飢餓壓力

計數 5×10⁵細胞到 6 公分培養盤中培養 24 小時後待貼盤，以 HBSS 清洗細胞，再加 2ml 的 HBSS，放回 37℃培養箱中繼續培養 6、

9、12 小時。而控制組則是清洗細胞過後，再以含有 FBS 的 DMEM 培養基繼續培養(表一)。

5. 3-Methyladenine (3-MA) (Sigma, St. Louis, MO)

每盤細胞數為 5×10⁵培養於含有 2 毫升培養基的 6 公分培養盤 24 小時後，加入 3-MA 並將培養基體積補滿為 3 毫升，使最後 3-MA 濃度為 10µM，放置 37℃培養箱中 24 小時後更換 3 毫升的培養基，再 加入 TM 或 TG 培養 24 或 48 小時，最後分析其細胞變化(圖一 D)。

6. Bafilomycin A1 (from Streptomyces, Sigma, St. Louis, MO)

每盤細胞數為 5×10⁵培養於含有 2 毫升培養基的 6 公分培養盤 24 小時後，加入 Bafilomycin A1 並將培養基體積補滿為 3 毫升，使最 後 Bafilomycin A1 濃度為 0.5nM，放置 37℃培養箱中 24 小時後更換 3 毫升的培養基，再加入 HBSS 培養 6、9 及 12 小時，最後分析其細胞 變化(圖一 C)。

三、蛋白質萃取與定量 1. 蛋白質萃取

培養於培養皿的細胞當生長到一定適當數量，或是經加藥處理 後，將培養皿中的培養液吸除，以 PBS (phosphate-buffered saline : 0.14 M NaCl，2.7 mM KCl，1.5 mM KH²PO⁴，8.1 mM Na²HPO⁴) (Sigma, St. Louis, MO)洗滌 2 次後，加入適量 RIPA lysis buffer (RIPA buffer : 50 mM，Tris pH 7.5，150 mM NaCl，10 mM EDTA，0.1% SDS，1 mM

phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)，10 µg/ml aportonin)放置冰上約 5 分鐘，以刮勺將細胞由培養皿內刮下，在 4℃中以 13,000 rpm 離心 60 分鐘後，取其上層清液，即取得細胞蛋白質。

2. 蛋白質定量：

依 Bradford 法，以 microplate reader 測定細胞蛋白質濃度。取 4 µl

蛋白質與 296 µl 蛋白質染劑 (Coomassie Brilliant Blue)(Pierce Chemical, Rockford, IL)均勻混合，並配置不同濃度 (62.5、125，250，500，1,000 或 2,000 µg/ml)的 BSA 標準樣品用 590 nm 波長測其吸光值，做成一條 標準回歸曲線，求得一線性方程式 (r²>0.95 才可採用)。將欲測濃度的 細胞蛋白質所測得的吸光值代入公式中即可求出其濃度。

四、西方轉漬法 (Western blot analysis)

以西方轉漬法去鑑定細胞內確實有過度表現的 B1 和 B2 這兩 種蛋白質。此實驗中鑑定 B1 和 B2 蛋白質的血清抗體 (創生生物科 技)，B1 血清抗體所辨認的蛋白質序列為

MEEDIDTRKINNSFLRDHSYA；B2 血清抗體所辨認的蛋白質序列則

為 MKCFSRYLPYIFRPPNTILSSSCH(Cheng et al., 2009)。

取 20 μg 的蛋白質與樣品緩衝液 (3× sample buffer : 350 mM pH 6.8 Tris-HCl，12% SDS，0.02% bromophenol blue，35% glycerol，30%

β-mercaptoethanol)依 2:1 比例混合均勻後，以 95℃加熱 5 分鐘，再置 入 SDS PAGE gel (5% stacking gel，10% running gel)中進行電泳。先以 50 伏特的電壓進行 30 分鐘後改以 100 伏特的電壓進行 120 分鐘的電 泳。

使用 transfer unity 裝置 (HOEFER)(Amersham Pharmacia)以 40 伏

特的電壓，90 分鐘，將膠片上的蛋白質轉至硝化纖維膜 (nitrocellulose blotting membrane)(Schleicher & Schuell BioScience GmbH, Germany)。次 將硝化纖維膜取出並於室溫下浸泡於 blocking buffer (5% skim milk in PBS-T)中 1 小時後，以 PBS-T (0.5% Tween 20 in PBS)清洗硝化纖維膜 3 次，再加入經稀釋過的一級抗體，進行 probe。在 4℃下反應 16 小 時後，再以 PBS-T 沖洗 3 次，並再加入經 1:2000 比例稀釋的二級抗體，

於室溫中反應 1 小時後，再以 PBS-T 沖洗 3 次，最後以冷光呈色劑 (Immobilon Western)(Millipore Corporation, Billerica, MA)加於硝化纖維 膜，避光 2 至 3 分鐘後，以冷光儀顯影，並分析儲存數據。

本論文使用的抗體有 goat anti-GAPDH(1:3000;Santa Cruz Biotechnology,sc-20357 )、rabbit anti-Beclin-1(1:4000; Santa Cruz Biotechnology,sc-11327)、rabbit anti-LC3(1:3000;Novus

Biotechnology,1384SS)

五、細胞存活率測定

將經過藥物處理的細胞使用 PBS 清洗 2 次以後，加入 trypsin 反應 5 分鐘，使細胞從培養盤上打下，再加含有 10%FBS 的 DMEM 終止反 應，將全部細胞液收集至 15cc 離心管內，以 1000 rpm 轉速細胞離心 5 分鐘後，移除含有 trypsin 的上清液，加入適量培養基混合成 1 ml

均勻的細胞懸浮液。吸取 10μl 的細胞懸浮液與等量的 typan blue 混和，

注入專用的血球記數盤中，送至細胞計數器（Countess, invitrogen）。 健康細胞的細胞膜完整，染劑無法滲透進去，死細胞的膜完整性喪失，

通透性增加，細胞會被染成藍色，Countess 會自動判別活細胞與藍色 的死細胞，計算出活細胞與死細胞的數量以及存活率。

六、細胞週期及 DNA 含量分析 1.細胞週期分析

Propidium iodide (PI)分子會與細胞核內 DNA 雙股螺旋上 AT、

CG 之氫鍵結合，經波長 488 nm 的激發光激發後，放出 620 nm 的散 射光。在細胞正常情況下，PI 染劑無法鍵結上細胞核內 DNA，所以 螢光強度較弱，但細胞受損時，PI 便可鍵結至外露的 DNA 上，激發 出較高螢光。藉由此種特性，便可分析出細胞內的 DNA 套數，再以 軟體分析即可得知各細胞週期的分佈。

收集細胞培養液後，以 PBS 清洗細胞 2 次，用 trypsin 將細胞自培 養皿中取下，兩者混合一起後，經 1,500 rpm 離心後，以 1 ml PBS 將 細胞塊打散，再加入同體積的 70%酒精/PBS 固定細胞 24 小時後，離 心洗去固定液，次加入含 5 µg/ml PI (Sigma, St. Louis, MO)及 10 µg/ml RNase A (ICN Pharmaceutical, Costa Mesa, CA)的 PBS，並於室溫下避光

30 分鐘，利用 FACS Array 流式細胞儀 (Becton Dickinson, San Jose, CA) 偵測細胞中的 PI 螢光強度 (激發光源：488 nm；散射光源：620 nm) 後，計算各個細胞內的 DNA 含量，以分析位在細胞週期各階段的細 胞數量，最後以 Mofit 2.0 (Becton-Dickinson, San Jose, CA)軟體進行分 析。

七、 細胞螢光染色分析

將 LC3-EGFP 質體 (2 g/μL) 與 50 l Opti-MEM (serum-free medium) 混勻後，加入已均勻混合好含 1.5 l OPTIFECT reagent 總體 積為 50 l 的 Opti-MEM中，於室溫下靜置15分鐘，再加入分別含有

SK -N-SH 、Bβ1 及Bβ2 細胞株 1×10⁵ (cells/well) 於12 -well 培養盤 中，培養24小時，更換新培養液，加入0.1 µM 的Tunicamycin ( TM )，

分別處理12、18以及24小時，之後去除上清液，用PBS清洗2次以除去 細胞上的藥劑，加入1 : 2,000稀釋的溶酶體染劑

(LysoTracker)(Invitrogen, Gaithersburg, MD) 置於37℃下15分鐘，再以 PBS洗去染劑，利用螢光顯微鏡(Leitz LABOR LUXS)激發照相並將影 像儲存，利用軟體做影像重疊，分析資料。

八、 粒線體膜電位測試

將5x10⁵細胞置於6 cm培養盤中，經過環境壓力處理後，把含有 藥物的培養液吸除，以 PBS 沖洗後，以 trypsin-EDTA 進行作用後製 成細胞懸浮液後，取0.5ml的細胞懸浮液放入滅菌後離心管中，以400g 離心5分鐘後移除上清液，再加入 0.5ml 的 1X 的 JC-1 reagent solution (Cell Meter, AAT Bioquest Inc.) ，置入37℃培養箱中培養15分鐘 後，在以1000rpm離心5分鐘後，移除上清液，加入2ml 的細胞培養液 後離心，重複前述步驟。再加入0.5ml的細胞培養液，即可使用 FACSCalibur 流式細胞儀分析。定義橫坐標為FL1-H，激發綠色螢光；

縱座標為 FL2-H，激發紅色螢光。以WinMDI2.8 (Becton-Dickson, Mansfield, MA)進行四象限分析數據，定義左下角為第一象限，右下角 為第二象限，右上角為第三象限，左上角為第四象限。若左上角的紅 色螢光訊號減弱，表示粒線體膜電位降低。

九、 實驗數據統計

實驗數據挑選三次以上獨立實驗，以paired

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