內質網壓力對細胞的影響

為了要了解內質網壓力對細胞傷害的影響是否與 PP2A 次單位 PPP2R2B 活性有密切的關係，本實驗利用 Tunicamycin (TM)做為內質

網壓力的來源，探討內質網壓力是否也會影響過度表現 PPP2R2B 穩 定細胞株的影響，TM 利用抑制蛋白質的 N 端醣化作用(N-glycosylation) 使內質網壓力產生，且有許多研究顯示 TM 所引起的內質網壓力會造 成細胞自噬的產生，最後導致細胞凋亡(Ogata et al., 2006)。

本實驗採用研究低劑量 0.1μM 的 TM 處理的細胞，因為參考 前人實驗，細胞再在 0.1μM 的 TM 可以存活超過 24hr，但經高濃度 TM 處理的細胞，會立刻造成細胞死亡(Hsu, 2006)，所以本實驗 TM 的 最終濃度決定為 0.1μM。而從實驗結果得到 SK-N-SH 和 Bβ1 不受 TM 影響，但 Bβ2 則大幅降低活細胞數。這樣結果顯示 PPP2R2B 過 度表現的位置不同，受到內質網壓力對細胞的影響也會不同。可是是 因為 PPP2R2B 可以去磷酸化細胞內的蛋白，會影響細胞的生長速率 (Mochida et al., 2009)，所以當粒線體過度表現 PPP2R2B 時，更易引起 細胞自噬與凋亡，過去的文獻報導也證實神經細胞會因內質網壓力所 誘發的細胞凋亡而死亡符合(Wang et al., 2011)。

在內質網壓力對於 Bβ2 細胞所產生的細胞凋亡過程中，預處理 3-MA 卻可以拯救受到內質網壓力而引起細胞凋亡的 Bβ2 細胞株。本

實驗以螢光顯微鏡照相確定了內質網壓力僅為促進 Bβ2 細胞的自噬 溶酶體的生成，在由細胞週期觀察到細胞凋亡指標 sub-G¹的上升，證 實引起細胞凋亡是源自細胞自噬途徑，而且皆於溶酶體發生。由上述

結果，我們推測當粒線體過度表現 PPP2R2B 時，會提升細胞對內質 網壓力的敏感度，並且誘導更多的細胞自噬而導致細胞凋亡。

程式性死亡可分為 casepase 依賴性途徑和非 caspase 依賴性途徑，

前者需要活化 caspase-3 等蛋白來引發細胞凋亡。而 caspase 非依賴性 途徑則有許多不同路徑，包括細胞自噬、粒線體途徑、甚至有研究顯 示 Bcl-2 蛋白過度表現時，不需 caspase 活化就能直接引起細胞凋亡。

不過以目前的研究來說，細胞自噬占了 caspase 非依賴性途徑的最主 要比例。本實驗經由 western bolt 也證實了 TM 不會引起 SK-N-SH、B β1 或 Bβ2 細胞的 caspase-3 蛋白活化，由此可證明走的是非 caspase 依賴途徑，也就是所謂的，同時，若我們抑制了細胞自噬的現象，反 而會使 Bβ2 細胞的存活率提高。加上前述螢光顯微鏡觀察到結果，

我們可以結論 TM 所造成 Bβ2 細胞程式性死亡是採取非 caspase 依賴 性途徑之中的細胞自噬，這些實驗結果皆可證明，內質網壓力會造成 粒線體過度表現 PPP2R2B 神經母細胞的第二型的細胞程序性死亡 (Type II Programmed cell death)，也就是細胞自噬所引起的細胞凋亡。

但我們依然無法排除其他蛋白參與的可能，尤其是細胞自噬一般都發 生在 caspase 活化之前，是否因此影響到 caspase 的活化？在時間順序 上的關係也待我們進一步研究。

3-MA 主要作用在自噬初期抑制前自噬泡的形成，我們猜測，使

細胞質中的 PI3KⅢ與 ATG 相關分子無法結合(Petiot et al., 2000)，在細 胞質的位置就已經阻止細胞自噬，而不至於影響到粒線體而導置後續 的凋亡發生，所以就算是粒線體過度表現 PPP2R2B，細胞在內質網壓 力下，短時間內依然維持一定的正常生理狀態。至於 PPP2R2B 如何 引發細胞自噬？這現象是否與 Akt pathway 活化有關，未來仍應使用 不同的抑制劑作更深入的研究。

三、 低氧環境對細胞的影響

環境壓力除了飢餓壓力與內質網壓力外，低氧環境也是造成細 胞凋亡的主要來源(Tofighi et al., 2006)，同時當細胞處於低氧環境的時 候，PP2A的活性會下降。本實驗觀察到細胞質與粒線體過度表現 PPP2R2B的Bβ1細胞株與Bβ2細胞株，在低氧環境中培養時間越長，

sub- G¹的百分比就升高越多，顯示過度表現PPP2R2B的細胞容易對低 氧環境敏感，造成PP2A的活性下降，又因PP2A可去磷酸化細胞週期 後期蛋白，所以我們可推估S期和G2期中的蛋白被異常磷酸化，導致 細胞無法順利複製DAN和胞器而無法正常進行細胞分裂，最後走向細 胞凋亡或者細胞自噬。目前已經知道可能的蛋白質有

Ca/calmodulin-dependent kinase IV (CaMK IV)等(Truttmann et al., 2004)，

我們希望可以進一步證實更多細胞週期的蛋白與低氧環境壓力造成

PPP2R2B過度表現的細胞株之間的關連性，其中Bβ2細胞無論在sub- G¹或S期與G2期的百分比總合受到低氧環境影響的程度都比Bβ1來 得嚴重，因此可以推估低氧壓力主要是針對粒線體方面的pathway作 用，需要更多粒線體指標蛋白做進一步的確認。

另外，在低氧環境中培養的細胞，反應時間較前兩種環境壓力 來的長許多，在細胞週期的觀察方面，24小時內並無出現明顯變化，

要一直到48小時以上，sub-G¹才有顯著的上升。我們推論低氧壓力所 造成的細胞損傷，與粒線體無直接的關係，可能是走不同途徑影響細 胞的存亡。也因為低氧壓力不影響粒線體，所以低氧壓力不會產生細 胞自噬，比較可能採取非粒線體相關的細胞凋亡途徑（外因式途徑）。

另外，細胞在短時間缺氧的情況下，透過缺氧誘導因子

(Hypoxia-inducible factor 1- alpha, HIF-1α)調控下游基因的表現，使細 胞更易增生，而不會直接走向凋亡，需要造長時間的低氧環境下，細 胞才會死亡。缺氧誘導因子與PPP2R2B之間是否有交互作用或彼此影 響，以及低氧壓力依循何種途徑造成細胞死亡，將是我們未來繼續探 討的方向之一。

此外本研究也探討其他藥物對 Bβ 系列細胞株所可能引起細胞凋亡，

如：白藜蘆醇(Jang et al., 1997)，但皆無法抑制 HBSS 和 TM 所誘發的

細胞凋亡，因此可以推測白藜蘆醇之類抗氧化劑並不能有效抑制細胞 凋亡，而是應由抑制細胞自噬方向著手。且不同抑制細胞自噬的途徑 會針對不同環境壓力造成的傷害各有專一性影響。