本實驗採用的培養基與化學藥物如表一與圖一
一、 飢餓壓力對 Bβ1 與 Bβ2 細胞的影響
本實驗以 HBSS 作為飢餓壓力之來源，將先前已建立的三株細胞 SK-N-SH、Bβ1 與 Bβ2 培養於 HBSS 培養基中，於特定時間觀察細 胞表型的變化；並以完整培養基(含有 10%胎牛血清的 DMEM)養殖的 細胞做為控制組。
細胞在經過 HBSS 培養 3 小時候，以 JC-1 染劑染色，再以流式細胞儀 觀察螢光分佈的情形。當粒線體膜電位維持正常情況下，JC-1 分子會 結合到粒線體膜上，激發出紅色螢光，當粒線體受損，膜電位下降，
JC-1 分子就會從膜上游離出來，紅色螢光激發量就會下降。可以發現 Bβ1 細胞經由 HBSS 處理後，紅色螢光大量的減少，在一維分布圖 上明顯的往右移，而 SK-N-SH 和 Bβ2 膜電位沒有顯著改變(圖二 A)。
由量化圖顯示，Bβ1 在 HBSS 處理後，紅色螢光比例有明顯下降，
而 SK-N-SH 與 Bβ2 的螢光比例並沒有差異(圖二 B)
由細胞計數(Countess)測定經過飢餓壓力處理後的活細胞的數目，實驗 顯示預先以 5ng/ml 處理的 Bafilomycin A1 後，再於 HBSS 中培養 6 小
時的 Bβ1 與僅有 HBSS 環境的 Bβ1，活細胞數有顯著差異；但在 HBSS 環境下 12 小時，預處理 Bafilomycin A1 並不能提高 Bβ1 的活 細胞的數目。本實驗同時也添加了白藜蘆醇(Resveratrol)預處理，不過 並無任何影響(圖三 A)。除了 Bafilomycin A1 之外，本實驗也有採用另 一常見之細胞自噬抑制劑 3-MA，以 10μM 濃度分別預處理 SK-N-SH、
Bβ1 與 Bβ2 細胞 24 小時，在於 HBSS 培養基中培養 6 或 12 小時。
結果顯示預處理 3-MA 並不會使 Bβ1 因 HBSS 造成的活細胞數下降 無論是 6 或 12 小時有所回復；至於 SK-N-SH 與 Bβ2 細胞，3-MA 對 其並不會有任何影響(圖三 B)。
由上述結果可以看出 HBSS 會對 Bβ1 造成傷害，而對於 SK-N-SH 與 Bb2 較不影響，本實驗繼續以細胞週期分析作為進一步佐證。結果顯 示，以 HBSS 培養 9 及 12 小時的 Bβ1 細胞，其 sub-G1 期分布較完整 培養基環境下多，且隨著時間增加，sub-G1 期百分比也隨之增加；而 SK-N-SH 與 Bβ2 在相同條件下未有此現象(圖四)。其實驗若先以濃 度 10μM 的 3-MA 預處理 24 小時，再將細胞培養在 HBSS 中，結果 顯示不論是 9 或 12 小時，sub-G1 期比例皆無下降，與僅以 HBSS 處 理的結果差異並不顯著(圖五)。但我們改以 Bafilomycin A1 預處理細 胞，再來觀察受到 HBSS 培養 6 或 12 小時後的細胞週期分部狀態，
反而可以觀察到在 6 小時的時候，Bβ1 細胞就因 HBSS 所造成的飢
餓壓力而出現較多的 sub-G1期百分比，且與正常培養條件的 sub-G1有 顯著差異，但先以 Bafilomycin A1 預處理的 Bβ1 細胞其 sub-G1期百分 比卻未有顯著提升(圖六 A)。但若當 HBSS 培養時間延長至 12 小時，
無論 Bβ1 細胞有無預先處理細胞自噬抑制劑 3-MA 或 Bafilomycin A1，
sub-G1期百分比皆會有大幅度的提升，無法抑制 sub-G1期細胞的分布。
至於 SK-N-SH 與 Bβ2 細胞，無論是預處理 3-MA、Bafilomycin A1 或 單純以 HBSS 培養 6 及 12 小時，皆不會對 sub-G1期百分比產生影響(圖 六 B)。可以看出細胞自噬能夠維持 Bβ1 細胞在營養缺發初期存活，
具有顯著效果，但隨著時間持續，反而會加速推動細胞凋亡。
二、 內質網壓力對 Bβ1 與 Bβ2 的影響
過去已有文獻指出內質網壓力會引起細胞凋亡(Li et al., 2006)，
本論文使用 TM 做為誘發內質網壓力的來源。
實驗使用 0.1μM 的 TM 處理細胞株 48 小時後，再以細胞計數 器測量活細胞數與總細胞數。結果顯示，SK-N-SH 及 Bβ1 細胞株在 TM 處理前後，活細胞數目並任何差異，但對於 Bβ2 細胞存活則有 明顯的抑制效果。接著以細胞自噬抑制劑 3-MA (10 μM) 對細胞預 先處理 24 小時，再以正常培養基培養 48 小時，結果顯示 3-MA 不會 影響細胞的正常生長，但若是以 3-MA 預處理，再將細胞培養在添加
TM 的環境下，細胞自噬抑制劑會讓原本走向凋亡的 Bβ2 細胞，維 持較多的活細胞數目(圖七)。
內質網壓力會影響表現 PPP2R2B 穩定細胞株的存活率後，繼續 探討內質網壓力對細胞週期的影響，實驗利用流式細胞儀觀察細胞的 週期變化。從流式細胞儀的圖譜中，可以清楚的看到 SK-N-SH 和 B β1 在不同條件的處理之下，sub-G1期細胞數目並沒有明顯的改變，
而 Bβ2 受到 TM ( 0.1μM ) 處理 24 小時後，sub-G1期細胞雖然也沒 有明顯的增加(圖八)，但若將藥物處理時間延長至 48 小時，則 sub-G1 期細胞會有顯著增加 (圖九)。實驗同以也有使用 TG 作為內質網壓力 的來源，此藥物對細胞的傷害較大，在 0.1μM 處理 48 小時候，
SK-N-SH 與 Bβ1sub-G1期皆將近 30％左右(圖十)。
將圖譜統計換算，可以觀察到無論是 SK-N-SH、Bβ1 或 Bβ2 細胞株，在經過 TM ( 0.1 μM )處理 48 小時後，所有細胞週期中的 S 期都有下降的趨勢，而 G1期的百分比則會相對的增加，但在 sub-G1 期部分，只有 Bβ2 細胞其 sub-G1期百分比會由未經藥物處理前的 5%，
提昇至加藥處理後的 25%，而 SK-N-SH 及 Bβ1 細胞株的 sub-G1期的 百分比則無明顯改變(圖十一)。由此可知，Bβ2 細胞株存活率下降的 結果，可對應細胞週期的實驗結果：sub-G1期的大幅提高，證實了 B β2 細胞株的死亡是經過細胞凋亡而造成。為了進一步了解凋亡的原
因是否與細胞自噬相關，實驗加入 3-MA 預處理細胞觀察其變化。我 們先將細胞以 10μM 的 3-MA 預先處理 24 小時後，將其移除，再以 0.1μM 的 TM 處理 48 小時，觀察細胞存活率和細胞週期的分布。結 果顯示，即便受到內質網壓力，所有細胞的活細胞數目依然與正常環 境下沒有差異，表示經由 3-MA 處理的 Bβ2 細胞株可以抑制內質網 壓力對細胞存活率的影響。對於經由 3-MA (10μM) 預先處理後細胞 週期的變化，發現 Bβ2 的 sub-G1期從原先 TM ( 0.1μM ) 處理過後的 25% 降低至 17% 左右，雖然未能回復至控制組的 5%，但可再次證 明經過細胞自噬抑制劑 (3-MA) 處理的 Bβ2 細胞株可以顯著降低內 質網壓力所引發的細胞凋亡。
實驗更進一步探討經由 TM ( 0.1μM ) 處理過後的 PPP2R2B 穩 定細胞株發生細胞自噬作用標記的改變，實驗利用轉殖 LC3 質體，
觀察自噬小體的生成，並用 LysoTracker 去確認溶酶體的位置，包括 激發綠色螢光的 LC3，和激發紅色螢光的溶酶體 LysoTracker。
結果顯示，不論在 SK-N-SH 或 Bβ1 細胞株，無論有經 TM 處 理與否，綠色螢光都無明顯的聚集，而是均勻的散布在細胞內，代表 游離型 LC3-I，顯示自噬小體並無生成(圖十二 A)。但 Bβ2 細胞經過 0.1μM 的 TM 處理 12、18、24 小時之後，隨著時間的增加，綠色螢 光斑點(puncta)會越來越明顯，代表聚合型 LC3-II 有增加的趨勢，尤
其以 24 小時最為顯著，並與 LysoTracker 的紅色螢光密合的重疊，呈 現黃色斑點，顯示自噬小體正在與溶酶體融合，證實內質網壓力的確 會引發細胞自噬。至於 TM 處理 12 小時的 Bβ2 細胞還是以游離態的 LC3-I 居多。至於完全未經 TM 處理的控制組 Bβ2 細胞株，雖然觀察 少數綠色螢光班點，但並不會與 LysoTracker 的紅色螢光重疊，代表 與細胞自噬並無直接關係(圖十二 B)。若先以 3-MA 預處理 24 小時的 Bβ2 細胞，再加入 TM 12 小時，可以看到綠色螢光均勻的分布在細 胞之內，而 18 小時與 24 小時的實驗組，雖然可以看到綠色螢光斑點 與紅色螢光的重疊，但比例遠小於單純只以 TM 處理 24 小時的實驗 組，顯示 LC3 並無完全大量的轉變成聚合型的 LC3-II，還是以游離型 的 LC3-I 占多數，代表經過 3-MA 預先處理的 Bβ2 細胞，可以在內 質網壓力的影響下，抑制細胞自噬的進行(圖十二 C)。我們計算紅綠 疊合的螢光斑點將其量化，可轉換為長條圖，並清楚觀察到隨著 TM 處理時間的增加，螢光斑點數量也會隨之增多；但若預處理 3-MA，
則螢光斑點數量則會大幅減少(圖十二 E)。
由前述細胞週期分析以及螢光顯微鏡照相，我們已經得知 TM 會引起 Bβ2 細胞凋亡，但若預先處理 3-MA，則可以降低細 sub-G1 百分比的分布，並提高細胞的存活率。我們進一步探討 TM 對細胞內 蛋白的影響以及發生的途徑，因此使用 western blot 來觀察細胞凋亡相
關蛋白。以 0.1μM 的 TM 處理 48 小時及預處理 10μM 的 3-MA，無 論是 SK-N-SH、Bβ1 或 Bβ2 細胞，活化的 caspase-3 皆無表現，只能 觀察到分子量 34-kD 未活化的 pro-caspase-3(圖十三)，這代表 Bβ2 細 胞因 TM 所引起的細胞凋亡，不需要依賴 caspase，也就是採用 caspase 非依賴性路徑，使細胞最終走向死亡。而若我們以細胞自噬抑制劑 3-MA 預處理的時候，可以觀察到，用來做為凋亡指標的 PARP 的 89kD 片段蛋白表現量，有明顯的減少(圖十四)。這代表 Bβ2 細胞在受到 TM 所造成的內質網壓力下，是藉由細胞自噬來引發系標凋亡，進而 降低 Bβ2 細胞的存活率。
三、 低氧環境對Bβ1與Bβ2的影響
實驗同時也分別將SK-N-SH、Bβ1和Bβ2細胞置於0.5%氧氣濃 度的低氧環境下培養，觀察正常氧分壓與低氧環境下粒線體膜電位的 差別。
我們觀察細胞在低氧環境下培養48、72及96小時後細胞表型的 變化。由流式細胞儀分析細胞週期，顯示在48小時的處理下，Bβ1 與Bβ2細胞相較於正常氧氣濃度培養細胞的sub G1 期並無太大差異，
皆維持在3％以下，但隨著低氧培養的時間延長為72及96小時，Bβ1 的sub-G1 期雖然也有隨時間而增加，但不如Bβ2的sub-G1 期在整個細
胞週期中所占的比例顯著上升，尤其在96小時Bβ2的sub-G1百分比已 從控制組的2%升至58%，至於G2和S期的百分比總合則是隨著時間增 加而遞減(圖十五)。
針對sub-G1觀察，48小時情況下，不管何種細胞皆與正常培養之 細胞無差異，但從72小時開始，Bβ1與Bβ2細胞的sub-G1 期百分比與 正常氧氣濃度下培養之細胞皆有顯著差異，至於SK-N-SH無論在任何 時間點皆不受影響(圖十六)。由統計看來，Bβ1與Bβ2要經過較長時 間(大於72小時)的低氧環境下才會引發細胞凋亡，而其中又以Bβ2受 到的傷害大於Bβ1細胞。