環境壓力對於神經母細胞過度表現細胞質或粒線體PPP2R2B之影響

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(1)國立立臺灣師師範大大學生命命科學系系碩士論論文. 環壓力對環境壓對於神經經母細細胞過過度表現現細胞胞質粒線體質或粒體 PPP22R2B 之之影響響 Th he Effect of D Differen ntial En nvironm mental Stress in man Neu uroblastoma Cells w with Ecctopic Hum Transfer of f Cytoplasmic or Mittochon ndrial P PPP2R2 2B 研研究生：宋亭潔潔 Tin ng‐Chieeh Sungg 指指導教授授：方剛剛博士士 Kaang Fan ng 中華華民國一Ｏ一一一年八月 0 .

(2) 目錄 ----------------------------------------------------------- 1 摘要 ----------------------------------------------------------- 2 縮寫說明 ----------------------------------------------------- 7 前言 ----------------------------------------------------------- 10 研究動機與目的 ------------------------------------------- 29 實驗材料與方法 ------------------------------------------- 31 實驗結果 ----------------------------------------------------- 39 討論 ----------------------------------------------------------- 47 結論 ----------------------------------------------------------- 55 參考文獻 ----------------------------------------------------- 56 附錄 ----------------------------------------------------------- 64. 1 .

(3) 摘要. Protein phosphatase 2A (PP2A)是 serine/threonine 去磷酸酶的一種，能調節細胞的生長、存活和凋亡。哺乳類動物中，Bβ 次單位 PPP2R2B 是 PP2A 在腦神經細胞中的專一表現的次表型。當 Bβ 基因有所缺失或過度表現時，會造成神經細胞的病變。本研究使用可以持續且穩定過度表現細胞質 PPP2R2B 蛋白(Bβ1)及粒線體 PPP2R2B 蛋白(Bβ2) 的神經細胞株，觀察飢餓壓力、低氧環境和 Tunicamycin(TM)等藥物引起的內質網壓力，對細胞表型的影響。. 研究結果顯示 Bβ1 細胞在飢餓壓力下，其粒線體膜電位及存活率都會下降，而 sub-G1 期比例也有顯著提升，代表產生細胞凋亡。但若以細胞自噬抑制劑 Bafilomycin A1 預處理，則會抑制因飢餓壓力引起的細胞自噬，進而減緩後續的細胞凋亡，但 3-methyladenine (3-MA) 則無此效果。. 另一方面，Bβ2 細胞株的存活率會因為受到內質網壓力而有下降，由流式細胞儀及螢光免疫染色發現細胞內的酸性液泡會增多，代表有細胞自噬增加，但 Bβ1 細胞株則否。但以細胞自噬抑制劑 3-MA 2 .

(4) 先對細胞作前處理 24 小時後，再施以內質網壓力，則各 Bβ2 細胞株的 sub-G1 期比例皆會降低，而酸性液泡胞器的密度也明顯降低。. 此外，在低氧壓力對於過度表現 PPP2R2B 的蛋白，無論是細胞質或粒線體，皆會造成 sub-G1 期上升，引發不同程度的細胞凋亡。. 本論文針對過度表現 PPP2R2B 的細胞株分別由飢餓壓力、內質網壓力和低氧環境下，觀察細胞所產生的表型變化，模擬 PPP2R2B 過度表現之神經退化病變的產生，並瞭解病變機制，祈能對 PPP2R2B 相關疾病的研究與治療有所助益。. 關鍵字：細胞自噬、細胞凋亡、內質網壓力、飢餓壓力、低氧. 3 .

(5) Abstract. Protein phosphatase 2A (PP2A) is one of four major classes of serine/threonine phosphatases. The alternatively splicing of brain-targeted regulatory subunit PPP2R2B encodes two regulatory subunit isoforms, cytoplasmic-specific Bβ1 and mitochondria-specific Bβ2. The two constructs were transfected into human neuroblastoma cells, SK-N-SH, respectively, and the stable clones over-expressing either Bβ1 or Bβ2 established. To address the onset of neuropathogenesis under different environmental stress, Bβ1 and Bβ2 clones were exposed to starvation (HBSS), and endoplasmic reticulum (ER) stress and hypoxia, respectively.. To test how Bβ clones respond to starvation, the cells were exposed to Hank's Buffered Salt Solution (HBSS). Cell death was induced Bβ1 clones, but not Bβ2 clones, following 6 hr starvation. Suppression of autophagy using pharmacological inhibitor, Bafilomycin A1, can rescue autophagic cell death and reduce autophagy-related apoptosis. In contrast, 3-MA (3-methyladenine) did not rescue autophagy-related apoptosis.. 4 .

(6) To test the cells under ER stress, the cells were treated with 0.1 μg/ml of N-glycosylation inhibitor, tunicamycin (TM), in which cell death was observed in Bβ2 clones following 48 h treatment, but not in Bβ1 clones. The analysis of distribution and intensity of LysoTracker and GFP-LC3 staining by fluorescence microscopy showed that TM induced autophagolysosome formation in Bβ2 cells prior to apoptosis. The autophagic cell death in Bβ2 clones cell can be rescued by autophagy inhibitor, 3-methyladenine (3-MA).. On the other hand, cells incubated in a hypoxia chamber (0.5% O2, 5% CO2) for more than 48hr showed increased sub- G1 distribution not only in Bβ1 clones, but also in Bβ2 clones. More sub-G1 phase cells appeared in Bβ2 clones than in Bβ1 clones increased with the in time under hypoxia.. Therefore, we showed that cells with ectopically expressed regulatory subunit PPP2R2B of holoenzyme PP2A were predisposed to differential autophagy related cell death. Starvation induced autophagic cell death in Bβ1 clones with overexpressed cytoplasmic PPP2R2B, where ER stress induced autophagic cell death in Bβ2 clones with mitochondrial PPP2R2B. The 5 .

(7) result promised a model for studying the mechanism and function of aberrant PPP2R2B expression in neuronal cells under starvation.. Key Words: PP2A, PPP2R2B, Apoptosis, Autophagy, ER stress, starvation, hypoxia. 6 .

(8) 縮寫說明 Abbreviation and Symbel. 3-MA. 3-Methyladenine. AD. Alzheimer disease. APAF-1. apoptotic activating factor-1. ATG. autophagy associated gene. AVOs. acidic vesicular organelles. CaMK IV. Ca/calmodulin-dependent kinase IV. DMEM. Dulbecco's Modified Eagle Medium. DMSO. Dimethyl sulfoxide. DIC. differential interference contrast. ER. endoplasmic reticulum. FADD. Fas-associated via death domain. GRP78. 78-kD glucose regulated protein. HBSS. Hank's balanced salt solution. HD. Huntington's disease. HIF-1. hypoxia-inducible factor-1. Hsc73. 73-kDa heat shock cognate protein 7 . .

(9) hVps34. human vacuolar protein-sorting-associated protein34. IRE1. Inositol requirement 1. JC-1. 5, 5', 6, 6' -tetrachloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide. Lamp2a. lysosome-associated membrane protein 2a. LC3. microtubule-associated protein light chain 3. EGFP. Enhanced Green Fluorescent Protein. MMP. mitochondrial membrane potential. PARP. poly ADP-ribose polymerase. PP2A. protein phosphatase 2A. PPP2R2B. protein phosphatase, regulatory subunit B, beta. PD. Parkinson disease. PE. phosphoethanolamine. PERK. protein kinase-like endoplasmic reticulµM kinase. PI3K. class Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase. SCA12. spinocerebellar ataxia 12. TG. Thapsogargin. TM. Tunicamycin. TNFR. tumor necrosis factor receptor 8 . .

(10) TRADD. TNFR1-associated death domain. TRAIL. TNF-related apoptosis inducing ligand. UPR. unfolded protein response. V-ATPase. Vacuolar-type H -ATPase. +. 9 .

(11) 壹、前言. 隨者世界人口高齡化的現象越來越顯著，許多老年疾病也越來越多，其中以神經退化性疾病最為常見，如阿茲海默症 (Alzheimer's disease, AD )、帕金森氏症 (Parkinson's disease, PD) 等。而神經退化的主要原因是因為神經細胞受到壓力而逐漸喪失其功能與結構，最後造成細胞的死亡。一般而言，神經細胞對環境壓力極為敏感，因此若藉由調適環境壓力對神經細胞病變的影響來探討致病反應機制，對神經退化的產生原因有所認知進而於未來治療的發展而有更深入的瞭解與體認。. 一、蛋白質去磷酸酶 2A (Protein phosphatase-2A，PP2A) PP2A 是真核生物細胞中一種對絲胺酸/酥胺酸有特異性的去磷酸酶(serine/threonine protein phosphatase)，其作用機制是藉由對蛋白激酶去磷酸化進而在細胞訊息傳遞中扮演許多關鍵性的角色，直接影響細胞的生長、發育、代謝、分化和凋亡等相關細胞生長的生理過程中所需的物質(Arendt et al., 1998)。 PP2A 主要由三個不同功能的次單元體組成，它分別由的骨架次 10 .

(12) 單元體 A（56kDa）、催化次單元體 C（36kDa），以及最富調控性的次單元 B 所組成的蛋白質。於過去的文獻中可知當 A、B、C 三個次單元共同結合時，才能組成有功能性的 PP2A 全酶。目前次單元 B 較多人研究探討，於過去的文獻中已知至少有 B (PR55)、B＇ (PR61)、B＇＇ (PR72)、B＇＇＇ (PR55) 四個不同主要家族。在 B 次單元的 B(PR55) 家族中有α、β、γ、δ四種異構型式，其中 Bβ蛋白是於腦和神經系統中發現且表現的次單位，又稱 PR55，B55β或 PPP2R2B (Mayer et al., 1991)。 PPP2R2B 此次單元包括 10 個 exon (exon 1.1、1.2、2-9)，在轉錄過程中經由選擇性剪接 (alternative splicing)，會分別裁剪出 Bβ1 和 B β2 兩種形式的 mRNA，再分別轉譯出 Bβ1 和 Bβ2 兩種蛋白。Bβ1 主要作用在細胞質之中，而 Bβ2 蛋白則移位至粒線體之上(Dagda et al., 2003)。. 二、細胞凋亡 (Apoptosis) 1.. 細胞凋亡的發生細胞凋亡是生物體內有計劃性的死亡機制，又稱為程式性死亡. (programmed cell death)；在生長發育、細胞分化或免疫反應中，常藉由細胞凋亡來清除多餘或異常的細胞，以維持體內生理上的平衡。但 11 .

(13) 當細胞引發不正常凋亡時，常常是引起疾病的主因之一，例如癌症、神經退化疾病等 (Bratton and Cohen, 2001, Rathmell and Thompson, 2002)。細胞凋亡過程是由兩個主要的路徑所活化，包括：外在路徑 (extrinsic pathway) 以及內在路徑（intrinsic pathway）(Pulido and Parrish, 2003)。外在路徑通常都是經由外部訊號或配體（ligands）與細胞膜上相對應的接受器（receptor）結合而開始活化整個作用機制而導致細胞凋亡，這些死亡接受器（death receptor family）包含了腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor receptor, TNFR）、Fas 等。每個接受器在細胞內都包含一些death domain 像是FADD（Fas-Associated protein with Death Domain）、TRADD（TNF receptor-associated death domain），所以一旦配體和接受器結合後則會活化細胞內的death domain ，之後再去活化caspases 以及其它的訊息路徑而導致細胞凋亡。內在途徑（intrinsic pathway）又稱粒線體途徑（mitochondrial pathway），其機制中包含了caspase 非依賴性路徑（caspase independent pathway）。細胞受到細胞內或細胞外的壓力，如老化、缺氧、放射線傷害及DNA損傷時，粒線體膜電位下降，孔道會打開，使細胞色素 c（cytochrome c）從粒線體釋放到細胞質中之後再與細胞凋亡活化因子（apoptotic activating factor-1，APAF-1）結合而活化caspase-9，再使 12 .

(14) 下游caspase-3、6、7等活化，最後誘發細胞凋亡產生。 (Pulido and Parrish, 2003)。雖有兩種因素會造成細胞凋亡，但不論是哪一途徑的細胞凋亡，皆會活化caspase-3；而最後caspase-3會造成細胞膜產生泡狀、形成細胞凋亡小體、細胞質減少、細胞核緊縮以及將DNA切成片段等等現象 (Stennicke and Salvesen, 1998, Hacker, 2000, Bratton and Cohen, 2001)。 3.PPP2R2B與細胞凋亡的關係從以前的文獻得知，PP2A藉由去活化Bcl-2蛋白質(Deng et al., 1998, Galadari et al., 1998)、活化Bad (Chiang et al., 2001)與成為caspase的受質 (Talanian et al., 1997) 等等的作用方式來對細胞凋亡的機制作調節。因此PP2A的調控次單位：PPP2R2B則在整個作用機制中扮演了極為重要的位置；因為它會促進細胞凋亡因子進入粒線體內作用而造成粒線體破碎最後導致細胞凋亡(Dagda et al., 2008)。而在本實驗室之前所發表的文獻中也有證實，粒線體過度表現PPP2R2B的細胞株易由於氧化壓力而引起細胞凋亡，而且是發生於細胞分裂末期，其詳細機轉值得繼續探導(Cheng et al., 2009)。. 三、細胞自噬 (Autophagy) 生物體內皆有一個平衡的機制，細胞內的恆定性則是藉由生物 13 .

(15) 合成和分解的平衡相互調節。除了已熟知的蛋白質體（proteasome）分解以外，還有屬於第二類程式型死亡的細胞凋亡，此機制主要分解細胞生命週期較長、分子量較大的蛋白質與細胞胞器。細胞在營養缺乏時則能由細胞自噬獲得營養而存活 (Kabeya et al., 2000)。 1. 細胞自噬的發生細胞自噬的發生是從胞漿（cytoblastema）中出現大量游離的膜性結構物質開始，此膜性結構物則稱為前自噬泡（pre-autophagosome）。前自噬泡逐漸發展，成為由雙層膜結構形成的空泡，其中包裹著變性壞死的細胞器和部分細胞漿，這種雙層膜被稱為自噬泡（autophagosome）。自噬泡的外膜與溶酶體膜融合後，自噬泡內膜及其包裹的物質則進入溶酶體內，最後被溶酶體中的酶水解。在此過程中進入溶酶體中的物質則被分解成細胞所需之組成成分，並被細胞再利用。這種將細胞內成分吞噬的溶酶體就統稱為自噬溶酶體（autophagolysosome or autolysosome）。在細胞自噬過程中，除了可溶性胞漿蛋白，以及粒線體、過氧化小體（peroxisome）等胞器外，其他胞器，如高基氏和內質網的某些部分皆可被溶酶體所分解 (Lemasters et al., 2002)。近期也有文獻發現酵母細胞的細胞核的中的某些區域也可通過細胞自噬途徑被清除(Bellu and Kiel, 2003)。. 14 .

(16) 前自噬泡產生的過程（Dr. Helge Gad, Karolinska Institute, Stockholm）. 自噬溶酶體產生的過程 (Maiuri et al., 2007). 2.. 細胞自噬的種類根據細胞內含物運送到溶酶體腔方式的不同，於真核細胞可分. 為三種主要方式 (Crotzer and Blum, 2005)：大自噬（macroautophagy）、小自噬（microautophagy）和分子伴侶蛋白（chaperone）介導的自噬 (chaperone-mediated autophagy)。在大自噬形式的細胞自噬途徑，細胞漿中之可溶性蛋白和變性壞死的細胞胞器被非溶酶體來源的雙層膜結構所包裹，也就是自噬泡（autophagosome），並由自噬泡將其攜帶到溶酶體中分解加工；而小自噬形式的細胞自噬與大自噬形式有其不 15 .

(17) 同點，小自噬形式的作用途徑為溶酶體膜自身變形後再包裹吞噬細胞漿中的內容物。在大自噬和小自噬兩種形式的細胞自噬作用機制中，內容物被其所包裹的膜性結構帶至溶酶體後，均發生膜的迅速分解，進而釋放出其中的內容物，而使溶酶體中的水解酶對內容物進行有效水解，保證了細胞對內容物的再利用。第三種作用途徑為分子伴侶介導的自噬，首先由胞漿中的分子伴侶 Hsc73（73-kDa heat shock cognate protein）識別內容物中蛋白分子的特定氨基酸序列 (如 KFERQ-樣模體) 並與之結合，分子伴侶-內容物形成的複合物與溶酶體膜上的受體 Lamp2a (lysosome-associated membrane protein 2a) 繼續結合。結合後，內容物則去折疊；溶酶體內中的另外一種分子伴侶介導底物在溶酶體膜的轉位後，於溶酶體內中的內含物則在水解酶的作用下而分解為其組成成分，再被細胞利用(Cuervo and Dice, 1996)。 3. 細胞自噬與保護作用細胞的自噬作用對於生物體的生長發育、細胞分化及對環境壓力等一些生長方面的條件控制中具有關鍵作用。對防止某些疾病如腫瘤、肌病（myopathy）、神經退化性疾病以及對抵禦病原微生物的感染和延緩衰老、延長壽命等方面有重要功能。已有研究證實當環境中的營養物質缺乏時，細胞通過自噬作用可對胞器內的大分子物質進行分解，提供養分進而維持細胞存活所需的最低能量(Kim and Klionsky, 16 .

(18) 2000)；至於毒素和病原體也會通過自噬途徑被包裹、分解而清除 (Talloczy et al., 2002)。還有一些文獻指出變性的胞漿成分，如因錯誤折疊而形成的凝聚蛋白或受損的細胞胞器也可通過自噬而得到清除，進而使細胞免於受到進一步的損傷(Webb et al., 2003)。因此，在某些疾病的早期階段，啟動自噬可提早阻止疾病進展的作用，例如亨廷頓氏病中，通過自噬途徑對突變蛋白小片段的分解就阻止了它們進一步的聚集(Qin et al., 2003)。 4. 細胞自噬與神經性退化疾病的關係自噬作用在神經變性疾病的發生與發展中起雙重作用，它既可加速疾病的進展，在某些條件下又起保護作用(Rubinszfein et al., 2005)。如阿茲海默氏症（Alzheimer's disease）、亨廷頓氏症（Huntington's disease）和帕金森氏症（Parkinson's disease）。這些神經上的病變，溶酶體的系統與其形態學的特徵則發生了顯著變化，其調控自噬的訊息傳遞系統同時也發生改變(Chang et al., 2002)。有文獻指出在神經營養因素被撤除的小腦柏金氏細胞(purkinje cell)可能會死於自噬途徑中的程式性細胞死亡(Linseman et al., 2003)。在神經變性的疾病中具有極重要作用的神經傳導物質多巴胺，也可引起自噬途徑中的程式性細胞死亡 (Petersen et al., 2001)。在神經變性疾病的早期階段，啟動自噬作用可加速變性蛋白的清除，這種蛋白聚合物的存在是神經變性疾病的典型 17 .

(19) 特點之一(Michalik and Van Broeckhoven, 2003)，因此不但阻止了疾病的進一步發展，另外啟動自噬的作用還可加速細胞內蛋白聚合物的清除。神經變性疾病因受累於神經元有兩個最主要的特徵，分別是：胞漿中蛋白聚集物的存在和大的蛋白裂解體系活性的改變。儘管不同神經變性疾病突變蛋白的種類不同，但蛋白聚集物形成的過程卻極為相似。首先，受損蛋白的錯誤折疊、構型改變，則暴露出那些在正常情況下隱藏於蛋白內部的疏水性殘基(Hydrophobic residues)；之後，細胞活化分子伴侶系統和胞漿蛋白酶體系，則促進這些錯誤折疊蛋白的再折疊或清除。最初，分子伴侶和蛋白酶可以逆轉或在一定程度上延緩蛋白聚集物的形成；然而，隨著受損蛋白的不斷增多，當上述機制不足以完全清除時，這些分子伴侶和蛋白酶則被蛋白聚集物捕獲，成為其中的一部分。儘管蛋白聚集可能是細胞對抗疏水殘基暴露的保護機制，但此動作也同時使聚集的蛋白更加不易被蛋白酶降解，因此自噬成為分解這些變性蛋白的唯一機制。啟動自噬作用可加速新合成的蛋白聚集物被清除之理論已經得到實驗證實(Ravikumar et al., 2002)。然而，隨著疾病的進展，蛋白聚集物越來越多，它們對溶酶體中蛋白酶降解的敏感性則下降，自噬作用的持續性啟動也就導致細胞最終發生自噬性程式性細胞死亡。 18 .

(20) 四、細胞凋亡與細胞自噬早期科學家們認為細胞自噬與凋亡這兩種程式性細胞死亡的方式在形態上、生化指標、參與分子和機理方面均有區別，近年來越來越多的研究顯示二者在某些情況下可以相互拮抗或促進，可先後發生或同時共存於同一細胞，相同誘導因素在不同細胞中可分別誘發細胞自噬或凋亡；彼此 pathway 中的分子也可能互相存在，這些分子在細胞自噬與凋亡的兩種程式性細胞死亡中可互相影響。隨著研究的深入探討，細胞自噬與凋亡之間的相互關係也顯得越來越複雜。已有文獻表示 Beclin 1 可通過增強 Caspase-9 的活性而加強化療藥物 CDDP 誘導人類胃癌細胞 MKN28 的凋亡，此數據說明細胞自噬中的重要調控基因 Beclin 1 也可參與細胞凋亡的調控(Furuya et al., 2005)。在營養缺乏的情形下也可誘導細胞自噬，在自噬相關基因(autophagy associated gene, ATG)干擾 RNA 的機制下或細胞自噬特異抑制劑劑（如 3-MA）存在的情況下，細胞會發生加速程式性的細胞死亡(Boya et al., 2005)。在應用 RNA 干擾機制或以同源重組技術將溶酶體膜相關蛋白 2A(lysosome-associated membrane protein type 2A, LAMP 2A)基因剔除後，進而使細胞生活在營養被剝奪情況下，首先會發生細胞自噬的現象，繼而發生凋亡，伴隨細胞凋亡的典型特點，如粒線體膜電位的下降、 19 .

(21) caspase 的活化和染色質的凝集(Gonzalez-Polo et al., 2005)。另外也有研究證明 LAMP-2 基因缺陷的小鼠其死亡率明顯增加，倖存的小鼠也出現多組織廣泛的胞漿空泡的現象發生(Tanaka et al., 2000)。最近的研究發現由 Atg5 過度表現而誘導 Hela 細胞死亡中，首先會發生大量胞漿空泡出現為主的細胞自噬的形態的特點，這些被誘導的胞漿空泡其出現和細胞死亡皆可被 3-MA 所抑制，但是廣效性的 caspase 抑制劑 zVAD-fmk 只能抑制細胞死亡，卻不能抑制胞漿空泡的出現。這說明以胞漿空泡出現為主的細胞自噬可繼續發展使 caspase 增加而誘導細胞死亡。有文獻則進一步的研究證明 Atg5 通過和 FADD 的相互作用而促進細胞自噬性程式性細胞死亡的結果，而 FADD 是經由細胞膜受體 Fas/FasL 的途徑使細胞凋亡的重要參與分子(Pyo et al., 2005)。另外，Bcl-2 家族蛋白不僅參與凋亡形式上的程式性細胞死亡，還參與了對細胞自噬形式中細胞死亡的調控(Shimizu et al., 2004)。另外，有文獻指出腫瘤壞死因數相關的凋亡誘導配基（TRAIL, TNF-related apoptosis inducing ligand）在人乳腺上皮細胞 MCF-10A 的形成過程中，誘導細胞自噬的過程中以形成中空的腔狀結構現象而使細胞死亡，此過程同時伴隨發生 Caspase 依賴的細胞凋亡事件(Mills et al., 2004)。在實驗中常用來偵測細胞自噬的蛋白有：LC3 20 .

(22) （microtubule-associated protein light chain 3），哺乳動物細胞中酵母 ATG8（Aut7/Apg8）基因的同源物，定位於前自噬泡和自噬泡膜表面，是細胞自噬泡膜的通用標記物。當細胞自噬發生時，會從原先可溶性的 LC3-1（18 kD）轉變成自噬泡上聚集的 LC3-Ⅱ（16kD）(Ueno et al., 2008)。Beclin-1（70kD）：細胞自噬相關蛋白質，會隨著細胞自噬的程度而增加表現。同時，在發生細胞凋亡的細胞中也可偵測到 Beclin-1 的大量表現(Yue et al., 2003)。. 五、內質網壓力 (ER stress) 1.內質網壓力與不完全摺疊蛋白反應內質網 (endoplasmic reticulum, ER) 是真核細胞內最主要負責合成蛋白質與蛋白質修飾的胞器，由核醣體轉譯出的蛋白質必須在此做正確的折疊及組合完成，才能被送到細胞內其他胞器或細胞表面。若內質網的恆定受到外在或內在因子的影響，如鈣離子濃度改變、病毒感染、胺基酸缺乏或缺氧等作用下，會造成蛋白質不完全折疊(unfolded proteins) ，在細胞內則產生內質網壓力 (ER stress) (Rutkowski and Kaufman, 2004)。目前認為與內質網壓力有關的疾病主要為一些神經退化性疾病，如帕金森氏症等(Kaufman, 2002) 。不完全折疊的蛋白質累積在內質網內會引發一種反應稱為 21 .

(23) unfolded protein response (UPR)，以降低內質網壓力(Zhang and Kaufman, 2004)。整個作用為一連串由內質網內腔起始將訊息傳遞到細胞核或質的過程，這個過程可分為三部分：首先利用 IRE1（Inositol requirement 1）等轉錄因子傳遞訊號至細胞核內，增加 chaperones 及 foldase 來加強內質網正確質折疊蛋白的能力(Shen and Prywes, 2005)；另一方面，細胞會廣泛的抑制蛋白質合成，只選擇性的藉由 PERK(protein kinase-like endoplasmic reticulµM kinase)轉譯特定的 mRNA(Boyce et al., 2005)；最後若還有未折疊的蛋白質則會被送回細胞質由 proteasome 將其分解，稱之為 ER-associated degradation(Schröder and Kaufman, 2005, Zhao et al., 2010)。 Tunicamycin(TM)與 thapsigargin(TG)都是用來引發內質網壓力的藥物，他們會阻斷醣蛋白 N-醣化的起始步驟，使 N-醣鏈無法連接至所屬的蛋白質上，而造成鈣離子無法順利運出細胞，最後導致細胞內外鈣離子濃度不平衡，因此細胞則無法順利的運輸蛋白進出內質網而產生內質網壓力，因此許多文獻中所探討內質網壓力之實驗設計就經常利用 TM 與 TG 來探討不同細胞與條件受到內質網壓力後的影響 (Han et al., 2008) (Lin et al., 1999)。 2.內質網壓力觸發細胞凋亡近年的研究中發現，內質網壓力的也會觸發細胞凋亡的發生， 22 .

(24) 當內質網受到壓力後會調控下游蛋白酶體的活性，以針對抗凋亡 Bcl-2 蛋白做降解(Weston and Puthalakath, 2010)，使這些抗凋亡蛋白無法繼續抑制促凋亡蛋白如 Bax、Bak 之活性，最後影響粒線體膜電位，造成細胞凋亡 (Egger et al., 2007)。而前述的 UPR 機制若未能解決細胞內不完全摺疊蛋白的持續累積，就會導致細胞啟動細胞凋亡的機制，內質網上的 caspase-12 會直接形成雙體的結構然後活化 caspase-9，進而作用在 caspase-3，最後產生細胞凋亡 (Shimizu et al., 2001)；此外內質網內外壓力的不平衡也會造成鈣離子流出至細胞質，也能幫助 caspase-12 活化 (Filippin et al., 2003)。目前許多研究也顯示內質網壓力除了造成細胞凋亡外亦能導致細胞自噬，受到內質網壓力的細胞，其 LC3-II 和 Bcl-1 的含量會大幅度的上升(Maiko and Bagirova, 2006)，不過詳細的機制與影響目前還不清楚因此值得更深入的探討。其中使 GRP78(78-kD glucose regulated protein )會隨著內質網壓力增加而大量表現，因此 GRP78 的含量多寡則可以用來偵測內質網壓力的產生。(Momoi, 2004). 六、低氧環境 (Hypoxia) 低氧是指身體組織所具有的氧含量低於正常值，亦及組織發生缺氧的情況。一般組織很少處於完全無氧 (anoxia) 的情況，因此低氧 23 .

(25) 更適合形容組織缺氧的情形(Tansey, 2008)。缺氧會影響細胞內基因的不穩地、DNA 斷裂及損害修復系統等，尤以神經細胞最容易受到傷害(Bindra et al., 2005)。因此對高等真核生物而言，面臨低氧狀態時如何維持體內氧氣的恆定性便是相當重要的課題。 1.. 低氧環境對生物體的效應研究顯示當生物長時間處於低氧環性下，身體為了適應環境會. 產生許多適應機制，包含呼吸系統、心血管系統皆會有所調整，值得注意的是在神經系統方面也會出現神經保護機制：過去文獻指出低氧預處理可以有效的減輕腎臟與腦部的氧化傷害，以及證實了低氧預處理是藉由調控細胞自噬與細胞凋亡的訊息傳導來降低腦部的神經毒性和傷害(Brezis and Rosen, 1995)。同時低氧環境也會促進轉錄因子的活化，主要是低氧誘導因子的活化，以證實可以造成血管新生因子 (vascular endothelial growth factor)大量增生而產生血管新生的情形。 2.. 缺氧誘導因子(HIF-1) 當真核生物面臨缺氧時，維持體內氧氣恆定性的相關基因，以. 及受到參予氧氣調控的其他生物功能的基因會受到缺氧誘導因子 -1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)的調控而有增加或減少的情形。缺氧誘導因子-1 是由兩個不同單元體缺氧誘導因子-1a(HIF-1a)與缺氧誘導因子-b(HIF-1b,也稱為 aryl hydrocarbon nuclearttanslocator,ARNT)所構 24 .

(26) 成的二聚體，HIF-1a 是主要的誘發型( inducible form)，需要持續受到外界刺激。HIF-1a 會與 HIF-b 結合到 DNA 序列上的缺氧反應組(hypoxia response element,HREs)，進而調控下游基因表現(Semenza, 2000)。目前已知 HIF-1 的活化可以促進許多基因的表現，主要可分為三大類：1.參予糖解作用、2.參予血管新生、3.參予細胞存活與凋亡 (Carmeliet and Jain, 2000) 4.低氧與細胞凋亡過去複製心肌細胞缺氧實驗中已經觀察到，心肌細胞的偽足縮短或消失，且細胞核發生斷裂、核膜包裹成凋亡小體、細胞質濃縮等細胞凋亡特徵(Regula et al., 2002)，在臨床實驗室也被認為神經元凋亡是腦缺血缺氧損傷的主要型式(Tu et al., 2011)。低氧所造成的細胞凋亡，首要表現均從粒線體功能失常開始，離子通道功能障礙、膜通透性增強、膜流動性下降、鈉離子大量往內流，最後導致粒線體膜電位破壞。更重要的是引起細胞色素 C 從粒線體的釋放，引發下游一連串不可逆的細胞凋亡途徑(Araya et al., 1998)。而嚴重或持續的低氧時，缺氧誘導因子-1 也會誘導細胞凋亡， Helton 在大鼠腦缺氧的研究中發現，剔除大腦 HIF-1a 基因可以降凋亡基因的表現，進而減少大腦細胞發生凋亡(Helton et al., 2005)。由此可 25 .

(27) 知，低氧環境的確會引起細胞凋亡，也是許多疾病發展中的一個重要病理過程。. 七、飢餓壓力 (Starvation) 飢餓泛指生物體未能得到或未能充分滿足自身營養所需的熱能或營養成分，在生理學層面上胺基酸的缺乏和維生素的缺乏等的營養缺乏(nutrient deprivation)，也屬於飢餓壓力的一種。當細胞受到飢餓壓力時，會增加粒線體中的過氧化氫(H2O2)，引發細胞內氧化壓力 (Scherz-Shouval et al., 2010)。氧化壓力在細胞中累積過程中，會抑制 ATG4，進而增加 LC3 與 phosphoethanolamine (PE)結合的作用，促進細胞自噬。過度自噬時會引發細胞凋亡(Maiuri et al., 2007)。當細胞處於營養充足的環境中，細胞僅會維持基礎細胞自噬 (constitutive or basal autophagy)，以維持細胞內的營養調控(Ezaki et al., 2011)。真核細胞有許多機制可以補足營養不足，如：糖質新生等，但當營養缺乏實，身體內的代謝與物質將會失衡，而細胞面臨此情況時會產生因飢餓引發的細胞自噬(starvation-induced autophagy)，產生維持細胞生存必要物質，才能繼續存活(Scott et al., 2004)，例如：當細胞在缺乏胺基酸、葡萄糖或生長因子的培養基中，細胞會出現細胞自噬 (Boya et al., 2005)；此外，將老鼠 NIH-3T3 細胞培養在飢餓壓力下 24 26 .

(28) 至 48 小時之後，細胞內的自噬小體會明顯增加(Mizushima et al., 2008)。但在神經性疾病方面，營養缺乏的環境引起的細胞自噬，卻可拯救被過度表現 poly-Q 所造成傷害的神經細胞(Young et al., 2009)。. 八、藥物機制 1.. 3-methyladenine (3-MA) 3-MA 會抑制 PI3-Kinase 活性，進而抑制酸性液泡的產生(acidic. vesicular organelles,AVOs)，使細胞停留在前自噬膜的階段，無法生成自噬小體(Petiot et al., 2000)。 3-MA 對 classⅠPI3K 有長時間的抑制；但對於 classⅢPI3K 僅有短時間的抑制效果。class Ⅲ PI3K 是自噬起始階段重要複合體，共包含 Atg6(Beclin-1)、Atg14 及 human vacuolar protein-sorting-associated protein34 (hVps34)等。3-MA 是透過抑制起始階段複合體的形成的細胞自噬抑制劑(Wu et al., 2010)。 2.. Bafilomycin A1 Bafilomycin A1 是由 Streptomyces griseus 所提煉的紅黴素，常用來. 作為抗革蘭氏陽性菌與真菌的抗生素(Carr et al., 2010)。V-ATPase 可使 coated vesicle、endosime、lysomes 及高基氏體內部維持酸化(Mellman et al., 1986)。Bafilomycin A1 為 V-ATPase 的抑制劑，會抑制氫離子的運 27 .

(29) 輸，使得原先需在酸性環境作用的溶體酵素失去功能，使得自噬溶酶體無法形成，阻斷細胞自噬的作用。(Rubinsztein et al., 2009) 3.. 白藜蘆醇(Resveratrol) 白藜蘆醇是一種多酚類化合物，可從葡萄屬植物表皮中提煉。目. 前有研究證明，白藜蘆醇具有抗氧化作用(Howitz et al., 2003)，尤其是對於神經細胞方面，更具有保護作用。在線蟲及小鼠模式中也發現白藜蘆醇能改善神經退化性疾病，例如：Huntington's disease (HD)的症狀 (Ho et al., 2010)。. 28 .

(30) 貳、研究動機與目的. 本實驗室已經建立以神經纖維母細胞 SK-N-SH 為材料，藉由基因轉殖質體 pcDNA3- B1 及 pcDNA3- B2，建立起穩定的細胞模式 (stable cell line)，可以分別持續且穩定的過度表現 B1 和 B2 蛋白。在先前的研究已經證實，於氧化壓力之下，會過度表現 B1 蛋白的細胞株較不會受到氧化壓力影響；相對於會過度表現 B2 蛋白的細胞株則會在氧化壓下發生更多細胞自噬，進而誘發細胞凋亡。(Cheng et al., 2009). 過去有報導 B蛋白與神經病變生成有相關，已經有研究發現脊髓小腦萎縮症第十二型(spinocerebellar ataxia 12, SCA12)病人腦中的 B 蛋白有過度表現之情形(Holmes et al., 1999)，而在 AD 病人腦中 B蛋白的含量則比一般人少了 30%(Gong et al., 2000)。而許多神經性疾病的發生與壓力有著密切的關係，因此本研究目的希望探討過度表現 B1 和 B2 蛋白的細胞株各種不同的環境壓力（例如：飢餓壓力、低氧環境或內質網壓力下）是否也會產生任何變化。本計畫利用觀察飢餓壓力、低氧環境或內質網壓力下，細胞表型的變化，實驗內容涵蓋 LC3 和酸性液泡表現的程度，及最後細胞存活率，實驗也計畫使 29 .

(31) 用自噬抑制劑，如 3-MA 與 Bafilomycin A1，來探討細胞自噬與細胞凋亡之間相互作用的影響。. 30 .

(32) 參、實驗材料與方法. 一、細胞培養人類神經腫瘤母細胞 SK-N-SH 細胞株及表現 Bβ1 或 Bβ2 的穩定細胞株，培養於 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)(Sigma, St. Louis, MO)，並加入 10%胎牛血清 (FBS)(GIBCO BRL, Grand Island, NY)、 0.37%碳酸氫鈉(sodiµM bicarbonate)、100 unit/ml 青黴素 (penicillin)及 100µg/ml 鏈黴素 (stretomycin)(Sigma, St. Louis, MO)，培養於 37℃，含 21％氧氣、5％二氧化碳及飽和溼度的培養箱中，並佐以相位差顯微鏡(phase-contrast microscope, Nikon Diaphot-300)觀察，維持穩定生長的細胞株。. 二、環境壓力處理 1.. Tunicamycin(TM) (Sigma, St. Louis, MO) 5. 每盤細胞數為 5×10 培養於含有 2 毫升培養基的 6 公分培養盤 24 小時後，加入 TM 並將培養基體積補滿為 3 毫升，使最後 TM 濃度為 0.1µM，放置 37℃培養箱中 48 小時後再分析其細胞變化(圖一 A)。 2.. Thapsigargin（TG）(Sigma, St. Louis, MO) 5. 每盤細胞數為 5×10 培養於含有 2 毫升培養基的 6 公分培養盤 31 .

(33) 24 小時後，加入不同濃度 TG 並將培養基體積補滿為 3 毫升，使最後 TM 濃度為 0.1µM，放置 37℃培養箱中 24 小時後再分析其細胞變化(圖一 B)。 3.. 低氧處理 5. 每盤細胞數為 2×10 培養於含有 2 毫升培養基的 6 公分培養盤 24 小時後，從原先 37℃，含 5%二氧化碳及飽和溼度的培養箱移至 0.5% 氧氣、5%二氧化碳、5%氫氣及氮氣混合的微需氧培養(BUGBOX-M) 箱培養 48、72 及 96 小時後再分析其細胞變化。 4.. 飢餓壓力 5. 計數 5×10 細胞到 6 公分培養盤中培養 24 小時後待貼盤，以 HBSS 清洗細胞，再加 2ml 的 HBSS，放回 37℃培養箱中繼續培養 6、 9、12 小時。而控制組則是清洗細胞過後，再以含有 FBS 的 DMEM 培養基繼續培養(表一)。 5.. 3-Methyladenine (3-MA) (Sigma, St. Louis, MO) 5. 每盤細胞數為 5×10 培養於含有 2 毫升培養基的 6 公分培養盤 24 小時後，加入 3-MA 並將培養基體積補滿為 3 毫升，使最後 3-MA 濃度為 10µM，放置 37℃培養箱中 24 小時後更換 3 毫升的培養基，再加入 TM 或 TG 培養 24 或 48 小時，最後分析其細胞變化(圖一 D)。. 32 .

(34) 6.. Bafilomycin A1 (from Streptomyces, Sigma, St. Louis, MO) 5. 每盤細胞數為 5×10 培養於含有 2 毫升培養基的 6 公分培養盤 24 小時後，加入 Bafilomycin A1 並將培養基體積補滿為 3 毫升，使最後 Bafilomycin A1 濃度為 0.5nM，放置 37℃培養箱中 24 小時後更換 3 毫升的培養基，再加入 HBSS 培養 6、9 及 12 小時，最後分析其細胞變化(圖一 C)。. 三、蛋白質萃取與定量 1. 蛋白質萃取培養於培養皿的細胞當生長到一定適當數量，或是經加藥處理後，將培養皿中的培養液吸除，以 PBS (phosphate-buffered saline : 0.14 M NaCl，2.7 mM KCl，1.5 mM KH2PO4，8.1 mM Na2HPO4) (Sigma, St. Louis, MO)洗滌 2 次後，加入適量 RIPA lysis buffer (RIPA buffer : 50 mM，Tris pH 7.5，150 mM NaCl，10 mM EDTA，0.1% SDS，1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)，10 µg/ml aportonin)放置冰上約 5 分鐘，以刮勺將細胞由培養皿內刮下，在 4℃中以 13,000 rpm 離心 60 分鐘後，取其上層清液，即取得細胞蛋白質。 2. 蛋白質定量：依 Bradford 法，以 microplate reader 測定細胞蛋白質濃度。取 4 µl 33 .

(35) 蛋白質與 296 µl 蛋白質染劑 (Coomassie Brilliant Blue)(Pierce Chemical, Rockford, IL)均勻混合，並配置不同濃度 (62.5、125，250，500，1,000 或 2,000 µg/ml)的 BSA 標準樣品用 590 nm 波長測其吸光值，做成一條 2. 標準回歸曲線，求得一線性方程式 (r >0.95 才可採用)。將欲測濃度的細胞蛋白質所測得的吸光值代入公式中即可求出其濃度。. 四、西方轉漬法 (Western blot analysis) 以西方轉漬法去鑑定細胞內確實有過度表現的 B1 和 B2 這兩種蛋白質。此實驗中鑑定 B1 和 B2 蛋白質的血清抗體 (創生生物科技)，B1 血清抗體所辨認的蛋白質序列為 MEEDIDTRKINNSFLRDHSYA；B2 血清抗體所辨認的蛋白質序列則為 MKCFSRYLPYIFRPPNTILSSSCH(Cheng et al., 2009)。取 20 μg 的蛋白質與樣品緩衝液 (3× sample buffer : 350 mM pH 6.8 Tris-HCl，12% SDS，0.02% bromophenol blue，35% glycerol，30% β-mercaptoethanol)依 2:1 比例混合均勻後，以 95℃加熱 5 分鐘，再置入 SDS PAGE gel (5% stacking gel，10% running gel)中進行電泳。先以 50 伏特的電壓進行 30 分鐘後改以 100 伏特的電壓進行 120 分鐘的電泳。使用 transfer unity 裝置 (HOEFER)(Amersham Pharmacia)以 40 伏 34 .

(36) 特的電壓，90 分鐘，將膠片上的蛋白質轉至硝化纖維膜 (nitrocellulose blotting membrane)(Schleicher & Schuell BioScience GmbH, Germany)。次將硝化纖維膜取出並於室溫下浸泡於 blocking buffer (5% skim milk in PBS-T)中 1 小時後，以 PBS-T (0.5% Tween 20 in PBS)清洗硝化纖維膜 3 次，再加入經稀釋過的一級抗體，進行 probe。在 4℃下反應 16 小時後，再以 PBS-T 沖洗 3 次，並再加入經 1:2000 比例稀釋的二級抗體，於室溫中反應 1 小時後，再以 PBS-T 沖洗 3 次，最後以冷光呈色劑 (Immobilon Western)(Millipore Corporation, Billerica, MA)加於硝化纖維膜，避光 2 至 3 分鐘後，以冷光儀顯影，並分析儲存數據。本論文使用的抗體有 goat anti-GAPDH(1:3000;Santa Cruz Biotechnology,sc-20357 )、rabbit anti-Beclin-1(1:4000; Santa Cruz Biotechnology,sc-11327)、rabbit anti-LC3(1:3000;Novus Biotechnology,1384SS). 五、細胞存活率測定將經過藥物處理的細胞使用 PBS 清洗 2 次以後，加入 trypsin 反應 5 分鐘，使細胞從培養盤上打下，再加含有 10%FBS 的 DMEM 終止反應，將全部細胞液收集至 15cc 離心管內，以 1000 rpm 轉速細胞離心 5 分鐘後，移除含有 trypsin 的上清液，加入適量培養基混合成 1 ml 35 .

(37) 均勻的細胞懸浮液。吸取 10μl 的細胞懸浮液與等量的 typan blue 混和，注入專用的血球記數盤中，送至細胞計數器（Countess, invitrogen）。健康細胞的細胞膜完整，染劑無法滲透進去，死細胞的膜完整性喪失，通透性增加，細胞會被染成藍色，Countess 會自動判別活細胞與藍色的死細胞，計算出活細胞與死細胞的數量以及存活率。. 六、細胞週期及 DNA 含量分析 1.細胞週期分析 Propidium iodide (PI)分子會與細胞核內 DNA 雙股螺旋上 AT、 CG 之氫鍵結合，經波長 488 nm 的激發光激發後，放出 620 nm 的散射光。在細胞正常情況下，PI 染劑無法鍵結上細胞核內 DNA，所以螢光強度較弱，但細胞受損時，PI 便可鍵結至外露的 DNA 上，激發出較高螢光。藉由此種特性，便可分析出細胞內的 DNA 套數，再以軟體分析即可得知各細胞週期的分佈。收集細胞培養液後，以 PBS 清洗細胞 2 次，用 trypsin 將細胞自培養皿中取下，兩者混合一起後，經 1,500 rpm 離心後，以 1 ml PBS 將細胞塊打散，再加入同體積的 70%酒精/PBS 固定細胞 24 小時後，離心洗去固定液，次加入含 5 µg/ml PI (Sigma, St. Louis, MO)及 10 µg/ml RNase A (ICN Pharmaceutical, Costa Mesa, CA)的 PBS，並於室溫下避光 36 .

(38) 30 分鐘，利用 FACS Array 流式細胞儀 (Becton Dickinson, San Jose, CA) 偵測細胞中的 PI 螢光強度 (激發光源：488 nm；散射光源：620 nm) 後，計算各個細胞內的 DNA 含量，以分析位在細胞週期各階段的細胞數量，最後以 Mofit 2.0 (Becton-Dickinson, San Jose, CA)軟體進行分析。. 七、. 細胞螢光染色分析將 LC3-EGFP 質體 (2 g/μL) 與 50 l Opti-MEM (serum-free. medium) 混勻後，加入已均勻混合好含 1.5 l OPTIFECT reagent 總體積為 50 l 的 Opti-MEM中，於室溫下靜置15分鐘，再加入分別含有 5. SK -N-SH 、Bβ1 及Bβ2 細胞株 1×10 (cells/well) 於12 -well 培養盤中，培養24小時，更換新培養液，加入0.1 µM 的Tunicamycin ( TM )，分別處理12、18以及24小時，之後去除上清液，用PBS清洗2次以除去細胞上的藥劑，加入1 : 2,000稀釋的溶酶體染劑 (LysoTracker)(Invitrogen, Gaithersburg, MD) 置於37℃下15分鐘，再以 PBS洗去染劑，利用螢光顯微鏡(Leitz LABOR LUXS)激發照相並將影像儲存，利用軟體做影像重疊，分析資料。. 八、. 粒線體膜電位測試 37 . .

(39) 5. 將5x10 細胞置於6 cm培養盤中，經過環境壓力處理後，把含有藥物的培養液吸除，以 PBS 沖洗後，以 trypsin-EDTA 進行作用後製成細胞懸浮液後，取0.5ml的細胞懸浮液放入滅菌後離心管中，以400g 離心5分鐘後移除上清液，再加入 0.5ml 的 1X 的 JC-1 reagent solution (Cell Meter, AAT Bioquest Inc.) ，置入37℃培養箱中培養15分鐘後，在以1000rpm離心5分鐘後，移除上清液，加入2ml 的細胞培養液後離心，重複前述步驟。再加入0.5ml的細胞培養液，即可使用 FACSCalibur 流式細胞儀分析。定義橫坐標為FL1-H，激發綠色螢光；縱座標為 FL2-H，激發紅色螢光。以WinMDI2.8 (Becton-Dickson, Mansfield, MA)進行四象限分析數據，定義左下角為第一象限，右下角為第二象限，右上角為第三象限，左上角為第四象限。若左上角的紅色螢光訊號減弱，表示粒線體膜電位降低。. 九、. 實驗數據統計實驗數據挑選三次以上獨立實驗，以paired t-test分析比對，來判. 斷控制組與實驗組是否有顯著差異。＊表示P<0.05，＊＊表示<0.01表示P<0.05，若無星號則表示沒有顯著差異。. 38 .

(40) 肆、實驗結果. 本實驗採用的培養基與化學藥物如表一與圖一. 一、. 飢餓壓力對 Bβ1 與 Bβ2 細胞的影響. 本實驗以 HBSS 作為飢餓壓力之來源，將先前已建立的三株細胞 SK-N-SH、Bβ1 與 Bβ2 培養於 HBSS 培養基中，於特定時間觀察細胞表型的變化；並以完整培養基(含有 10%胎牛血清的 DMEM)養殖的細胞做為控制組。細胞在經過 HBSS 培養 3 小時候，以 JC-1 染劑染色，再以流式細胞儀觀察螢光分佈的情形。當粒線體膜電位維持正常情況下，JC-1 分子會結合到粒線體膜上，激發出紅色螢光，當粒線體受損，膜電位下降， JC-1 分子就會從膜上游離出來，紅色螢光激發量就會下降。可以發現 Bβ1 細胞經由 HBSS 處理後，紅色螢光大量的減少，在一維分布圖上明顯的往右移，而 SK-N-SH 和 Bβ2 膜電位沒有顯著改變(圖二 A)。由量化圖顯示，Bβ1 在 HBSS 處理後，紅色螢光比例有明顯下降，而 SK-N-SH 與 Bβ2 的螢光比例並沒有差異(圖二 B) 由細胞計數(Countess)測定經過飢餓壓力處理後的活細胞的數目，實驗顯示預先以 5ng/ml 處理的 Bafilomycin A1 後，再於 HBSS 中培養 6 小 39 .

(41) 時的 Bβ1 與僅有 HBSS 環境的 Bβ1，活細胞數有顯著差異；但在 HBSS 環境下 12 小時，預處理 Bafilomycin A1 並不能提高 Bβ1 的活細胞的數目。本實驗同時也添加了白藜蘆醇(Resveratrol)預處理，不過並無任何影響(圖三 A)。除了 Bafilomycin A1 之外，本實驗也有採用另一常見之細胞自噬抑制劑 3-MA，以 10μM 濃度分別預處理 SK-N-SH、 Bβ1 與 Bβ2 細胞 24 小時，在於 HBSS 培養基中培養 6 或 12 小時。結果顯示預處理 3-MA 並不會使 Bβ1 因 HBSS 造成的活細胞數下降無論是 6 或 12 小時有所回復；至於 SK-N-SH 與 Bβ2 細胞，3-MA 對其並不會有任何影響(圖三 B)。由上述結果可以看出 HBSS 會對 Bβ1 造成傷害，而對於 SK-N-SH 與 Bb2 較不影響，本實驗繼續以細胞週期分析作為進一步佐證。結果顯示，以 HBSS 培養 9 及 12 小時的 Bβ1 細胞，其 sub-G1 期分布較完整培養基環境下多，且隨著時間增加，sub-G1 期百分比也隨之增加；而 SK-N-SH 與 Bβ2 在相同條件下未有此現象(圖四)。其實驗若先以濃度 10μM 的 3-MA 預處理 24 小時，再將細胞培養在 HBSS 中，結果顯示不論是 9 或 12 小時，sub-G1 期比例皆無下降，與僅以 HBSS 處理的結果差異並不顯著(圖五)。但我們改以 Bafilomycin A1 預處理細胞，再來觀察受到 HBSS 培養 6 或 12 小時後的細胞週期分部狀態，反而可以觀察到在 6 小時的時候，Bβ1 細胞就因 HBSS 所造成的飢 40 .

(42) 餓壓力而出現較多的 sub-G1 期百分比，且與正常培養條件的 sub-G1 有顯著差異，但先以 Bafilomycin A1 預處理的 Bβ1 細胞其 sub-G1 期百分比卻未有顯著提升(圖六 A)。但若當 HBSS 培養時間延長至 12 小時，無論 Bβ1 細胞有無預先處理細胞自噬抑制劑 3-MA 或 Bafilomycin A1， sub-G1 期百分比皆會有大幅度的提升，無法抑制 sub-G1 期細胞的分布。至於 SK-N-SH 與 Bβ2 細胞，無論是預處理 3-MA、Bafilomycin A1 或單純以 HBSS 培養 6 及 12 小時，皆不會對 sub-G1 期百分比產生影響(圖六 B)。可以看出細胞自噬能夠維持 Bβ1 細胞在營養缺發初期存活，具有顯著效果，但隨著時間持續，反而會加速推動細胞凋亡。. 二、. 內質網壓力對 Bβ1 與 Bβ2 的影響過去已有文獻指出內質網壓力會引起細胞凋亡(Li et al., 2006)，. 本論文使用 TM. 做為誘發內質網壓力的來源。. 實驗使用 0.1μM 的 TM 處理細胞株 48 小時後，再以細胞計數器測量活細胞數與總細胞數。結果顯示，SK-N-SH 及 Bβ1 細胞株在 TM 處理前後，活細胞數目並任何差異，但對於 Bβ2 細胞存活則有明顯的抑制效果。接著以細胞自噬抑制劑 3-MA (10 μM) 對細胞預先處理 24 小時，再以正常培養基培養 48 小時，結果顯示 3-MA 不會影響細胞的正常生長，但若是以 3-MA 預處理，再將細胞培養在添加 41 .

(43) TM 的環境下，細胞自噬抑制劑會讓原本走向凋亡的 Bβ2 細胞，維持較多的活細胞數目(圖七)。內質網壓力會影響表現 PPP2R2B 穩定細胞株的存活率後，繼續探討內質網壓力對細胞週期的影響，實驗利用流式細胞儀觀察細胞的週期變化。從流式細胞儀的圖譜中，可以清楚的看到 SK-N-SH 和 B β1 在不同條件的處理之下，sub-G1 期細胞數目並沒有明顯的改變，而 Bβ2 受到 TM ( 0.1μM ) 處理 24 小時後，sub-G1 期細胞雖然也沒有明顯的增加(圖八)，但若將藥物處理時間延長至 48 小時，則 sub-G1 期細胞會有顯著增加 (圖九)。實驗同以也有使用 TG 作為內質網壓力的來源，此藥物對細胞的傷害較大，在 0.1μM 處理 48 小時候， SK-N-SH 與 Bβ1sub-G1 期皆將近 30％左右(圖十)。將圖譜統計換算，可以觀察到無論是 SK-N-SH、Bβ1 或 Bβ2 細胞株，在經過 TM ( 0.1 μM )處理 48 小時後，所有細胞週期中的 S 期都有下降的趨勢，而 G1 期的百分比則會相對的增加，但在 sub-G1 期部分，只有 Bβ2 細胞其 sub-G1 期百分比會由未經藥物處理前的 5%，提昇至加藥處理後的 25%，而 SK-N-SH 及 Bβ1 細胞株的 sub-G1 期的百分比則無明顯改變(圖十一)。由此可知，Bβ2 細胞株存活率下降的結果，可對應細胞週期的實驗結果：sub-G1 期的大幅提高，證實了 B β2 細胞株的死亡是經過細胞凋亡而造成。為了進一步了解凋亡的原 42 .

(44) 因是否與細胞自噬相關，實驗加入 3-MA 預處理細胞觀察其變化。我們先將細胞以 10μM 的 3-MA 預先處理 24 小時後，將其移除，再以 0.1μM 的 TM 處理 48 小時，觀察細胞存活率和細胞週期的分布。結果顯示，即便受到內質網壓力，所有細胞的活細胞數目依然與正常環境下沒有差異，表示經由 3-MA 處理的 Bβ2 細胞株可以抑制內質網壓力對細胞存活率的影響。對於經由 3-MA (10μM) 預先處理後細胞週期的變化，發現 Bβ2 的 sub-G1 期從原先 TM ( 0.1μM ) 處理過後的 25% 降低至 17% 左右，雖然未能回復至控制組的 5%，但可再次證明經過細胞自噬抑制劑 (3-MA) 處理的 Bβ2 細胞株可以顯著降低內質網壓力所引發的細胞凋亡。實驗更進一步探討經由 TM ( 0.1μM ) 處理過後的 PPP2R2B 穩定細胞株發生細胞自噬作用標記的改變，實驗利用轉殖 LC3 質體，觀察自噬小體的生成，並用 LysoTracker 去確認溶酶體的位置，包括激發綠色螢光的 LC3，和激發紅色螢光的溶酶體 LysoTracker。結果顯示，不論在 SK-N-SH 或 Bβ1 細胞株，無論有經 TM 處理與否，綠色螢光都無明顯的聚集，而是均勻的散布在細胞內，代表游離型 LC3-I，顯示自噬小體並無生成(圖十二 A)。但 Bβ2 細胞經過 0.1μM 的 TM 處理 12、18、24 小時之後，隨著時間的增加，綠色螢光斑點(puncta)會越來越明顯，代表聚合型 LC3-II 有增加的趨勢，尤 43 .

(45) 其以 24 小時最為顯著，並與 LysoTracker 的紅色螢光密合的重疊，呈現黃色斑點，顯示自噬小體正在與溶酶體融合，證實內質網壓力的確會引發細胞自噬。至於 TM 處理 12 小時的 Bβ2 細胞還是以游離態的 LC3-I 居多。至於完全未經 TM 處理的控制組 Bβ2 細胞株，雖然觀察少數綠色螢光班點，但並不會與 LysoTracker 的紅色螢光重疊，代表與細胞自噬並無直接關係(圖十二 B)。若先以 3-MA 預處理 24 小時的 Bβ2 細胞，再加入 TM 12 小時，可以看到綠色螢光均勻的分布在細胞之內，而 18 小時與 24 小時的實驗組，雖然可以看到綠色螢光斑點與紅色螢光的重疊，但比例遠小於單純只以 TM 處理 24 小時的實驗組，顯示 LC3 並無完全大量的轉變成聚合型的 LC3-II，還是以游離型的 LC3-I 占多數，代表經過 3-MA 預先處理的 Bβ2 細胞，可以在內質網壓力的影響下，抑制細胞自噬的進行(圖十二 C)。我們計算紅綠疊合的螢光斑點將其量化，可轉換為長條圖，並清楚觀察到隨著 TM 處理時間的增加，螢光斑點數量也會隨之增多；但若預處理 3-MA，則螢光斑點數量則會大幅減少(圖十二 E)。由前述細胞週期分析以及螢光顯微鏡照相，我們已經得知 TM 會引起 Bβ2 細胞凋亡，但若預先處理 3-MA，則可以降低細 sub-G1 百分比的分布，並提高細胞的存活率。我們進一步探討 TM 對細胞內蛋白的影響以及發生的途徑，因此使用 western blot 來觀察細胞凋亡相 44 .

(46) 關蛋白。以 0.1μM 的 TM 處理 48 小時及預處理 10μM 的 3-MA，無論是 SK-N-SH、Bβ1 或 Bβ2 細胞，活化的 caspase-3 皆無表現，只能觀察到分子量 34-kD 未活化的 pro-caspase-3(圖十三)，這代表 Bβ2 細胞因 TM 所引起的細胞凋亡，不需要依賴 caspase，也就是採用 caspase 非依賴性路徑，使細胞最終走向死亡。而若我們以細胞自噬抑制劑 3-MA 預處理的時候，可以觀察到，用來做為凋亡指標的 PARP 的 89kD 片段蛋白表現量，有明顯的減少(圖十四)。這代表 Bβ2 細胞在受到 TM 所造成的內質網壓力下，是藉由細胞自噬來引發系標凋亡，進而降低 Bβ2 細胞的存活率。. 三、. 低氧環境對Bβ1與Bβ2的影響實驗同時也分別將SK-N-SH、Bβ1和Bβ2細胞置於0.5%氧氣濃. 度的低氧環境下培養，觀察正常氧分壓與低氧環境下粒線體膜電位的差別。我們觀察細胞在低氧環境下培養48、72及96小時後細胞表型的變化。由流式細胞儀分析細胞週期，顯示在48小時的處理下，Bβ1 與Bβ2細胞相較於正常氧氣濃度培養細胞的sub G1 期並無太大差異，皆維持在3％以下，但隨著低氧培養的時間延長為72及96小時，Bβ1 的sub-G1 期雖然也有隨時間而增加，但不如Bβ2的sub-G1 期在整個細 45 .

(47) 胞週期中所占的比例顯著上升，尤其在96小時Bβ2的sub-G1百分比已從控制組的2%升至58%，至於G2和S期的百分比總合則是隨著時間增加而遞減(圖十五)。針對sub-G1觀察，48小時情況下，不管何種細胞皆與正常培養之細胞無差異，但從72小時開始，Bβ1與Bβ2細胞的sub-G1 期百分比與正常氧氣濃度下培養之細胞皆有顯著差異，至於SK-N-SH無論在任何時間點皆不受影響(圖十六)。由統計看來，Bβ1與Bβ2要經過較長時間(大於72小時)的低氧環境下才會引發細胞凋亡，而其中又以Bβ2受到的傷害大於Bβ1細胞。. 46 .

(48) 伍、討論. 本研究主要是探討過度表現 PPP2R2B 的穩定細胞株，在飢餓壓力、內質網壓力及低氧環境壓力下是否也會影響。. 實驗使用兩種不同的細胞自噬抑制劑：3-MA 與 Bafliomycin A1，不過兩種抑制劑的作用方式不同，3-MA 是抑制 PI3-Kinase 活性，阻止自噬小體(autophagosome)的形成；Bafilomycin A1 則是阻斷溶體 H+ 的運輸，使自噬溶酶體(autophagolysosome)無法成形(Yoshimori et al., 1991)。實驗顯示不同的抑制機轉分別針對不同細胞的環境壓力之反應也不一樣，這代表細胞自噬調控在不同的壓力下也不一樣。在本實驗所探討的三種不同環境壓利條件下，3-MA 與 Bafliomycin A1 分別有不同的抑制效果。. 一、. 飢餓壓力對細胞的影響飢餓的定義包括營養不足(under-nourishment) 和營養不良. (malnutrition)，一般常因飢餓所引起的疾病，大多與某些營養素缺少所致(Pratt et al., 2009)。因此本實驗採用 HBSS 作為飢餓壓力實驗的培養基，在缺乏醣類、脂肪酸和基本胺基酸，但維持細胞基礎的礦物質、 47 .

(49) 酸鹼值等情況下，細胞狀況的改變。正常條件下的健康細胞，粒線體膜電位會維持一定的電壓，而細胞凋亡的前期徵兆之一就是膜電位下降；細胞週期中 sub- G1 期的上升也是細胞凋亡的現象之一。我們從實驗結果可看出 HBSS 對細胞的傷害主要發生 PPP2R2B 基因在細胞質過度表現的 Bβ1 細胞。細胞中含有大部分的代謝中間物，如糖解作用、胺基酸、脂肪酸等，在培養基來源不夠提供充分營養的條件下，細胞質出現異常，影響的就是細胞對養分的利用。但 HBSS 對於粒線體過度表現 PPP2R2B 的 Bβ2 不會造成傷害，因此可以推論 Bβ2 的相關機制可以補營養缺乏下養分的來源。另外本實驗同時依照飢餓壓力處理模式，但改為先以自噬抑制劑 3-MA 或 Bafilomycin A1 預處理處理 24 小時，再讓細胞培養在飢餓壓力、內質網壓力或低氧環境下觀察實驗結果。實驗採用及 0.5nM 低劑量的 Bafilomycin A1 為實驗濃度，是因為 Bafilomycin A1 本身是一種抗生素(巴佛洛黴素 A1)，對細胞具有微量毒性，加上參考前人實驗結果，發現一般實驗使用 Baflimycin A1 的濃度均小於 1nM(Shacka et al., 2006)，因此本實驗最後以 0.5nM 作為最終濃度。得到 Bafilomycin A1 可以提高 Bβ1 在 HBSS 的細胞存活率，表示 Bafilomycin A1 對飢餓壓力造成的傷害有某種程度的拯救效果。因此可以推論 Bafilomycin A1 48 .

(50) 可抑制 HBSS 引起的細胞自噬，進而抑制接續的細胞凋亡。且此作用只針對過度表現 PPP2R2B 在細胞質的神經細胞，並不參與粒線體的影響。Bafilomycin A1 是利用抑制氫離子的運輸，讓自噬小體無法於溶酶體結合成自噬溶酶體來抑制自噬作用(Byun et al., 2007)，氫離子是否在細胞自噬的過程中扮演某些角色，目前的研究還未給與確切定位，不過已經知道的是自由基所造成的氧化壓力會加重細胞自噬的發生 (Higgins et al., 2010)，而氫離子若能中和自由基，減少氧化壓力，進而抑制自胞自噬的發生，進而減緩細胞凋亡，這在未來的研究將是很值得探討的方向。在飢餓壓力的實驗方面，本論文採用了很多時間點，從 3 小時至 6、9 及 12 小時，其中 Bafilomycin A1 僅能救回受到 HBSS 處理 6 小時的細胞，超過 6 小時甚至 12 小時都無法救回，甚至會加速細胞的死亡。是否 6 小時就是細胞由自噬轉為凋亡的關鍵時間點，我們需要靠更多自噬蛋白與凋亡蛋白的消長，作進一步確認。. 二、內質網壓力對細胞的影響為了要了解內質網壓力對細胞傷害的影響是否與 PP2A 次單位 PPP2R2B 活性有密切的關係，本實驗利用 Tunicamycin (TM)做為內質 49 .

(51) 網壓力的來源，探討內質網壓力是否也會影響過度表現 PPP2R2B 穩定細胞株的影響，TM 利用抑制蛋白質的 N 端醣化作用(N-glycosylation) 使內質網壓力產生，且有許多研究顯示 TM 所引起的內質網壓力會造成細胞自噬的產生，最後導致細胞凋亡(Ogata et al., 2006)。本實驗採用研究低劑量 0.1μM 的 TM 處理的細胞，因為參考前人實驗，細胞再在 0.1μM 的 TM 可以存活超過 24hr，但經高濃度 TM 處理的細胞，會立刻造成細胞死亡(Hsu, 2006)，所以本實驗 TM 的最終濃度決定為 0.1μM。而從實驗結果得到 SK-N-SH 和 Bβ1 不受 TM 影響，但 Bβ2 則大幅降低活細胞數。這樣結果顯示 PPP2R2B 過度表現的位置不同，受到內質網壓力對細胞的影響也會不同。可是是因為 PPP2R2B 可以去磷酸化細胞內的蛋白，會影響細胞的生長速率 (Mochida et al., 2009)，所以當粒線體過度表現 PPP2R2B 時，更易引起細胞自噬與凋亡，過去的文獻報導也證實神經細胞會因內質網壓力所誘發的細胞凋亡而死亡符合(Wang et al., 2011)。在內質網壓力對於 Bβ2 細胞所產生的細胞凋亡過程中，預處理 3-MA 卻可以拯救受到內質網壓力而引起細胞凋亡的 Bβ2 細胞株。本實驗以螢光顯微鏡照相確定了內質網壓力僅為促進 Bβ2 細胞的自噬溶酶體的生成，在由細胞週期觀察到細胞凋亡指標 sub-G1 的上升，證實引起細胞凋亡是源自細胞自噬途徑，而且皆於溶酶體發生。由上述 50 .

(52) 結果，我們推測當粒線體過度表現 PPP2R2B 時，會提升細胞對內質網壓力的敏感度，並且誘導更多的細胞自噬而導致細胞凋亡。程式性死亡可分為 casepase 依賴性途徑和非 caspase 依賴性途徑，前者需要活化 caspase-3 等蛋白來引發細胞凋亡。而 caspase 非依賴性途徑則有許多不同路徑，包括細胞自噬、粒線體途徑、甚至有研究顯示 Bcl-2 蛋白過度表現時，不需 caspase 活化就能直接引起細胞凋亡。不過以目前的研究來說，細胞自噬占了 caspase 非依賴性途徑的最主要比例。本實驗經由 western bolt 也證實了 TM 不會引起 SK-N-SH、B β1 或 Bβ2 細胞的 caspase-3 蛋白活化，由此可證明走的是非 caspase 依賴途徑，也就是所謂的，同時，若我們抑制了細胞自噬的現象，反而會使 Bβ2 細胞的存活率提高。加上前述螢光顯微鏡觀察到結果，我們可以結論 TM 所造成 Bβ2 細胞程式性死亡是採取非 caspase 依賴性途徑之中的細胞自噬，這些實驗結果皆可證明，內質網壓力會造成粒線體過度表現 PPP2R2B 神經母細胞的第二型的細胞程序性死亡 (Type II Programmed cell death)，也就是細胞自噬所引起的細胞凋亡。但我們依然無法排除其他蛋白參與的可能，尤其是細胞自噬一般都發生在 caspase 活化之前，是否因此影響到 caspase 的活化？在時間順序上的關係也待我們進一步研究。 3-MA 主要作用在自噬初期抑制前自噬泡的形成，我們猜測，使 51 .

(53) 細胞質中的 PI3KⅢ與 ATG 相關分子無法結合(Petiot et al., 2000)，在細胞質的位置就已經阻止細胞自噬，而不至於影響到粒線體而導置後續的凋亡發生，所以就算是粒線體過度表現 PPP2R2B，細胞在內質網壓力下，短時間內依然維持一定的正常生理狀態。至於 PPP2R2B 如何引發細胞自噬？這現象是否與 Akt pathway 活化有關，未來仍應使用不同的抑制劑作更深入的研究。. 三、. 低氧環境對細胞的影響環境壓力除了飢餓壓力與內質網壓力外，低氧環境也是造成細. 胞凋亡的主要來源(Tofighi et al., 2006)，同時當細胞處於低氧環境的時候，PP2A的活性會下降。本實驗觀察到細胞質與粒線體過度表現 PPP2R2B的Bβ1細胞株與Bβ2細胞株，在低氧環境中培養時間越長， sub- G1的百分比就升高越多，顯示過度表現PPP2R2B的細胞容易對低氧環境敏感，造成PP2A的活性下降，又因PP2A可去磷酸化細胞週期後期蛋白，所以我們可推估S期和G2期中的蛋白被異常磷酸化，導致細胞無法順利複製DAN和胞器而無法正常進行細胞分裂，最後走向細胞凋亡或者細胞自噬。目前已經知道可能的蛋白質有 Ca/calmodulin-dependent kinase IV (CaMK IV)等(Truttmann et al., 2004)，我們希望可以進一步證實更多細胞週期的蛋白與低氧環境壓力造成 52 .

(54) PPP2R2B過度表現的細胞株之間的關連性，其中Bβ2細胞無論在subG1或S期與G2期的百分比總合受到低氧環境影響的程度都比Bβ1來得嚴重，因此可以推估低氧壓力主要是針對粒線體方面的pathway作用，需要更多粒線體指標蛋白做進一步的確認。另外，在低氧環境中培養的細胞，反應時間較前兩種環境壓力來的長許多，在細胞週期的觀察方面，24小時內並無出現明顯變化，要一直到48小時以上，sub-G1才有顯著的上升。我們推論低氧壓力所造成的細胞損傷，與粒線體無直接的關係，可能是走不同途徑影響細胞的存亡。也因為低氧壓力不影響粒線體，所以低氧壓力不會產生細胞自噬，比較可能採取非粒線體相關的細胞凋亡途徑（外因式途徑）。另外，細胞在短時間缺氧的情況下，透過缺氧誘導因子 (Hypoxia-inducible factor 1- alpha, HIF-1α)調控下游基因的表現，使細胞更易增生，而不會直接走向凋亡，需要造長時間的低氧環境下，細胞才會死亡。缺氧誘導因子與PPP2R2B之間是否有交互作用或彼此影響，以及低氧壓力依循何種途徑造成細胞死亡，將是我們未來繼續探討的方向之一。. 此外本研究也探討其他藥物對 Bβ 系列細胞株所可能引起細胞凋亡，如：白藜蘆醇(Jang et al., 1997)，但皆無法抑制 HBSS 和 TM 所誘發的 53 .

(55) 細胞凋亡，因此可以推測白藜蘆醇之類抗氧化劑並不能有效抑制細胞凋亡，而是應由抑制細胞自噬方向著手。且不同抑制細胞自噬的途徑會針對不同環境壓力造成的傷害各有專一性影響。. 54 .

(56) 陸、結論. 研究結果顯示過度表現 PPPR2R2B 於細胞質的 Bβ1 細胞在以 HBSS 作為飢餓壓力的來源下會產生細胞凋亡，但以 Bafilomycin A1 預處理，則可抑制因飢餓壓力所引起的細胞自噬，進而減後續的細胞凋亡，提高細胞存活率。而比起母細胞 SK-N-SH 和 Bβ1，粒線體過度表現 PPP2R2B 的 B β2 細胞，則是對 TM 所引發的內質網壓力特別敏感。內質網壓力導致 Bβ2 細胞產生細胞凋亡是源自於細胞自噬，所以若事先使用 3-MA 之類藥物抑制細胞自噬的產生，將會有效減緩細胞凋亡的發生，即便受到環境壓力的傷害，也可維持部分細胞存活。同時也觀察到低氧環境壓力造成 PPP2R2B 過度表現的細胞株都會引起細胞凋亡的情形，需要再進一步探討與之相關的細胞週期蛋白。此論文利用不同胞器表現 PPP2R2B 的穩定細胞株做為研究模型，探討內質網壓力與細胞凋亡及自噬間的關係，提供了神經病變一個新的方向，期能對神經疾病的研究及臨床治療發展有所助益。. 55 .

(57) 柒、參考文獻 Araya R, Uehara T, Nomura Y (1998) Hypoxia induces apoptosis in human neuroblastoma SK‐N‐MC cells by caspase activation accompanying cytochrome c release from mitochondria. FEBS Lett 439:168‐172. Arendt T, Holzer M, Fruth R, Bruckner MK, Gartner U (1998) Phosphorylation of tau, Abeta‐formation, and apoptosis after in vivo inhibition of PP‐1 and PP‐2A. Neurobiol Aging 19:3‐13. Bellu AR, Kiel JAKW (2003) Selective degradation of peroxisomes in yeasts. Microsc Res Techniq 61:161‐170. Bindra RS, Gibson SL, Meng A, Westermark U, Jasin M, Pierce AJ, Bristow RG, Classon MK, Glazer PM (2005) Hypoxia‐induced down‐regulation of BRCA1 expression by E2Fs. Cancer Res 65:11597‐11604. Boya P, Gonzalez‐Polo RA, Casares N, Perfettini JL, Dessen P, Larochette N, Metivier D, Meley D, Souquere S, Yoshimori T, Pierron G, Codogno P, Kroemer G (2005) Inhibition of macroautophagy triggers apoptosis. Mol Cell Biol 25:1025‐1040. Boyce M, Bryant KF, Jousse C, Long K, Harding HP, Scheuner D, Kaufman RJ, Ma DW, Coen DM, Ron D, Yuan JY (2005) A selective inhibitor‐of eIF2 alpha dephosphorylation protects cells from ER stress. Science 307:935‐939. Bratton SB, Cohen GM (2001) Apoptotic death sensor: an organelle's alter ego? Trends Pharmacol Sci 22:306‐315. Brezis M, Rosen S (1995) Hypoxia of the renal medulla‐‐its implications for disease. N Engl J Med 332:647‐655. Byun YJ, Lee SB, Kim DJ, Lee HO, Son MJ, Yang CW, Sung KW, Kim HS, Kwon OJ, Kim IK, Jeong SW (2007) Protective effects of vacuolar H+ ‐ATPase c on hydrogen peroxide‐induced cell death in C6 glioma cells. Neurosci Lett 425:183‐187. Carmeliet P, Jain RK (2000) Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 407:249‐257. Chang RCC, Wong AKY, Ng HK, Hugon J (2002) Phosphorylation of eukaryotic initiation factor‐2 alpha (eIF2 alpha) is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's disease. Neuroreport 13:2429‐2432. Carr G, Williams DE, Diaz‐Marrero AR, Patrick BO, Bottriell H, Balgi AD, Donohue E, Roberge M, Andersen RJ (2010) Bafilomycins produced in culture by Streptomyces spp. isolated from marine habitats are potent inhibitors of autophagy. J Nat Prod 73:422‐427. Cheng WT, Guo ZX, Lin CA, Lin MY, Tung LC, Fang K (2009) Oxidative stress promotes autophagic cell death in human neuroblastoma cells with ectopic transfer of 56 .

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