(1) Pichia pastoris β-glucosidase (medium) 水解反應
依據方法十.1. 進行 Pichia pastoris β-glucosidase (medium) 水解 反應。隨著反應時間的增加，VA 訊號峰面積約 16%，並沒有隨著
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積的生成 (圖三十二 D)。
(5) H2SO4 水解反應
依據方法十.2. 進行 H2SO4 水解反應。反應至 20 分鐘，VA 被完 全作用，且約有 45% VAA 訊號峰面積的生成。
2. VAA 的純化
此後加入 Ba(OH)2 中和至 pH 5 後離心過濾，VAA 訊號峰面積並 沒有減少，此後將樣品通入 Aberlite ® IR-120 [H+] 管柱，發現所流出 的 flowthrough 其 VAA 只剩約 1/3 訊號峰面積，表示有約 2/3 訊號 峰面積的 VAA 被管柱抓住，此後利用 NH4OH 進行沖洗並濃縮後，
通入 Dowex ® 1X2 [OH–] 管柱並以二次去離子水進行沖洗能得到高 純度的 VAA (圖三十三)，此後利用冷凍乾燥濃縮機進行凍乾，可得 到約 0.1 g 的 VAA 白色粉末。
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isomaltulose) 及 α-1,1-鍵結的海藻酮糖 (α-D-glucopyranoside-1,1-D- fructofuranosyl，trehalulose)，會有微弱的水解活性產生副產物葡萄糖 與果糖 (D-fructose)。SI 的酵素結構之間是十分相似 (高達 80% 結構 疊合的一致性)，不同的菌種的 SI 其異麥芽酮糖與海藻酮糖的產物比 率也不相同。SmuA 與 PalI 主要催化生成 α-1,6-鍵結的異麥芽酮糖，
而 MutB 則主要催化生成 α-1,1-鍵結的海藻酮糖 (Ravaud et al., 2007, 2009; Zhang et al., 2003a)。
目前 MutB、SmuA 與 PalI 的酵素結構已經被發表了 (附錄十)。
這些酵素包含了三個區域 (domain) ，A 區域為主要負責催化功能的 區域，由 (β/α)8 的桶狀結構 (TIM barrel) 所組成，以及一個富有環狀 結構 (loop) 的 B 區域和幾個反向平行的 β-折疊 (β-sheet) 的 C 區域。
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三個催化性胺基酸 Asp200、Glu254 與 Asp327(MutB 編號)，被證明 主要負責催化異麥芽酮糖與海藻酮糖的異構化。Asp200 為親核體 (nucleophile) 會去攻擊糖苷鍵，之後形成 β 鍵結共價結合的中間產物 (intermediate)，這反應並由 Glu254 酸/鹼催化劑 (acid/base catalyst) 與 Asp327 過度狀態的穩定者 (transition-state stabilizer) 所促成
(Aroonnual et al., 2007; Lee et al., 2008; Zhang et al., 2003a)。在 SI 中，
只有一個催化的水分子 Wat4248 (MutB 編號) 會直接參與水解反應 (Ravaud et al., 2007, 2009)。有一對 Phe 形成的芳香族夾子 (aromatic clamp)，Phe256 與 Phe280 (MutB 編號) 藉由阻礙活性中心的開口處 保護中間產物免於遭受水分子攻擊以避免水解 (Ravaud et al., 2007, 2009)。以及 SI 具有個獨特的果糖結合位 (fructosyl binding site，FBS) 圍繞在 SI 的 +1 subsite，會影響產物的專一性並預防水解 (Zhang et al., 2003b)。在過去的研究中，SI 只有少量的水解副產物產生
(Veronese and Perlot, 1998)，其中 MutB 只有 1% 的水解活性 (Hamerli and Birch, 2011) (附錄十一)。
因此本研究利用分子模擬以 SI 的 MutB 為模板模擬出 DrTS 的 蛋白質三級結構，雖然模擬的 DrTS 整體結構與 MutB 是相似的，然 而 DrTS 缺少了 MutB 的 FBS (fructose binding site)，導致 DrTS 有個 廣闊的開口通道，可能使得催化水分子更容易進入酵素之活性中心進
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行水解，可能因此造成 DrTS 的水解活性要比 MutB 的水解活性高出 許多。
2. DrTS 受質結合位的預測
根據模擬的麥芽糖與 DrTS 複合物立體結構，找出 DrTS 內有 21 個胺基酸與麥芽糖距離 5 Å 之內，分別為 Asp63、Tyr66、Val103、
His106、Asp153、Thr154、Phe173、Phe174、Gln177、Arg207、Asp209、
Ala210、Glu251、Asn253、Gln254、Phe277、Pro281、Asn317、His318、
Asp319、Glu320 與 Arg398，因此推測這些胺基酸與麥芽糖的結合可 能扮演著重要的角色。
將 DrTS 這 21 個胺基酸與 SI 的結構重疊後，有 14 個與 SI 一致 的胺基酸，主要分布在 -1 subsite 的周圍，分別為 Asp63、Tyr66、
Val103、His106、Phe173、Gln177、Arg207、Asp209、Glu251、Phe277、
Asn317、Asp319、His318 與 Arg398，推測這些保守性的胺基酸可能 對於 TS 與 SI 之間共同的催化反應和功能扮演著重要的角色，例如：
-1 subsite 的結合、催化反應時醣苷鍵的斷裂與再接合。此外有 7 個 與 SI 不一致的胺基酸，分別為 Asp153、Tyr154、Phe174、Ala210、
Asn253、Gln254 與 Glu320，主要分布在 +1 subsite 的周圍，因此推 測這些不一致的胺基酸可能對於 TS 與 SI 之間不同的酵素催化反應 扮演著重要的角色，例如：+1 subsite 的結合、催化反應時形成不同
53 Asn317 藉由定位突變取代成疏水性且側鏈大小不同的 Ala、Leu 或 Phe (圖八)，可能減少水解的副反應藉以提升海藻糖的轉化率。
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性中心的開口處保護中間產物免於遭受水分子攻擊以預防水解
(Ravaud et al., 2007, 2009)。疊合 DrTS 與 SI 的立體結構後，在 DrTS 的相同的位置上也有一個芳香族胺基酸 Phe277，然而另一個胺基酸 卻為親水性的 Asn253，因此若將 Asn253 藉由定位突變取代成也具 有芳香族的 Phe (圖十)，也可能減少水解的副反應以提升海藻糖的轉
從突變株 DrTS (N317A、N317F 與 N317L) 的轉化率中可發現，
55 酸序列所比對的 Arg316 周圍序列所缺失的 Phe (314-315)，使得 DrTS 在此部分的結構能更類似 SI，來減少水解的副反應。
4. 突變株 DrTS (N253F) 的轉化率分析
從突變株 DrTS (N253F) 的轉化率中可發現，反應於 20℃ 時幾乎
56 將 Asn253 突變成具有疏水性的小分子胺基酸，例如：Leu、Val 或Ile，
就有可能減少水解副反應並且提升海藻糖轉化率。
5. 突變株 DrTS (T154F)
DrTS 的胺基酸 Thr154 與 SI 胺基酸序列及結構比對分別為 Phe145 (MutB 編號)、Phe144 (SmuA 編號) 與 Phe186 (PalI 編號)，以 及在不同種 TS 的胺基酸序列比對中，具有耐熱性的 TS 分別為 Phe142 (TaTS 編號)、Phe144 (TtTS 編號) 與 Phe146 (MrTS 編號)，
也皆為 Phe。在突變株 DrTS (T154F) 的突變結構中，Phe 的芳香族 的環會與麥芽糖的 +1 subsite 葡萄糖苷的環在立體結構中平行 (圖二 十二)，推測可能因此產生堆疊力 (stacking forces)，對於 +1 subsite 葡 萄糖苷的結合能力因此增強，而提升 DrTS 的活性。
三、 利用 GI-coupled TS 提升 DrTS 的海藻糖轉化率
在過去的研究指出，將 TS 與麥芽糖反應時加入葡萄糖會造成 TS 活性被抑制，動力學分析發現 TS 的 Km 增加了 3.6 倍但 Vmax
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2. GI-coupled TS
從 GI-coupled DrTS 研究中發現，隨著反應時間的增加，加入有 活性的 GI 會比加入沒活性的 GI 的其 DrTS 海藻糖生成量要來的高。
在 20℃ 下，加入有活性的 GI 其 DrTS 海藻糖轉化率上升約 2%；在 40℃ 下，加入有活性的 GI 其 DrTS 海藻糖轉化率上升約 4%。雖然 利用 GI-coupled DrTS 的策略可以讓 DrTS 的轉化率增加，然而
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、sucrose、thiodiglucoside 或 melibiose) 對於 DrTS 則不會有抑制作 用，表示 DrTS 對於雙糖有很高的受質專一性，因此海藻糖的類似物
以 Pichia pastoris β-glucosidase、cellulase、pentinase 或 agarase 來 水解 VA 的反應並不顯著，對於生產 VAA 的產率不高，因此以上酵
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添加 VA，發現在約 4:50 時有訊號峰面積新增，這與所預估的 VA 出 現的時間相同，也能推估反應後新生的訊號峰面積為 VAA。
在過去酸水解的研究中，認為利用 1M 的 H2SO4 於 30% VA 反 應於 100℃、1 小時，能得到較多的 VAA (Jin et al., 2006)。在本研究 中，利用相同反應情況也能得到較多的 VAA 的生成，因此較適合應 用在 VAA 的生產。
綜合本研究的結果，可以提供從事 TS 之蛋白質工程的參考。
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陸、 參考文獻
Adams, R.P., Kendall, E., Kartha, K.K., 1990. Comparison of free sugars in growing desiccated plants of Selaginella-Lepidophylla. Biochem Syst Ecol 18, 107-110.
Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J.H., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D.J., 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25, 3389-3402.
Altschul, S.F., Wootton, J.C., Gertz, E.M., Agarwala, R., Morgulis, A., Schaffer, A.A., Yu, Y.K., 2005. Protein database searches using compositionally adjusted substitution matrices. Febs J 272, 5101-5109.
Aroonnual, A., Nihira, T., Seki, T., Panbangred, W., 2007. Role of several key
residues in the catalytic activity of sucrose isomerase from Klebsiella pneumoniae NK33-98-8. Enzyme Microb Tech 40, 1221-1227.
Avonce, N., Leyman, B., Mascorro-Gallardo, J.O., Van Dijck, P., Thevelein, J.M., Iturriaga, G., 2004. The Arabidopsis trehalose-6-P synthase AtTPS1 gene is a regulator of glucose, abscisic acid, and stress signaling. Plant Physiol 136, 3649-3659.
Chen, Y.S., Lee, G.C., Shaw, J.F., 2006. Gene cloning, expression, and biochemical characterization of a recombinant trehalose synthase from Picrophilus torridus in Escherichia coli. J Agr Food Chem 54, 7098-7104.
Chou, H.H., Chang, S.W., Lee, G.C., Chen, Y.S., Yeh, T.N., Akoh, C.C., Shaw, J.F., 2010. Site-directed mutagenesis improves the thermostability of a recombinant Picrophilus torridus trehalose synthase and efficiency for the production of trehalose from sweet potato starch. Food Chem 119, 1017-1022.
Colaco, C., Sen, S., Thangavelu, M., Pinder, S., Roser, B., 1992. Extraordinary stability of enzymes dried in trehalose - simplified molecular-biology.
Bio-Technol 10, 1007-1011.
Connell, L.W., Sexton, F.W., McDaniel, P.J., Prinja, A.K., 1996. Modeling the heavy ion cross-section for single event upset with track structure effects: The
HIC-UP-TS model. Ieee T Nucl Sci 43, 2814-2819.
Crowe, J.H., Crowe, L.M., 2000. Preservation of mammalian cells - learning nature's tricks. Nat Biotechnol 18, 145-146.
DeLano, W.L., Lam, J.W., 2005. PyMOL: A communications tool for computational models. Abstr Pap Am Chem S 230, U1371-U1372.
Donnamaria, M.C., Howard, E.I., Grigera, J.R., 1994. Interaction of water with alpha,alpha-trehalose in solution - molecular-dynamics simulation approach. J Chem Soc Faraday T 90, 2731-2735.
Elbein, A.D., Pan, Y.T., Pastuszak, I., Carroll, D., 2003. New insights on trehalose: a
63
multifunctional molecule. Glycobiology 13, 17r-27r.
Eroglu, A., Russo, M.J., Bieganski, R., Fowler, A., Cheley, S., Bayley, H., Toner, M., 2000. Intracellular trehalose improves the survival of cryopreserved mammalian cells. Nat Biotechnol 18, 163-167.
Giannesi, G.C., Polizeli, M.D.T.D., Terenzi, H.F., Jorge, J.A., 2006. A novel alpha-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum that converts maltose into trehalose: Purification and partial characterisation of the enzyme. Process Biochem 41, 1729-1735.
Hamerli, D., Birch, R.G., 2011. Transgenic expression of trehalulose synthase results in high concentrations of the sucrose isomer trehalulose in mature stems of field-grown sugarcane. Plant Biotechnol J 9, 32-37.
Han, S.E., Kwon, H.B., Lee, S.B., Yi, B.Y., Murayama, I., Kitamoto, Y., Byun, M.O., 2003. Cloning and characterization of a gene encoding trehalose phosphorylase (TP) from Pleurotus sajor-caju. Protein Expres Purif 30, 194-202.
Hengherr, S., Heyer, A.G., Kohler, H.R., Schill, R.O., 2008. Trehalose and anhydrobiosis in tardigrades - evidence for divergence in responses to dehydration. Febs J 275, 281-288.
Higashiyama, T., 2002. Novel functions and applications of trehalose. Pure Appl Chem 74, 1263-1269.
Hounsa, C.G., Brandt, E.V., Thevelein, J., Hohmann, S., Prior, B.A., 1998. Role of trehalose in survival of Saccharomyces cerevisiae under osmotic stress.
Microbiol-Uk 144, 671-680.
Iturriaga, G., Suarez, R., Nova-Franco, B., 2009. Trehalose metabolism: from osmoprotection to signaling. Int J Mol Sci 10, 3793-3810.
Iwaya-Inoue, M., Takata, M., 2001. Trehalose plus chloramphenicol prolong the vase life of tulip flowers. Hortscience 36, 946-950.
Jin, L.Q., Xue, Y.P., Zheng, Y.G., Shen, Y.C., 2006. Production of trehalase inhibitor validoxylamine A using acid-catalyzed hydrolysis of validamycin A. Catal
Commun 7, 157-161.
Kaasen, I., Mcdougall, J., Strom, A.R., 1994. Analysis of the otsba operon for osmoregulatory trehalose synthesis in escherichia-coli and homology of the Otsa and Otsb Proteins to the yeast trehalose-6-phosphate synthase phosphatase Complex. Gene 145, 9-15.
Katsuno, M., Adachi, H., Sobue, G., 2004. Sweet relief for Huntington disease. Nat Med 10, 123-124.
Kidd, G., Devorak, J., 1994. Trehalose is a sweet target for agbiotech. Bio-Technol 12, 1328-1329.
Koh, S., Kim, J., Shin, H.J., Lee, D., Bae, J., Kim, D., Lee, D.S., 2003. Mechanistic
64
study of the intramolecular conversion of maltose to trehalose by Thermus caldophilus GK24 trehalose synthase. Carbohyd Res 338, 1339-1343.
Kretz, K.A., Richardson, T.H., Gray, K.A., Robertson, D.E., Tan, X.Q., Short, J.M., 2004. Gene site saturation mutagenesis: A comprehensive mutagenesis approach.
Method Enzymol 388, 3-11.
Kyosseva, S.V., Kyossev, Z.N., Elbein, A.D., 1995. Inhibitors of pig-kidney trehalase.
Arch Biochem Biophys 316, 821-826.
Lee, H.C., Kim, J.H., Kim, S.Y., Lee, J.K., 2008. Isomaltose production by
modification of the fructose-binding site on the basis of the predicted structure of sucrose isomerase from "Protaminobacter rubrum". Appl Environ Microb 74, 5183-5194.
Lee, J.H., Lee, K.H., Kim, C.G., Lee, S.Y., Kim, G.J., Park, Y.H., Chung, S.O., 2005.
Cloning and expression of a trehalose synthase from Pseudomonas stutzeri CJ38 in Escherichia coli for the production of trehalose. Appl Microbiol Biot 68, 213-219.
Leyman, B., Avonce, N., Ramon, M., Van Dijck, P., Iturriaga, G., Thevelein, J.M., 2006. Trehalose-6-phosphate synthase as an intrinsic selection marker for plant transformation. J Biotechnol 121, 309-317.
Li, K.B., 2003. ClustalW-MPI: ClustalW analysis using distributed and parallel computing. Bioinformatics 19, 1585-1586.
Maruta, K., Mitsuzumi, H., Nakada, T., Kubota, M., Chaen, H., Fukuda, S., Sugimoto, T., Kurimoto, M., 1996. Cloning and sequencing of a cluster of genes encoding novel enzymes of trehalose biosynthesis from thermophilic archaebacterium Sulfolobus acidocaldarius. Bba-Gen Subjects 1291, 177-181.
Nishimoto, T., Nakada, T., Chaen, H., Fukuda, S., Sugimoto, T., Kurimoto, M., Tsujisaka, Y., 1996a. Purification and characterization of a thermostable trehalose synthase from Thermus aquaticus. Biosci Biotech Bioch 60, 835-839.
Nishimoto, T., Nakano, M., Ikegami, S., Chaen, H., Fukuda, S., Sugimoto, T., Kurimoto, M., Tsujisaka, Y., 1995. Existence of a novel enzyme converting maltose into trehalose. Biosci Biotech Bioch 59, 2189-2190.
Nishimoto, T., Nakano, M., Nakada, T., Chaen, H., Fukuda, S., Sugimoto, T., Kurimoto, M., Tsujisaka, Y., 1996b. Purification and properties of a novel enzyme, trehalose synthase, from Pimelobacter sp R48. Biosci Biotech Bioch 60, 640-644.
Pan, Y.T., Edavana, V.K., Jourdian, W.J., Edmondson, R., Carroll, J.D., Pastuszak, I., Elbein, A.D., 2004. Trehalose synthase of Mycobacterium smegmatis -
Purification, cloning, expression, and properties of the enzyme. Eur J Biochem 271, 4259-4269.
65
Paul, M.J., Primavesi, L.F., Jhurreea, D., Zhang, Y.H., 2008. Trehalose metabolism and signaling. Annu Rev Plant Biol 59, 417-441.
Ravaud, S., Robert, X., Watzlawick, H., Haser, R., Mattes, R., Aghajari, N., 2007.
Trehalulose synthase native and carbohydrate complexed structures provide insights into sucrose isomerization. J Biol Chem 282, 28126-28136.
Ravaud, S., Robert, X., Watzlawick, H., Haser, R., Mattes, R., Aghajari, N., 2009.
Structural determinants of product specificity of sucrose isomerases. Febs Lett 583, 1964-1968.
Richards, A.B., Krakowka, S., Dexter, L.B., Schmid, H., Wolterbeek, A.P.M., Waalkens-Berendsen, D.H., Shigoyuki, A., Kurimoto, M., 2002. Trehalose: a review of properties, history of use and human tolerance, and results of multiple safety studies. Food Chem Toxicol 40, 871-898.
Roser, B., Colaco, C., 1993. A Sweeter Way to Fresher Food. New Sci 138, 24-28.
Rubingh, D.N., 1997. Protein engineering from a bioindustrial point of view. Curr Opin Biotech 8, 417-422.
Ryu, S.I., Park, C.S., Cha, J., Woo, E.J., Lee, S.B., 2005. A novel
trehalose-synthesizing glycosyltransferase from Pyrococcus horikoshii: Molecular cloning and characterization. Biochem Bioph Res Co 329, 429-436.
Schwede, T., Kopp, J., Guex, N., Peitsch, M.C., 2003. SWISS-MODEL: an
automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Res 31, 3381-3385.
Singh, V.K., Mangalam, A.K., Dwivedi, S., Naik, S., 1998. Primer premier: Program for design of degenerate primers from a protein sequence. Biotechniques 24, 318-319.
Thomsen, R., Christensen, M.H., 2006. MolDock: A new technique for high-accuracy molecular docking. J Med Chem 49, 3315-3321.
Veronese, T., Perlot, P., 1998. Proposition for the biochemical mechanism occurring in the sucrose isomerase active site. Febs Lett 441, 348-352.
Wang, J.H., Tsai, M.Y., Chen, J.J., Lee, G.C., Shaw, J.F., 2007. Role of the C-terminal domain of Thermus thermophilus trehalose synthase in the
thermophilicity, thermostability, and efficient production of trehalose. J Agr Food Chem 55, 3435-3443.
Wang, S.B., Li, A.H.T., Chao, S.D., 2012. Liquid properties of dimethyl ether from molecular dynamics simulations using ab initio force fields. J Comput Chem 33, 998-1003.
Wei, Y.T., Zhu, Q.X., Luo, Z.F., Lui, F.S., Chen, F.Z., Wang, Q.Y., Huang, K., Meng, J.Z., Wang, R., Huang, R.B., 2004. Cloning, expression and identification of a new trehalose synthase gene from Thermobifida fusca genome. Acta Bioch Bioph Sin 36, 477-484.
66
Yang, Y.D., Faraggi, E., Zhao, H.Y., Zhou, Y.Q., 2011. Improving protein fold recognition and template-based modeling by employing probabilistic-based matching between predicted one-dimensional structural properties of query and corresponding native properties of templates. Bioinformatics 27, 2076-2082.
Zhang, D.H., Li, N., Lok, S.M., Zhang, L.H., Swaminathan, K., 2003a. Isomaltulose synthase (PalI) of Klebsiella sp LX3 - Crystal structure and implication of mechanism. J Biol Chem 278, 35428-35434.
Zhang, D.H., Li, N., Swaminathan, K., Zhang, L.H., 2003b. A motif rich in charged residues determines product specificity in isomaltulose synthase. Febs Lett 534, 151-155.
Zhu, Y.M., Wei, D.S., Zhang, J., Wang, Y.F., Xu, H.Y., Xing, L.J., Li, M.C., 2010.
Overexpression and characterization of a thermostable trehalose synthase from Meiothermus ruber. Extremophiles 14, 1-8.
Zhu, Y.M., Zhang, J., Xing, L.J., Li, M.C., 2009. Progress on molecular biology of trehalose synthase - A review. Wei Sheng Wu Xue Bao 4;49(1):6-12.
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表一、定點飽和突變的引子設計
將欲突變位各設計正反向兩條做為定點飽和突變之引子，每條引 子核苷酸的數目應介於 20-25 之間，且突變的核苷酸需位在引子序列 的正中間位置。將突變的核苷酸設計成 NNK 只需要 150 個菌株即能
將欲突變位各設計正反向兩條做為定點飽和突變之引子，每條引 子核苷酸的數目應介於 20-25 之間，且突變的核苷酸需位在引子序列 的正中間位置。將突變的核苷酸設計成 NNK 只需要 150 個菌株即能