risk factors），包含手術邊緣之腫瘤侵犯（margin involvement）、

淋巴結外擴散（extranodal extension）、腫瘤侵犯神經周邊（perineural invasion）或淋巴血管系統（lymphvascular permeation）之頭頸癌患者，建議進行手術後之同步放射化學治療（concurrent chemoradiotherapy），可加強口腔癌術後的局部區域控制

（locoregional control）之效果，統計結果顯示此類患者術後的同步放射化學治療可以增加五年存活率（5-year survival rate）。

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口腔癌患者經手術治療後，普遍存在口乾、缺牙、咬合不正、張口困難、頭頸部僵硬等問題；而切除範圍較大的患者，更有可能伴隨有顏面部醜型、吞嚥困難、語言功能受損等後遺症，進而增加吸入性肺炎（aspiration pneumonia）、呼吸道感染之風險。嚴重吞嚥功能喪失的病患甚至必須接受胃造廔手術；術後接受放射化學治療的病患，療程中必須承受治療及藥物之副作用，包含潰瘍疼痛等。治療後之放射線性骨壞死（osteoradionecrosis，ORN）、頭頸部肌肉纖維化等後遺症亦大大降低病人的生活品質。界域性癌化（field cancerization）的效應也使口腔癌的局部控制率差，造成腫瘤復發、第二原發腫瘤（second primary）的問題¹⁷。在藥物的研發上，近年關於上皮生長因子受器（EGFR）的研究日益增加，抑制EGFR 的 EGFR 單株抗體（monoclonal antibody） Cetuximab，已被證實在部分病患可對侵犯廣泛的口腔癌做有效的控制，增加病患的存活率7-10 個月¹⁸，且藥物毒性及副作用較傳統化學治療低，為目前唯一使用於口腔癌治療的的標靶治療

（targeted therapy）藥物。新興之標靶或分子治療藥物，則有待更進一步研究及發展。

分子生物學的研究，以發展早期偵測的腫瘤生物指標（biomarker）或研發新興抗癌藥物為目標，以期增加患者的存活率，降低現行治療的併發症與後遺症，

於口腔癌患者是極大的裨益。

1.2 IFN-γ 概論

1.2.1 Interferon

Interferon（IFN）最初在 1957 年被發現，並且被視為可干擾病毒複製的物質

19 。以往 IFN 的分類是依據分泌的細胞形態，但目前所使用的分類，主要根據不同的 IFN 受體將其分為第一型和第二型。第一型的 IFN 主要有 IFN-α、IFN-β、IFN-ω 及 IFN-τ，其中 IFN-α 又因不同物種分為許多亞型，而它們的共同受體為第一型受

體^20-25。幾乎所有的細胞都會表現第一型 IFN，但 IFN-α 及 IFN-ω 最主要的製造細

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胞為造血細胞，而 IFN-β 主要由膠原母細胞及巨噬細胞製造²⁶ 。病毒感染會同時刺激 IFN-α 和 IFN-β 的表現²⁷。而 IFN-τ 只在反芻動物中觀察到²⁸。

IFN-γ 屬第二型的 IFN，其結構、受器、基因編碼都與第一型 IFN 不同。目前認為製造 IFN-γ 的細胞主要有：CD4+ T helper cell type 1 （Th1） lymphocytes、

CD8+ cytotoxic lymphocytes、Nature Killer （NK） cells、B cells、Nature Killer T

（NKT） cells、antigen-presenting cells （APCs）。由 APCs 表現的 IFN-γ 主要作用於週邊的細胞，且和 NK cells 表現的 IFN-γ 共同為初期感染之免疫反應。而由 T lymphocyte 為主要來源之 IFN-γ 為應變性免疫反應之特性²⁹。IFN-γ 主要由

interleukin （IL）-12 和 IL-18 所調節。二者主要的來源為 APCs，而二者皆可刺激巨噬細胞、NK 和 T cells 進行 IFN-γ 的製造³⁰。而負向調節因子主要為：IL-4、IL-10、

transforming growth factor（TGF）-β、glucocorticoids³¹。

1.2.2 IFN-γ receptor

IFN-γ receptor（IFNGR）主要分為結合位的 IFNGR1 和訊息傳遞位的 IFNGR2，

此二者都屬於Class II cytokine receptor family，是一種細胞外以 V 型結合位作用的受體³²。IFNGR2 有限的數量使之通常為 IFN-γ 作用之決定性因子，而其表現量取決於細胞分化及活化的狀態，相對而言IFNGR1 的數量往往都是有餘的²⁶。

IFNGR 缺乏激化脢和磷酸化脢，因此必須藉由其他的訊號傳遞機制來完成。

IFNGR1 的細胞外主體上有 Janus tyrosine kinase （JAK）1 和 signal transducer and activator of transcription（STAT）1³³。而IFNGR2 之細胞內主體有 JAK2，而 IFNGR2 並不直接和IFN-γ 起作用，而是和 IFN-γ/IFNGR1 之複合體作用³⁴。

1.2.3 IFN-γ signaling pathway

IFN-γ 一般以雙體的方式為活化態，以反向平行的方式結合，此雙體可和 IFNGR1 在細胞外的主體受位結合³⁵，並催化IFNGR2 進行細胞內訊息之傳遞。在

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細胞內，IFNGR1 和 IFNGR2 的 carboxy termini 帶有 JAK1 和 JAK2，其會使 IFNGR1 和IFNGR2 磷酸化³⁶。磷酸化的位置提供了STAT 的結合位³⁷，以STAT1 為主，

將STAT1 磷酸化後，形成雙體結構，致使其進入細胞核內，結合至 gamma-activated sequence（GAS）³⁸。

一般而言，STAT1 在細胞質中，是以反平行的方式結合成雙體。而磷酸化會促使其形成平行結合之雙體，進而向核內移動，進行GAS 的結合³⁹。在核內藉由如TCP45 之類的去磷酸化酶將其中的 STAT1 去活性化，以利其由核內向核外移動

40。STAT1 最主要的負向調控是由細胞質內的 suppressor of cytokine signaling

（SOCS）抑制 JAKs 的活性^41,42。另外可藉由histone acetyltransferase 將其乙醯化降低其活性，而由histone deacetylases 所進行之去乙醯化則會增強其活性⁴³。此外由IFN-γ 由 STAT1 所誘發的許多激酶如：mitogen-activated protein kinase（MAPK）、 protein kinase C（PKC）、phosphoinositide 3-kinase（PI3K）等，都有磷酸化 STAT1 促使其活性化之功能⁴⁴。

1.3 IFN-γ 與癌症之關係

1.3.1 IFN-γ 之正向作用

IFN-γ 藉由調控免疫作用，影響人體抗病毒、抗細菌、細胞循環、細胞凋亡、

發炎反應、先天及後天免疫³⁸。其最被熟知的作用即是正向調節MHC class I molecules，促進 Antigen-presenting cells（APC）的抗原呈現能力⁴⁵。IFN-γ 同時也調控許多免疫細胞的分化及作用，在Th1 調控的免疫反應中，IFN-γ 參與了其分化、

活化及恆定。IFN-γ 抑制了 Th2 細胞的生長，但促進 regulatory T（Treg）細胞的生長⁴⁶，並且活化巨噬細胞及分泌驅化素⁴⁷。

IFN-γ 在免疫調節中所扮演的重要角色，使之成為許多疾病研究的方向。包含慢性肉芽腫、真菌感染、自體免疫疾病、及癌症⁴⁸。IFN-γ 有抑制細胞生長的功能且具有細胞毒性，被視具有抗癌作用的細胞激素⁴⁹。動物實驗中，在纖維骨肉瘤的

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10

細胞株上，IFNGR1 的異位表現造成對 IFN-γ 作用的耐受性，腫瘤的生長較佳且抗排斥的特性較強⁵⁰。IFN-γ 可以增強腫瘤的免疫原性，在沒有 IFNGR 和 STAT1 存在的老鼠中，由甲基膽菲所誘發的惡性腫瘤的生長會加速。在黑色素瘤及肺腺癌的細胞株中，有將近三分之一的細胞突變為對IFN-γ 失去敏感性，對 IFN-γ 的去敏感性可以是腫瘤能侵入免疫系統的監控的重要因素⁵¹。IFN-γ 會正向調控 MHC class I genes，藉此增加腫瘤的免疫原性⁵²，使cytotoxic T lymphocytes（CTL）藉 IFN-γ 引發的訊號傳遞鏈進入腫瘤中，進而辨認並移除腫瘤細胞^53,54。

IFN-γ 在腫瘤免疫中，被認為主要有三種功能：1. 抗腫瘤增生^55-572. 抗血管

新生^58-603. 促進腫瘤細胞凋亡⁶¹。最初在臨床上的應用為治療慢性骨髓性白血病

62,63，之後廣泛地應用在膀胱癌、大腸直腸癌、卵巢癌、成人T 細胞白血病等⁴⁸。

IFN-γ 的抗腫瘤增生之特性最初是由 Fisher 等人於 1986 年在黑色素瘤上觀察到的⁶⁴。而後Brown 確認了其為存在於活化 T 細胞中的生長抑制因子⁴⁹。Kortylewski 則在四種不同的黑色素瘤細胞株中確認了其抗腫瘤增生的性質，但其程度卻是高度變異的⁶⁵。抗腫瘤增生的特性主要由STAT1 來誘發，而少量的 IFN-γ 即可驅使 STAT1 的作用，但在研究中發現必須要有大量的 IFN-γ 才能產生抗腫瘤增生的效果，因此認為在IFN-γ/STAT1 的主軸上，應該尚有更多複雜且分岐相異的機制所調控⁶⁶。

1.3.2 IFN-γ 之負向作用

IFN-γ 除了上述已知之抗腫瘤之作用外，同時也被認為有反向的效果。1987 年，Taniguchi 發表了 IFN-會促進 B16 黑色素瘤細胞在肺部群聚的現象，並且增加其對自然殺手細胞的抗性⁶⁷。而後其他的研究也指出IFN-γ 的高量表現，與較具侵犯性的黑色素瘤之亞型有相關性^68,69。在人類淋巴球上若表現低量的IFNGR2，則傾向有細胞增生及抗細胞凋亡的反應，反之若表現高量的IFGR2，則傾向促進細胞凋亡之反應⁷⁰。在乳腺腺癌細胞中，自泌的IFN-γ 會增加腫瘤轉移的能力且增加

(22)

11

其對自然殺手細胞之抗性⁷¹。許多的關於IFN-γ 臨床試驗也得出相異的結果，在初期階段，黑色素瘤的病人IFN-α 及 IFN-γ 合併治療下，得到了明顯的功效，因此 1996 年 Schiller 進行了 IFN-γ 治療黑色素瘤的 phase II 和 phase III 臨床試驗，卻沒有觀察到明顯的效果，且發現有抑制helper T cells 的現象⁷²。而其他二個類似的臨床試驗因治療組的病程明顯比對照組的病程惡化得更快，因此提前終止了試驗

73,74。

在過去，IFN-γ 被認為是免疫系統對抗惡性腫瘤的重要機轉，但越來越多的證據顯示，IFN-γ 可能在惡性腫瘤的病程中扮演了雙面角色⁷⁵。Schreider 在 2011 年提出IFN -γ 乃一調節腫瘤免疫防禦機制與腫瘤免疫逃脫機制的調節子。他認為絶大多數的癌化細胞都會透過免疫系統的監控，在大量生長前被移除。但少部份的癌化細胞可能可以在免疫系統的監控下生存下來，持續累績其突變的基因，使其最後能侵犯正常的免疫系統，成為臨床上的惡性腫瘤⁷⁶。

IFN-γ 會促進發炎反應，但也同時會限制發炎反應，以保護反應週邊正常的組織，促進組織的修復與再生⁷⁵。但此種保護機制，也成為腫瘤可以逃過免疫系統監控，持續生長致破壞免疫平衡⁷⁷。目前IFN-γ 被認為抑制免疫的作用，主要是藉由誘發indoleamine 2,3-dioxygenase（IDO），進而使 Treg細胞的生長上升，CTLs 的數量下降^78-80。

1.4 IDO 概論

1.4.1 Tryptophan metabolism pathway 及 IDO 結構

Tryptophan 是人體中必要的胺基酸，大約有百分之一的蛋白質構成皆需要此種胺基酸⁸¹。沒有合成蛋白質的Tryptophan 則主要由二個路徑代謝：1. 經由在 central nerve system（CNS）中的 Tryptophan hydroxylase（TPH）代謝，並合成血清素⁸²。 2. 經由 IDO 及 tryptophan dioxygenase（TDO）將 tryptophan 代謝為

N-formylkynurenine⁸³，最後生成nicotinamide adenine dinucleotide（NAD⁺）。百分

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12

之九十九的tryptophan 都由 IDO 及 TDO 代謝，而其中間產物包括 kynurenine、

3-hydroxy-kynurenine、3-hydroxy-anthranilic acid、quinolinic acid⁸⁴。TDO 主要表現在肝臟，而IDO 表現的地方較多元，包含了肺、腸、副睪及胸腺⁸⁵。1991 年，Taylor 發現IDO 和 TDO 的誘發因子有很大的差異性，TDO 主要由 tryptophan、tyrosine、

histidine、glucocorticoids 和 kynurenine 所誘發，而 IDO 主要由病毒、

lipopolysaccharide 和 IFN 所誘發⁸⁶。1998 年 Munn 發現 IDO 會在人類胎盤中大量表現，其作用為抑制免疫反應，進而保護異體的胎兒免受母體免疫系統的攻擊⁸⁷。因IDO 會使細胞中的 tryptophan 大量代謝，而使周邊的 Treg 細胞數量增加且 T 細胞的增生下降，且促進T 細胞的細胞凋亡。

1978 年 Shimizu 發現了 IDO 和 TDO 只有在代謝 tryptophan 上的功能相似，其結構差異是很大的⁸⁵。1981 年，Watanabe 的研究發現，TDO 為同型四聚體

（homotetrameric），大小為320kDa，而 IDO 為單體（monomeric），大小為41kDa，

而者在胺基酸的序列同源性也不高，只有百分之十一的相同，百分之二十六的相似⁸⁸。晶體結構分析發現IDO 有二個主要的 α-helix，而且有鐵血紅素在中央⁸⁹。而TDO 的作用並不依靠鐵血紅素及氧化還原反應，而 IDO 中的鐵血紅素則提供了進行催化時的氧化能力。1989 年，Sono 發現在 IDO 結構上，共同作用因子的結合位和反應物的結合位是分開的⁹⁰，意味發展非競爭性的IDO 抑制劑的可能性頗高。

編碼IDO 的 INDO 基因其變異性可能導致人類個體間 IDO 的活性差異。INDO 由10 個外顯子構成，在 8p12 染色體上長度大約佔一萬五千個鹼基對，編碼四百零三個胺基酸多肽鏈^91,92。2006 年 Arefayene 從 Coriell 基因資料庫定序九十六個 DNA 樣本，發現了十六個變異，且發現人類 INDO 基因中存在了無作用的對偶基 因⁹³。

1.5 IDO 與癌症之關係

1955 年，Boyland 發現在膀胱癌病人的尿液中，發現了高度上升的 tryptophan，

(24)

13

推測在膀胱癌的病人，其tryptophan 的代謝會上升⁹⁴。而後類似的結果也在乳癌⁹⁵、攝護腺癌⁹⁶、何杰金氏淋巴癌⁹⁷還有血癌⁹⁸的病人身上發現，其尿液都有高量的 tryptophan。1967 年，Rose 在乳癌的病人身上，發現術前尿液中大量的 tryptophan，

在切除腫瘤後，顯著地下降⁹⁵。1984 年 Hayaishi 排除了這種現象由 TDO 引發的可能，確認IDO 為主要的因素，並且從兔子的小腸中分離出 IDO⁹⁹。

針對腫瘤免疫抑制的研究，主要從2003 年開始，Lee 的研究指出，黑色素瘤轉移的淋巴結中，若樹狀細胞呈現IDO 陽性反應，則其預後較差¹⁰⁰。2004 年，

Munn 的研究也指出，在黑色素瘤淋巴轉移前，其前哨淋巴結中，常會出現 IDO 陽性之樹狀細胞¹⁰¹。2004 年，Wolf 發現在發炎性腸疾的病例中，IDO 表現量高者，

其惡性轉變的機率顯著地高於表現量低者¹⁰²。2005 年，Okamoto 在十七例第三期及第四期卵巢癌標本上進行免疫染色，其中集中性（sporadic）的十二例，分散性

（focal）的三例，彌漫性（diffusely）的二例，其百分之五十之存活時間分別為四十一個月、十七個月和十一個月，而IDO 染色為陰性者，其五年存活率為百分之百¹⁰³。2005 年，Astigiano 在小細胞肺癌中，發現 IDO 大量表現在嗜酸性球中，而高量表現的IDO 陽性嗜酸性球與較差的預後有關聯性¹⁰⁴。2006 年，Brandacher 在 143 例大腸直腸癌的病例上進行免疫染色，其中 IDO 表現為陽性的佔百分之三十九點二，共五十六例；IDO 表現為陰性者佔百分之六十點八，共八十七例。陽性者與陰性者相比，其CD3+ infiltrating T cells 有明顯地減少。而 IDO 的表現和腫瘤肝臟轉移的機率有明顯相關。在陰性表現的族群中，百分之七十一的患者都沒有轉移的現象；但在陽性的族群中，只有百分之五十的患者沒有轉移的現象。在存活分析中，IDO 陽性表現為一獨立之預後因子¹⁰⁵。2007 年，Nakamura 在子宫頸癌的病例中發現，IDO 陽性的 Treg 細胞主要集中在腫瘤侵犯的邊緣，而 IDO 的表現量和疾病的病程有關¹⁰⁶。2011 年，Klause 在口腔癌的病人身上，發現 IDO 的表現和較差的預後有關，其中IDO 陰性表現的族群其存活時間中位數為三點一年，

而IDO 陽性表現的族群只有一點三六年，但和腫瘤的大小、分期、轉移都沒有相

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14

關性¹⁰⁷。

本研究希望確認在口腔鱗狀細胞癌的組織切片中，其IFN-γ 和 IDO 之表現有一致性，且侵犯性越強之腫瘤其IFN-γ 及 IDO 的表現量會越高，且與預後有關聯性。

(26)

15

第二章材料與方法

2.1 實驗樣本

本實驗之樣本從1999 到 2007 年 62 例來臺大醫院牙科部口腔顎面外科求診之口腔鱗狀細胞癌病患，其診斷均經常規之組織病理學臨床切片確認。其中包括男性51 例，女性 9 例，平均年齡 53.32 歲，從 32 至 80 歲不等。其腫瘤位置、臨床 TNM 分期、病理分期、細胞分化情況等詳細分布，可參閱附表（表二）。其中，

口腔癌的病患若出現肺、肝、骨、腦部等遠端轉移（distant metastasis），臨床上並不以手術做為治療首選，而無手術時的病理組織標本及病理報告，因此不列入本研究之範疇。

所有標本之取得及使用均經病人同意並簽署同意書。

2.2 標本之固定與包埋

新鮮的標本在手術切取後，立即浸泡於足量的10﹪中性福馬林（formalin）溶液中，使其固定至少二十四小時以上，而後再經例行性的脫水程序後，以石蠟

（paraffin）包埋之，並切成 4μm 厚的切片，再經酸洗過程，以 0.001% poly-L-lysine

（PLL）塗覆於載玻片上後，於 56℃烘箱中進行四小時熱處理，再作進一步的免疫組織化學染色。

2.3 免疫組織化學染色（immunohistochemistry stain）

2.3.1 反應原理

免疫組織化學染色，抗原抗體結合反應（antigen-antibody reaction）之應用，

用以偵測生物分子，在組織中的分布情況。其染色技術採取二次抗體結合，即利用初級抗體（primary antibody）與細胞上的抗原（antigen）結合後，再加入生物素化的次級抗體（biotinylated secondary antibody）與初級抗體結合，接著藉由鏈

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16

黴菌卵白素─過氧化氫酶複合物（streptavidin-peroxidase conjugate）與生物素之間的強結合力，使之與次級抗體結合，最後加入呈色劑（chromogen）來偵測並顯示抗原所在位置。亦可以UltraVision™ Quanto Detection System HRP 檢測系統（非生物素檢測系統）（Thermo Fisher Scientific, Cheshire, UK）來處理。UltraVision™

Quanto Detection System HRP 檢測系統是一種敏銳度極高的產品，可以在有大量內源性生物素的組織切片中達到極高的染色質量，並且達到最大程度上地降低背景染色。以這種方法可以替代抗生物素蛋白鏈黴菌素--生物素機轉，而消除內源性生物素所引起的背景染色，增加判讀的準確度。

本實驗採取實驗樣本之切片，滴入不加初級抗體之抗體稀釋液（antibody dilutor），並進行一整套的免疫組織化學染色程序，作為陰性對照組，結果顯示無任何反應。

2.3.2 初級抗體（primary antibody）的選擇

本實驗所採用的初級抗體為Anti-IDO, clone 10.1 （Millipore, Temecula, CA），

為鼠（mouse）的抗 IDO 之單株抗體（monoclonal antibody）；Anti-human IFN-γ, MD-1

（Biolegend, San Diego, CA），為鼠（mouse）的抗 IDO 之單株抗體（monoclonal antibody）。本實驗將初級抗體，以抗體稀釋液（antibody dilutor, Ventana Medical Systems）分別稀釋成 1:200、1:300、1:500、1：800 等梯次濃度進行試驗性染色，

觀察其呈色效果，而以其中1:200 的稀釋濃度所表現之染色鑑別力適中、反應時間恰當，故以此濃度進行實驗。在本實驗中，為定量染色強度（Staining Intensity），

所有玻片染色時間均為五分鐘。

2.3.3 抗原抗體結合之偵測系統

本研究中，染色切片以UltraVision™ Quanto Detection System HRP 檢測系統

（非生物素檢測系統）（Thermo Fisher Scientific, Cheshire, UK）來處理。

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17

UltraVision™ Quanto Detection System HRP 檢測系統擁有高敏銳度，且可有效避開內源性生物素引起的背景染色，強化染色結果的清晰度與鑑別度。

2.3.4 實驗步驟

（1）脫蠟及復水（deparaffinization and rehydration）

將切片依序分別浸泡於三缸純二甲苯（xylene）溶液中脫蠟，每缸分別浸泡五分鐘。脫蠟後依序浸泡於濃度遞減之酒精溶液中覆水：100%無水酒精兩缸，95%

及80%酒精各一缸，每缸各浸泡 3 分鐘。而後置於流清水（running water）中沖洗五分鐘。

（2）組織抗原性恢復處理（antigen retrieval）

包埋成蠟塊的組織切片，欲染色的細胞蛋白在包埋過程中，可能被其他分子所掩蓋，而喪失其組織抗原性。組織抗原性恢復處理的目的為使用加熱或化學、

生物酵素處理等方法，將細胞表面的抗原再次呈現出來，使抗體得以與之結合。

本研究使用組織抗原性恢復處理為將組織切片浸泡於二百倍稀釋之Trilogy™（Cell Marque, Rocklin, California）下，以微波爐中火加熱十分鐘。而後於流動清水中進行冷卻，冷卻時間為十分鐘。冷卻後放入三缸PBS 中各潤洗一分鐘。

（3）阻斷內生性過氧化氫酶（blocking endogenous hydrogen peroxidease）

將組織切片滴上Hydrogen peroxide block™（Thermo Fisher Scientific, Cheshire, UK），均勻分佈於標本上後靜置十分鐘，以阻斷內生性過氧化氫酶，防止偽陽性反應，之後置於二缸的PBS 中各潤洗三分鐘。

（4）阻斷非特異性抗原（non-specific antigen）的結合

於組織切片上分別滴上UltraVision™ Quanto Detection System HRP 中的 Ultra

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V block™（Thermo Fisher Scientific, Cheshire, UK），均勻分佈於標本上後靜置五分鐘，以阻斷非特異性之背景染色。

（5）初級抗體作用

切片上滴加2 滴（約 0.1 ml）稀釋好的抗體溶液（IDO or IFN-γ，稀釋倍率 1:200），靜置於 4℃下隔夜作用。次日再以 PBS 潤洗三次，每次各為三分鐘。

（6）偵測抗原抗體結合系統

首先滴上UltraVision™ Quanto Detection System HRP 中的 Primary antibody amplifier quato™（Thermo Fisher Scientific, Cheshire, UK），在室溫下作用十分鐘，

用以增加下一劑HRP Polymer Quanto™的作用，接著以 PBS 潤洗三次，每次三分鐘。其次，滴入HRP Polymer Quanto™，置於室溫下作用十分鐘，後再以 PBS 潤洗三次，每次各三分鐘，以洗去多餘之次級抗體-過氧化氫酶複合物。

（7）呈色

組織切片所使用之呈色劑為DAB Quanto™ （Thermo Fisher Scientific, Cheshire, UK），配製方式為 1ml DAB Quanto Substrate 加入 30µl DAB Quanto Chromogen，均勻混合後，於組織切片上各滴加 200μmL，置於室溫下作用，呈色

時間控制為5 分鐘。呈色時會出現褐棕色反應產物，待反應時間結束，迅速將玻

片置入PBS 中潤洗二次，每次各三分鐘，以終止呈色反應並洗去多餘之呈色劑。

（8）背景染色（Counter staining）

將切片置於Mayer’s 蘇木紫（hematoxylin）染色液中約四分鐘後，浸入清水中八次，而後置入PBS 中潤洗一分鐘，再置入流動清水中沖洗三分鐘，將附著之多餘染劑去除。背景染色的時間會因Mayer’s 蘇木紫（hematoxylin）染色液之濃

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19

度、室溫高低而有所調整，控制誤差時間小於1 分鐘。切片背景染色的程度，控

制在光學顯微鏡下能夠清楚觀察到切片細胞之細胞核、便於染色細胞之計數

（counting），且其染色程度不蓋過原本的免疫組織化學呈色為準則。

（9）脫水

將玻片浸泡於三缸100％酒精溶液中脫水，每缸各浸泡一分鐘，後依序置入二甲苯三缸，每缸各浸泡一分鐘，完成脫水步驟。

（10）封片（mounting）

組織切片經脫水後，以組織封片膠（histomount Entelan）進行封片，乾燥後即完成免疫組織染色，後以顯微鏡觀察染色結果。

2.4 免疫組織化學染色後之觀察與記錄

2.4.1 觀察

以光學顯微鏡觀察各染色標記於組織切片上之呈色。主要觀察部位為1. 腫瘤細胞巢（tumor cell nest）中。2. 基底層（basal layer）。3. 基底旁層（parabasal layer）。 4. 棘狀層（spinal cell layer）。5. 腫瘤周邊發炎浸潤細胞（infiltrating cells）

2.4.2 染色程度之定量

記錄IDO 之表現，判讀染色結果採用陽性染色指標（labeling index），其方法統一為：每一樣本在400x 的視野下，隨機選擇 5 個區域，觀察其的陽性染色細胞佔所有癌細胞之比例（labeling index）。

記錄IFN-γ 之表現，判讀染色結果採用陽性染色指標（labeling index），其方法統一為：每一樣本在400x 的視野下，隨機選擇 5 個區域，觀察其的陽性染色細胞佔所有腫瘤周邊發炎浸潤細胞（infiltrating cells）之比例（labeling index）。

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20

2.4.3 臨床變數之紀錄

複查口腔鱗狀細胞癌患者臨床紀錄之文件來源包括：病歷正本、病歷縮影、

與癌症登記室的追蹤資料。

記錄的項目包括：病人的性別、年齡、TNM 臨床分期、癌症發生部位、術後是否復發、發生局部或遠端轉移、死亡時間、口腔鱗狀細胞癌細胞分化程度、手術後病理組織的五個危險因子，即腫瘤切除邊緣是否遭腫瘤侵犯（margin

involvement）、腫瘤的是否產生頸部淋巴結外擴散（extranodal extension 或稱為 extracapsular spread）等、原發腫瘤處之血管淋巴侵犯（lymphovasvular invasion）、

神經周邊侵犯（perineural invasion）以及有兩顆以上局部轉移的淋巴結（metastatic lymph nodes≧2）。

評估病人的TNM 臨床分期採用 AJCC 於 2010 年出版之修訂版。依據臨床電腦斷層掃描（CT）或磁振造影（MRI）的結果，評估包括原發腫瘤大小、腫瘤有無侵犯鄰近組織、是否局部淋巴結轉移及遠處器官轉移等因子，決定病患腫瘤的 TNM 臨床分期。

口腔癌是否產生復發，以病患切片或手術的病理報告為依據，比較前後兩次發生的口腔癌在解剖位置的關聯性、腫瘤細胞型態及分化情形，判斷為復發或二次原發（second primary）之口腔癌。復發之排除條件為：1. 若第一次手術之切除邊緣遭腫瘤侵犯（margin involvement），則定義三個月內、於相同解剖位置再發之口腔癌為殘存腫瘤（residual tumor），不歸類為復發；2. 若前後二次口腔癌位於不同解剖位置，且在解剖構造上缺乏連續性，如左側及右側頰黏膜、上顎與下顎等，

也不定義為復發的口腔癌。

2.4.4 統計分析

本研究之資料以下列統計套裝軟體進行分析：IBM SPSS Statistics 20 （IBM

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21

Corporation, New York, USA）

1. 利用 linear regression 分析 IDO 和 IFN-γ表現量之因果關係。

2. 利用 Chi-square test 或 student’s t-test 分析 IDO 和 IFN-γ 於 OSCC 的表現與臨床參數間的差異性。

3. 利用point-biserial correlation、Pearson correlation、Spearman correlation 分析 IDO 和IFN-γ 於 OSCC 的表現與臨床參數間的關聯性。

4. 利用 Kaplan-Meier method 分析 IDO 和 IFN-γ 表現與存活率之關係。再利用 Log-rank test 進一步推論 IDO 和 IFN-γ 表現是否與 OSCC 患者的存活時間有統計上相關性。

5. 利用 Cox proportional hazard regression model，評估單變數及多變數影響下與

存活之預後關係，以單變數分析評估存活率與何種臨床參數以及是否跟IDO

和IFN-γ 表現量有關，以多變數分析決定存活率的獨立因子，藉以了解 IDO 和IFN-γ 表現所扮演的重要性。

各項統計分析均以p <0.05 判定為有意義。

(33)

22

第三章結果

3.1 IDO 和 IFN-γ於口腔鱗狀細胞癌（OSCC）之表現

本研究利用IDO 和 IFN-γ 單株抗體，以免疫組織化學染色的方法，檢測 IDO 和IFN-γ 在 62 例口腔鱗狀細胞癌標本中的表現情形，經光學顯微鏡觀察後將其染色結果與病患各項臨床變數、組織病理學參數及五項組織病理危險因子

（pathological risk factors）等做比較，了解有無關聯性。

IDO 染色的組織切片中，觀察的目標為口腔癌標本中的口腔癌細胞或腫瘤巢細胞，以及口腔黏膜的上皮細胞。就腫瘤巢細胞而言，基底細胞是指癌細胞巢最外圍細胞；基底上細胞是指基底細胞以內三層之細胞；棘細胞則是指上述四層細胞之外的癌細胞巢中央細胞區。而就口腔黏膜上皮細胞來說，基底細胞是指上皮中最底層的細胞；基底上細胞指基底細胞以上之三層細胞；棘細胞是指上述四層細胞之外的上皮細胞。IDO 主要存在於細胞質中。在免疫組織化學染色時，陽性染色會出現於細胞核質。觀察口腔鱗狀細胞癌標本上IDO 的染色情形，在腫瘤細胞巢有較高比例且較高染色強度（staining intensity）陽性染色（positive staining）

的趨勢。其陽性染色的位置，基底細胞層染色程度較強，基底上細胞與棘細胞層染色強度較弱（圖一）。

IFN-γ 染色的組織切片中，觀察的目標為口腔癌標本中，環繞口腔癌細胞或腫瘤巢細胞周圍的發炎浸潤細胞（infiltrating cells）。腫瘤細胞的周圍，伴隨有發炎反應，許多發炎細胞趨向並堆積於細胞中或細胞間質裡，此為人體抗組織損傷的正常防禦反應。這些細胞包含有淋巴球、巨噬細胞等等免疫細胞，IFN-γ 主要由這些細胞所分泌，進而對周圍其他的免疫細胞或腫瘤細胞產生作用。因此在發炎浸潤細胞及腫瘤細胞中，包含腫瘤細胞各層，皆可看到IFN-γ 的陽性染色（圖一）。

將染色情形以陽性標記指數（positive labeling index）呈現，IDO 染色組織切片的平均陽性標記指數為29.2±3.7，IFN-染色組織切片的平均陽性標記指數為

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23

55.8±3.3；而 IDO LI 超過 40 的標本佔所有標本之 27.12%，IFN-γ LI 超過 40 的標本佔所有標本之79.66%。Pearson’s correlation 顯示二者的相關系數為 0.41，統計上為高度相關（p=0.001），而經迴歸分析後，二者之R square 為 0.17，以 IDO LI 為依變數，其常數項為44.67（p=0.000），係數為 0.35（p=0.001），F 為 11.68

（p=0.001），而以 IFN-γ LI 為依變數，其常數項沒有統計意義，而係數為 0.48

（p=0.001）。（表一）線性迴歸圖形如（圖二）。

3.2 免疫組織化學染色結果與患者臨床及組織病理各項參數之關係

（1）病患年齡

本研究中，定義病患之年齡為『病患罹患口腔癌，並接受手術切除，取得本

次染色所使用之病理標本』時的年齡，可視為病人此次口腔癌之發病年齡。在62

例口腔鱗狀上皮細胞癌患者中，病患年齡介於32 至 80 歲之間，平均年齡為 53.32 歲，主要分布年齡為40-60 歲，佔 59.7%。將病患以年齡 50 歲做區分，小於等於 50 歲者共 24 人，大於 50 歲者共 38 人。與 IDO 平均陽性標記指數的關係，小於等於50 歲組平均為 27.3±5.7，大於 50 歲組平均為 30.4±5，二組別之差異使用 Student’s t test 分析，並未達到統計上的顯著（p=0.688）。與IFN-γ 平均陽性標記指數的關係，小於等於50 歲組平均為 56.1±4.2，大於 50 歲組平均為 55.4±5.4，二組別之差異使用Student’s t test 分析，並未達到統計上的顯著（p=0.926）。（表二）

在關聯性分析上，IDO 平均陽性標記指數之相關係數為 0.065（p=0.613），不具明顯相關性；IFN-γ 平均陽性標記指數之相關係數為 0.010（p=0.940），不具明顯相關性。（表四）

（2）病患性別

統計62 例口腔癌患者，其中包括男性 53 例，女性 9 例，男女比約為 9:1。利用Student’s t test 分析其 IDO 平均陽性標記指數，結果男性平均為 27.8±4.0，低於

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女性患者平均37.2±10.9，未達到統計上的意義（p=0.499）（表二）；IFN-γ 平均 陽性標記指數，結果男性平均為53.96±3.6，低於女性患者平均 66.67±7.1，未達到統計上的意義（p=0.276）。（表三）

在關聯性分析上，IDO 平均陽性標記指數之相關係數為 0.040（p=0.760），不具明顯相關性；IFN-γ 平均陽性標記指數之相關係數為-0.147（p=0.255），不具明顯相關性。（表四）

（3）腫瘤原發位置（primary site）

本研究中定義口腔癌病患原發腫瘤的位置，參考病歷原本記載、病理報告之

內容及病人腫瘤期別檢查時磁振造影為判斷依據。在62 例口腔癌病患中，腫瘤原

發位置以發生於頰黏膜最多，共27 例，IDO 平均陽性標記指數為 24.4±5，IFN-γ 平均陽性標記指數為52.2±4.6；其次為發生於舌部，共 23 例，IDO 平均陽性標記指數為34.4±22.9，IFN-γ 平均陽性標記指數為 55.2±5.9；發生於口腔其他部位如唇部、牙齦、口底、軟或硬腭共12 例，IDO 平均陽性標記指數為 30.0±9.4，IFN-γ 平均陽性標記指數為65.0±6.6，三組以 ANOVA 分析的結果，並未達到統計上的顯著意義（p=0.497）（p=0.370）。（表二）（表三）

（4）腫瘤 TNM 臨床分期

1.原發腫瘤大小與侵犯解剖位置（T status）

口腔癌病患的原發腫瘤，在臨床上可依腫瘤大小及腫瘤是否侵犯周邊其他解剖構造分為T1、T2、T3、T4（含 T4a 及 T4b）四期。本研究中將腫瘤較小的 T1 及T2 病患歸類為一組，腫瘤較大侵犯較深的 T3 及 T4 病患歸類為一組，並以 Student’s t test 分析此二組病理標本在平均陽性標記指數是否有差異。T1 及 T2 組共計36 例，IDO 平均陽性標記指數為 28.6±5.1，IFN-γ 平均陽性標記指數為 57.8±4.5，T3 及 T4 組共計 26 例，IDO 平均陽性標記指數為 30±5.5，IFN-γ 平均陽

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性標記指數為53.1±5.0，二者差異未達到統計上的顯著（p=0.682）（p=0.975）。（表二）（表三）

在關聯性分析上，IDO 平均陽性標記指數之相關係數為 0.311（p=0.014），具明顯相關性；IFN-γ 平均陽性標記指數之相關係數為 0.210（p=0.102），不具明顯相關性。（表四）

2.腫瘤局部淋巴結轉移（N status）

以手術後的病理報告為依據，將本研究之62 例口腔癌病患區分為無頸部淋巴結轉移（N0）及有淋巴結轉移（N1+N2+N3）兩組；N0 組共 44 例，IDO 平均陽性標記指數為25.6±4.2，IFN-γ 平均陽性標記指數為 55.6±4.1，N1+N2+N3 組共 18 例，IDO 平均陽性標記指數為 38.1±7.4，IFN-γ 平均陽性標記指數為 56.4±5.4，二者皆高於N0 組，但以 Student’s t test 分析，未有統計上之意義（p=0.790）

（p=0.143）。（表二）（表三）

在關聯性分析上，IDO 平均陽性標記指數之相關係數為-0.016（p=0.904），不具明顯相關性；IFN-γ 平均陽性標記指數之相關係數為-0.098（p=0.447），不具明顯相關性。（表四）

3.口腔癌分期（Stage, S）

口腔癌病患依照其TNM 分級，可分期為第一期（Stage1）至第四期（Stage 4）。

將本研究中之口腔癌病理標本，依照病患臨床之口腔癌分期分為兩組：屬於較早期的第一期及第二期（S1+S2）、及較晚期的第三期及第四期（S3+S4）；S1+S2 組共27 例，IDO 平均陽性標記指數為 26.7±5.9，IFN-γ 平均陽性標記指數為 58.2±5.7，

S3+S4 組共 35 例，IDO 平均陽性標記指數為 31.14±4.8，IFN-γ 平均陽性標記指數為54.0±4.0。以 Student’s t test 比較二組染色結果，可發現 S3+S4 組平均 IDO 陽性標記指數高於S1+S2 組，但未具有統計上之意義（p=0.751）。（表二）（表三）

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在關聯性分析上，IDO 平均陽性標記指數之相關係數為 0.265（p=0.038），具明顯相關性；IFN-γ 平均陽性標記指數之相關係數為 0.132（p=0.308），不具明顯相關性。（表四）

（5）腫瘤組織病理切片之風險因子（risk factors）

組織病理切片風險因子，為手術後取得之口腔癌標本，在顯微鏡下觀察腫瘤浸潤的情形，歸類為具有較高侵犯性、高腫瘤復發率、低五年存活率的指標。本

研究依照口腔癌患者的病理報告內容，紀錄是否具有此五項風險因子，並與IDO

及IFN-γ 平均陽性標記指數，分析是否具有關聯性及臨床上的意義。

1.手術切除邊緣遭腫瘤侵犯（margin involvement）

此定義為手術的切除邊緣可觀察到腫瘤細胞。意味手術時未能根除，而有殘存腫瘤的存在。在本研究中，切除邊緣可見腫瘤，或切除之安全距離（safety margin）

小於1mm，均紀錄為 margin（+）；切除邊緣未遭腫瘤侵犯記為 margin（-）。切除邊緣是否遭腫瘤細胞侵犯，雖影響口腔癌病患的術後存活率，但與手術過程之關聯性較大，不直接具有分子生物學上的指標意義。由統計的結果觀察，margin（+）

的病理標本共7 例，其 IDO 平均陽性標記指數為 32.9±12.1，IFN-γ 平均陽性標記指數為72.1±4.3；margin（-）的病理標本共 55 例，IDO 平均陽性標記指數為 28.7±29.2，IFN-γ 平均陽性標記指數為 53.7±3.6，由 Student’s t test 分析，IDO 在二組間統計上並未達到顯著（p=0.718）。（表五） IFN-γ 的表現，margin（+）組大於margin（-）組，統計上有顯著意義（p=0.020）。（表六）

在關聯性分析上，IDO 平均陽性標記指數之相關係數為-0.001（p=0.991），不具明顯相關性；IFN-γ 平均陽性標記指數之相關係數為 0.147（p=0.038），具明顯相關性。（表七）

2.具有淋巴結外擴散（extracapsular spread, ECS）

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指的是口腔癌病患具有頸部的淋巴結擴散（lymph node metastasis），且在顯微鏡觀察下，癌細胞穿破淋巴結外層包被（caspule），擴散至淋巴結外的結締組織。

免疫組織化學染色的結果，ECS（+）者共計 8 例，IDO 平均陽性標記指數為 45.63±11.6，IFN-γ 平均陽性標記指數為 59.4±10.1；ECS（-）共計 54 例，IDO 平均陽性標記指數為28.5±3.9，IFN-γ 平均陽性標記指數為 55.3±3.5。ECS（+）的 IDO 及IFN-γ 平均陽性標記指數雖然較高，但以 Student’s t test 分析，未達統計上顯著

（p=0.735）（p=0.687）。（表五）（表六）

在關聯性分析上，IDO 平均陽性標記指數之相關係數為-0.038（p=0.770），不具明顯相關性；IFN-γ 平均陽性標記指數之相關係數為-0.021（p=0.869），不具明顯相關性。（表七）

3.腫瘤原發部位侵犯血管淋巴系統（lymphovascular invasion, LVI）

腫瘤的原發處若侵犯周邊的血管淋巴系統，紀錄為LVI（+）；無侵犯則紀錄為 LVI（-）。LVI（+）共計 8 例，IDO 平均陽性標記指數為 33.8±13.2，IFN-γ 平均陽性標記指數為59.4±9.9；LVI（-）共計 54 例，IDO 平均陽性標記指數為 28.5±3.9，

IFN-γ 平均陽性標記指數為 55.3±3.5。結果顯示，腫瘤原發部位侵犯血管淋巴系統組其IDO 及 IFN-γ 平均陽性標記指數較無侵犯組高，但以 Student’s t test 檢測，未達統計上之顯著意義（p=0.144）（p=0.687）。（表五）（表六）

在關聯性分析上，IDO 平均陽性標記指數之相關係數為 0.061（p=0.639），不具明顯相關性；IFN-γ 平均陽性標記指數之相關係數為 0.146（p=0.044），具明顯相關性。（表七）

4.腫瘤原發部位侵犯神經周邊（perineural invasion, PNI）

腫瘤的原發處若侵犯至神經週邊組織或浸潤至神經細胞，紀錄為PNI（+），無侵犯者紀錄為PNI（-）。在 62 例口腔癌患者之標本中，PNI（+）者共 11 例，IDO