這也說明了 TS 可能存在兩個受質結合位，分別結合麥芽糖及海藻糖。
在研究中另外發現了，葡萄糖會抑制 TS 的活性，在反應時加入額外 的葡萄糖，會抑制 TS 活性，這研究也證明了酵素與葡萄糖中間產物 的假設 (Pan et al., 2004)。
5. 耐輻射奇異球菌海藻糖合成酶 (Deinococcus radiodurans trehalose synthase，DrTS)
耐輻射奇異球菌 (Deinococcus radiodurans) 屬於格蘭氏陽性菌，
也屬於一種耐輻射的細菌，目前它的基因組 DNA 已經都被定序完成 了。因此將耐輻射奇異球菌的 TS 基因選殖出來後，即為耐輻射奇異 球菌海藻糖合成酶 (Deinococcus radiodurans trehalose synthase，
DrTS)，目前 DrTS 已經被定性完成，其酵素最適反應溫度為 15℃、
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源模擬法 (homology modeling)、摺疊辨識法 (protein fold recognition) 以及重頭起算法 (ab initio) 三種 (Schwede et al., 2003)。
同源模擬法：將目標蛋白質的胺基酸序列與蛋白質結構資料庫 (Protein Data Bank，PDB) 已知蛋白質進行比對，找出最佳的三級結 構模板，以此模板為模型將目標序列輸入後，取得目標蛋白質的三級 結構，經分子動能模擬 (molecular dynamics) 及能量最適化 (energy minimization) 運算，以得到目標蛋白質的三級分子結構模型。一般而
15 個能量最低最穩定的結構 (Thomsen and Christensen, 2006)。
六、 蛋白質工程
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蛋白質工程的方法分為兩大類，第一類為理性的設計 (rational design)，利用蛋白質已知的結構和功能來設計突變的位點，並利用定 位突變 (site-directed mutagenesis) 的技術來進行改造，是個屬於低成 本且較快速的方法。第二類為定向演化 (directed evolution) 的方式，
利用隨機突變的技術來進行改造，這種方式是仿造自然演化的模式，
並且通常會比理性的設計還會有更佳的蛋白質改善，利用定向演化來 進行蛋白質的改造時，最大的優點是不需要預先得知蛋白質的立體結 構，但缺點是需要大量、大規模的篩選，因此並不是所有的蛋白質都 適合以定向演化來改造 (Rubingh, 1997)。
17 合成酶 (Deinococcus radiodurance trehalose synthase，DrTS) 作為研究 的對象，期望可以藉由酵素工程的技術來提升 DrTS 的酵素轉化效率。
2. 以定位突變 (site-directed mutagenesis) 或定點飽和突變 (site-specific saturation mutations) 來建構 DrTS 的突變株：
由麥芽糖嵌合 DrTS 的立體結構所推測出個幾個影響此酵素催 化性質的胺基酸，利用定位突變或定點飽和突變來建構出可能減少水
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解的副反應或改善催化性質的 DrTS 突變株，並分析酵素轉化率。
3. 藉由結合 (couple) 葡萄糖異構酶 (glucose isomerase，GI) 來減少副 產物葡萄糖的抑制：
將 DrTS 與 GI 共同反應，利用 GI 將 DrTS 產生的副產物葡萄糖 轉化成果糖 (fructose) 以減少葡萄糖的抑制性，並分析酵素活性。
4. 藉由加入 α-澱粉酶抑制劑或海藻糖類似物來抑制 DrTS 的逆反 應：
加入 α-澱粉酶抑制劑或海藻糖類似物來抑制 DrTS 的逆反應，分 析酵素正逆反應活性。
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參、 材料與方法
一、 模擬 DrTS 蛋白質三級結構
將 DrTS 的胺基酸序列輸入美國國家生物科技資訊中心
(National Center for Biotechnology Information，NCBI) 的蛋白質資料 庫 (Protein Data Bank，PDB) 中進行胺基酸序列搜尋比對 (BLAST) (Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005)，搜尋最相似胺基酸序列的 已知結構蛋白質，並利用序列比對軟體 (ClustalW) (Li, 2003) 進行比 對。藉由蛋白質分子三級結構模擬網站 (Swiss-Model) (Schwede et al., 2003) 模擬 DrTS 的蛋白質分子三級結構，並根據最相似的已知結構 蛋白質來做為模板 (template)，以得到模擬的 DrTS 蛋白質分子三級 結構。利用分子三級結構顯示軟體 (PyMol) (DeLano and Lam, 2005) 來進行結構的顯示、疊合 (superimposition) 與胺基酸的突變模擬。
二、 模擬 DrTS 與麥芽糖的複合物立體結構
藉由化合物資訊中心 (Hetero-Compound Information Centre，
HIC-Up) (Connell et al., 1996) 下載麥芽糖的分子結構模型。藉由電腦 模擬分子嵌合軟體 (Molegro Virtual Docker，MVD) (Thomsen and Christensen, 2006) 模擬 DrTS 與麥芽糖的複合物立體結構，此軟體利 用嵌合模擬法 (docking simulation) 預測分子與分子之間的作用情況，
以模擬可能的結合結構。利用 MVD 內建的偵測活性中心工具
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(detect cavities)，透過 DrTS 與模板的結構疊合，將嵌合的範圍設立 在模板的活性中心周圍，進行 100 次嵌合的模擬，其結果藉由 MVD 內建的均方根偏差 (root mean square deviation，rmsd) 與結合能 (binding energy) 來計算排序。並利用 MVD 內建的側鏈最適化 (sidechain minimization) 進行突變胺基酸的能量最適化。
三、 DrTS 蛋白質工程 1. DrTS 基因重組質體
本實驗所使用的 TS 為陳俊傑學長由耐輻射奇異球菌 (Deinococcus radiodurance) 選殖出來 (Wang et al., 2007)，接入 pET-23a(+) 質體內並送入 Escherichia coli (E.coli) 品系 BL21(DE3) 進行表達，並在胺基酸序列 C 端接上 6 個 Histidine-tag 方便之後使 用陰離子交換樹脂 Ni2+ resin 進行基因表達後的蛋白質純化。
pET-23a(+) 原有 3666 bps，並帶有 T7 promoter、T7 terminator、
Ampicillin 抗性基因與 multiple cloning site。DrTS 基因插入在 EcoRI 與 NdeI 的切位中間，整個質體大小為 5287 bps。
2. 宿主菌株與培養基的選擇
選取 E.coli 品系 DH5α 或 BL21(DE3) 做為宿主細胞，DH5α 用 以複製大量質體 DNA；BL21(DE3) 藉由 T7 RNA polymerase 啟動蛋 白質大量表達，適合用來做蛋白質表達與純化相關實驗。由於
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pET-23a(+) 質體具有 Ampicillin 抗性基因，因此具有 Ampicillin 之抗 性，故選用的培養基為 LB medium (1 L 含有 10 g 的 bio-tryptone、5 g 的 yeast extract、10 g 的 NaCl)，並搭配 Ampicillin (100 μg/mL)。
3. 質體 DNA 製備
將帶有 pET-23a(+)-DrTS 的 DH5α 接種到 3 mL LB(含有 100 μg/mL Ampicillin) medium 中，隔夜培養，離心 3000 rpm、10 分鐘，
除去上清液留下沉澱菌體，操作 Mini PlusTM Plasmid DNA Extraction System Kit (VIOGENE，Cat#GF2002)，以抽取質體 DNA。
4. DNA 之定量與電泳
22 (表二)。利用 Watcut 網站 (http://watcut.uwaterloo.ca/
watcut/watcut/template.php?act=silent_new) 的寧靜突變搜尋 (silent mutation scanning) 來設計新限制切位但不改變蛋白質的胺基酸序列，
23
使用。
5.4 點突變 PCR 溶液
點突變 PCR 反應溶液是根據 QuickChange Osite-Directed Mutagenesis kit 中的方法修改而來，加入的量及組成如下：
Components Volume (μL)
故選擇具有校正功能之聚合酶 (Pfu DNA polymerase)。
5.5 點突變 PCR 反應
點突變之 PCR 反應溫度是根據 QuickChange Osite-Directed Mutagenesis kit 中的方法來調整其反應 denature、annealing 及
extension 的溫度與時間，extension 時間隨著質體長度增加而加長，1 Kb 需 2 分鐘，PCR 流程見附錄九。反應結束後以瓊脂電泳膠片進行 產物分析確認 DNA 片段大小與 pET-23a(+)-DrTS 大小相同，為 5.2
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Kb。
5.6 DpnI 剪切
為了避免未突變的 ds DNA template 影響轉型時的效率，因此加 入 0.5μL DpnI，於 37℃ 作用 4 小時，將已甲基化之 ds DNA template pET-23a(+)-DrTS 進行剪切，降低模板 DNA 片段經轉型而產生的背 景值，以提高突變 DNA 突變株的突變機率。
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2. E.coli 轉型 (transformation)
將質體 DNA 與勝任細胞混合均勻，冰浴 30 分鐘，再以 42℃ 熱 破菌後離心 (12,000 rpm、10 min)，取上清液跑 SDS-PAGE，並於 marker 顯示約 62 kDa 位置有一個主要 band，即為誘導出來之
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去除上清液，並將菌體重新懸浮於 10 mL sonication lysis solution (100 mM NaCl、1 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、pH 7.4)，以 misonic sonicator (機型 XL-2000) 進行超音波震盪，震盪時置於冰上，每震盪 15 秒就 可以利用固定化金屬親和性層析法 (Immobilized Metal Affinity
Chromatography，IMAC) 純化，其條件如下：1mL His-tag resin (GE Healthcare Ni Sepharose 6 Fast Flow)，先以 10mL binding buffer (20 mM sodium-phosphate buffer pH 7.4、0.5 M NaCl、20 mM imidazole) 平衡管住，加入蛋白質粗萃取液 5 mL，再以 10 mL binding buffer 洗
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去雜蛋白，最後加入 10 mL elution buffer (20 mM sodium phosphate buffer、0.5 M NaCl、0.5 mM imidazole、pH 7.4)，將目標蛋白從管柱 沖離下來，並收集具有目標蛋白的部分，利用濃縮離心管以 20 mM sodium-phosphate buffer pH 7.4 進行濃縮透析，以 4℃、10,000 rpm 離 心 10 分鐘，去除廢液，重複濃縮透析的動作約五次。透析後將酵素 液分裝至微量離心管中，置於 -20℃ 保存。
3. 高效能 96 孔盤型式蛋白質純化與透析 3.1 高效能 96 孔盤型式蛋白質純化
將深孔 96 孔盤每個孔內加入 50 μL FastBreakTM cell lysis reagent (Promega，Cat#RV8573)，放於培養箱中以 220 rpm 震盪 20 分鐘，
再以 3700 rpm 離心 10 分鐘，取上清液 450 μL 至另一個深孔 96 孔 盤中，加入 50 μL His-tag resin，置於培養箱中以 150 rpm 震盪 10 分 鐘使 DrTS 附著於 resin 上，再將上清液與 resin 混合物加入 filtration plate (Promega， Cat#V3680)，流洗 1 分鐘後，離心 2000 rpm、15 秒 來移除雜蛋白，再加入 2 mL binding buffer，流洗 1 分鐘來移除雜蛋 白，之後離心 2000 rpm 共 15 秒來移除 binding buffer，將 filtration Plate 置於 collection plate 上，並加入 100 μL elution buffer 於
filtration plate 的孔內，放在搖晃台上搖晃 10 分鐘使 DrTS 與 resin 脫離，再離心 2000 rpm 共 15 秒來收集純化後的 DrTS。
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3.2 高效能 96 孔盤型式蛋白質去鹽
將純化後的 100 μL DrTS 蛋白質加至去鹽的 96 孔盤 (PD MultiTrap G-25)，離心 2000 rpm 共 3分鐘來收集去鹽後 的 DrTS。
(a) 40% (w/v) acrylamide：ACRYL/BIS = 37.5：1 solution (Bioshop，
Cat#BIS001)。
(b) Ammonium persulphate (APS)：10% (w/v)solution。
(c) SDS solution：配置 10% (w/v) 溶液保存於室溫。
(d) Stacking gel buffer：配置 0.5 M Tris-HCl 溶液，pH 6.8。
(e) Resolving gel buffer：配置 1.5 M Tris-HCl 溶液，pH 8.8。
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(f) Tris-glycine electrophoresis buffer：含 0.025 M Tris、0.192 M glycine 與 0.1% SDS，pH 8.3。
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(a) 40% (w/v) acrylamide：ACRYL/BIS=37.5：1 solution (b) 25.6% β-mercaptoethanol
(c) 10% SDS stock
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2. 蛋白質定量
使用 5 倍稀釋 (Bio-Rad，Cat#500-0006) protein assay dye reagent (200 μL) 與不同濃度的標準品 BSA (0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL) (10 μL) 混和於 96 孔盤內，使用 ELISA (Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay) reader (BioTek uQuant) 測定波長 595 nm 吸光 值，製作出標準曲線，再使用同樣的條件測定樣品，代入標準曲線公 式中即可求出蛋白質濃度。
七、 酵素活性分析
1. TS 活性分析－HPLC (High-performance liquid chromatography) 取 5 μg DrTS (由濃度 0.25 mg/mL 的 DrTS 取 20 μL)，添加於 125 mM 麥芽糖 (SIGMA，Cat#M5885) (在 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 中)，反應於 20℃ 與 40℃ 以及不同的反應時間 (0、2、
4、6、8、10、24、30 小時) 後，以聚合酶連鎖反應器於 95℃ 反應 10 分鐘終止酵素反應。而後將樣品以 13 mm NYLON 0.22 μm syringe filter (membrane solutions) 過濾，取 20 μL 的樣品以 HPLC；管柱：
SUGAR SZ5532；管柱恆溫箱：60℃；流速：1 mL/min；偵測器：RI 2000 Refractive Index detector；幫浦：SFD 2100 Quaternary gradient pump；溶劑為 acetonitriled：ddH2O：formic acid = 75:25:1；分析時 間：15 min，進行酵素反應後的醣類分析 (HPLC 知詳細操作及分析
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2. TS 活性分析－Maltase-coupled TS assay
取 5 μg DrTS，與 125 mM 麥芽糖(在 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 中) 混合反應於 96 孔盤內，並以聚合酶連鎖反應器於 20℃ 反應 30 分鐘，接著反應 95℃、10 分鐘以中止 DrTS 反應。
取 10 μL 反應後樣品與 70 μL 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 與 20 μL maltase (1 Unit，SIGMA Cat#G0660) 於 96 孔盤內於 37
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℃ 下反應 7 小時，同時取 125mM 麥芽糖無酵素進行同樣的反應做 為控制組。將此溶液稀釋 50 倍取 50 μL 加入 100 μL Glucose assay reagent (SIGMA，Cat#G3660 與 SIGMA，Cat#D2679) 於 37℃ 下反 應 30 分鐘，最後加入 100 μL、12 N H2SO4 來呈色，再將此 96 孔盤 放入 ELISA reader 讀取 540 nm 吸光值，代入由葡萄糖標準品所繪製 的標準曲線公式中，乘回稀釋倍數，將每一個樣品中的葡萄糖量與標 準品的葡萄糖量相減，差值即為海藻糖的量。而此利用 maltase 進行 TS 活性測定的方法即為 Maltase-coupled TS assay。
葡萄糖之標準曲線：先製備 1 mg/mL 葡萄糖溶液，再分別稀釋 成 12.5、25、50、100、150、200 μg/mL 等濃度，取不同濃度葡萄糖 標準品 50 μL 加入 100 μL Glucose assay reagent，於 37℃ 下反應 30 分鐘，最後加入 100 μL、12 N H2SO4 來呈色，再將此 96 孔盤放入 ELISA reader 讀取 540 nm 吸光值，做為葡萄糖標準品以求其標準曲 線。
八、 Glucose isomerase(GI)-coupled TS 1. 葡萄糖或果糖對 DrTS 活性影響
取 5 μg DrTS 於 125 mM 麥芽糖並混合 (0、20、40、60、80、100、
120 mM) 葡萄糖或果糖 (SIGMA，Cat#F3510) (在 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 中) 在 20℃ 和 40℃ 反應 24 小時，並以聚合
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3. GI-coupled TS
取 20 μg GI 與 5 μg DrTS 於 125 mM 麥芽糖 (在 20 mM sodium [validoxylamine A (VAA) (自製) (0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12 mM)、validamycin A (VA) (Duchefa，Cat#V0170) (0、0.02、0.04、0.06、
0.08、0.1、0.12 mM)、kanamycin A (Acroscat，Cat #BP906-5) (0、20、
40、60、80、100、120 mM)、acarbose (SIGMA，Cat #A8980) (0、20、
40、60、80、100、120 mM)、azactidine (Acros，Cat#22662) (0、20、
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40、60、80、100、120 mM)、lactose (Acros，Cat#36889) (0、20、40、
60、80、100、120 mM)、lactulose (Fluka，Cat#61360) (0、20、40、
60、80、100、120 mM) 或 isomaltulose (SIGMA，Cat #P2007) (0、20、
40、60、80、100、120 mM)] 反應於 20℃、24 小時，並以聚合酶連 鎖反應器於 95℃、10 分鐘以中止酵素反應，產物分析以 HPLC 定 量。
十、 利用酵素水解或酸水解生產 validoxylamine A (VAA)
十、 利用酵素水解或酸水解生產 validoxylamine A (VAA)