本實驗所使用的 TS 為陳俊傑學長由耐輻射奇異球菌 (Deinococcus radiodurance) 選殖出來 (Wang et al., 2007)，接入 pET-23a(+) 質體內並送入 Escherichia coli (E.coli) 品系 BL21(DE3) 進行表達，並在胺基酸序列 C 端接上 6 個 Histidine-tag 方便之後使 用陰離子交換樹脂 Ni2+ resin 進行基因表達後的蛋白質純化。
pET-23a(+) 原有 3666 bps，並帶有 T7 promoter、T7 terminator、
Ampicillin 抗性基因與 multiple cloning site。DrTS 基因插入在 EcoRI 與 NdeI 的切位中間，整個質體大小為 5287 bps。
2. 宿主菌株與培養基的選擇
選取 E.coli 品系 DH5α 或 BL21(DE3) 做為宿主細胞，DH5α 用 以複製大量質體 DNA；BL21(DE3) 藉由 T7 RNA polymerase 啟動蛋 白質大量表達，適合用來做蛋白質表達與純化相關實驗。由於
21
pET-23a(+) 質體具有 Ampicillin 抗性基因，因此具有 Ampicillin 之抗 性，故選用的培養基為 LB medium (1 L 含有 10 g 的 bio-tryptone、5 g 的 yeast extract、10 g 的 NaCl)，並搭配 Ampicillin (100 μg/mL)。
3. 質體 DNA 製備
將帶有 pET-23a(+)-DrTS 的 DH5α 接種到 3 mL LB(含有 100 μg/mL Ampicillin) medium 中，隔夜培養，離心 3000 rpm、10 分鐘，
除去上清液留下沉澱菌體，操作 Mini PlusTM Plasmid DNA Extraction System Kit (VIOGENE，Cat#GF2002)，以抽取質體 DNA。
4. DNA 之定量與電泳
22 (表二)。利用 Watcut 網站 (http://watcut.uwaterloo.ca/
watcut/watcut/template.php?act=silent_new) 的寧靜突變搜尋 (silent mutation scanning) 來設計新限制切位但不改變蛋白質的胺基酸序列，
23
使用。
5.4 點突變 PCR 溶液
點突變 PCR 反應溶液是根據 QuickChange Osite-Directed Mutagenesis kit 中的方法修改而來，加入的量及組成如下：
Components Volume (μL)
故選擇具有校正功能之聚合酶 (Pfu DNA polymerase)。
5.5 點突變 PCR 反應
點突變之 PCR 反應溫度是根據 QuickChange Osite-Directed Mutagenesis kit 中的方法來調整其反應 denature、annealing 及
extension 的溫度與時間，extension 時間隨著質體長度增加而加長，1 Kb 需 2 分鐘，PCR 流程見附錄九。反應結束後以瓊脂電泳膠片進行 產物分析確認 DNA 片段大小與 pET-23a(+)-DrTS 大小相同，為 5.2
24
Kb。
5.6 DpnI 剪切
為了避免未突變的 ds DNA template 影響轉型時的效率，因此加 入 0.5μL DpnI，於 37℃ 作用 4 小時，將已甲基化之 ds DNA template pET-23a(+)-DrTS 進行剪切，降低模板 DNA 片段經轉型而產生的背 景值，以提高突變 DNA 突變株的突變機率。
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2. E.coli 轉型 (transformation)
將質體 DNA 與勝任細胞混合均勻，冰浴 30 分鐘，再以 42℃ 熱 破菌後離心 (12,000 rpm、10 min)，取上清液跑 SDS-PAGE，並於 marker 顯示約 62 kDa 位置有一個主要 band，即為誘導出來之
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去除上清液，並將菌體重新懸浮於 10 mL sonication lysis solution (100 mM NaCl、1 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、pH 7.4)，以 misonic sonicator (機型 XL-2000) 進行超音波震盪，震盪時置於冰上，每震盪 15 秒就 可以利用固定化金屬親和性層析法 (Immobilized Metal Affinity
Chromatography，IMAC) 純化，其條件如下：1mL His-tag resin (GE Healthcare Ni Sepharose 6 Fast Flow)，先以 10mL binding buffer (20 mM sodium-phosphate buffer pH 7.4、0.5 M NaCl、20 mM imidazole) 平衡管住，加入蛋白質粗萃取液 5 mL，再以 10 mL binding buffer 洗
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去雜蛋白，最後加入 10 mL elution buffer (20 mM sodium phosphate buffer、0.5 M NaCl、0.5 mM imidazole、pH 7.4)，將目標蛋白從管柱 沖離下來，並收集具有目標蛋白的部分，利用濃縮離心管以 20 mM sodium-phosphate buffer pH 7.4 進行濃縮透析，以 4℃、10,000 rpm 離 心 10 分鐘，去除廢液，重複濃縮透析的動作約五次。透析後將酵素 液分裝至微量離心管中，置於 -20℃ 保存。
3. 高效能 96 孔盤型式蛋白質純化與透析 3.1 高效能 96 孔盤型式蛋白質純化
將深孔 96 孔盤每個孔內加入 50 μL FastBreakTM cell lysis reagent (Promega，Cat#RV8573)，放於培養箱中以 220 rpm 震盪 20 分鐘，
再以 3700 rpm 離心 10 分鐘，取上清液 450 μL 至另一個深孔 96 孔 盤中，加入 50 μL His-tag resin，置於培養箱中以 150 rpm 震盪 10 分 鐘使 DrTS 附著於 resin 上，再將上清液與 resin 混合物加入 filtration plate (Promega， Cat#V3680)，流洗 1 分鐘後，離心 2000 rpm、15 秒 來移除雜蛋白，再加入 2 mL binding buffer，流洗 1 分鐘來移除雜蛋 白，之後離心 2000 rpm 共 15 秒來移除 binding buffer，將 filtration Plate 置於 collection plate 上，並加入 100 μL elution buffer 於
filtration plate 的孔內，放在搖晃台上搖晃 10 分鐘使 DrTS 與 resin 脫離，再離心 2000 rpm 共 15 秒來收集純化後的 DrTS。
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3.2 高效能 96 孔盤型式蛋白質去鹽
將純化後的 100 μL DrTS 蛋白質加至去鹽的 96 孔盤 (PD MultiTrap G-25)，離心 2000 rpm 共 3分鐘來收集去鹽後 的 DrTS。
(a) 40% (w/v) acrylamide：ACRYL/BIS = 37.5：1 solution (Bioshop，
Cat#BIS001)。
(b) Ammonium persulphate (APS)：10% (w/v)solution。
(c) SDS solution：配置 10% (w/v) 溶液保存於室溫。
(d) Stacking gel buffer：配置 0.5 M Tris-HCl 溶液，pH 6.8。
(e) Resolving gel buffer：配置 1.5 M Tris-HCl 溶液，pH 8.8。
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(f) Tris-glycine electrophoresis buffer：含 0.025 M Tris、0.192 M glycine 與 0.1% SDS，pH 8.3。
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(a) 40% (w/v) acrylamide：ACRYL/BIS=37.5：1 solution (b) 25.6% β-mercaptoethanol
(c) 10% SDS stock
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2. 蛋白質定量
使用 5 倍稀釋 (Bio-Rad，Cat#500-0006) protein assay dye reagent (200 μL) 與不同濃度的標準品 BSA (0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL) (10 μL) 混和於 96 孔盤內，使用 ELISA (Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay) reader (BioTek uQuant) 測定波長 595 nm 吸光 值，製作出標準曲線，再使用同樣的條件測定樣品，代入標準曲線公 式中即可求出蛋白質濃度。
七、 酵素活性分析
1. TS 活性分析－HPLC (High-performance liquid chromatography) 取 5 μg DrTS (由濃度 0.25 mg/mL 的 DrTS 取 20 μL)，添加於 125 mM 麥芽糖 (SIGMA，Cat#M5885) (在 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 中)，反應於 20℃ 與 40℃ 以及不同的反應時間 (0、2、
4、6、8、10、24、30 小時) 後，以聚合酶連鎖反應器於 95℃ 反應 10 分鐘終止酵素反應。而後將樣品以 13 mm NYLON 0.22 μm syringe filter (membrane solutions) 過濾，取 20 μL 的樣品以 HPLC；管柱：
SUGAR SZ5532；管柱恆溫箱：60℃；流速：1 mL/min；偵測器：RI 2000 Refractive Index detector；幫浦：SFD 2100 Quaternary gradient pump；溶劑為 acetonitriled：ddH2O：formic acid = 75:25:1；分析時 間：15 min，進行酵素反應後的醣類分析 (HPLC 知詳細操作及分析
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2. TS 活性分析－Maltase-coupled TS assay
取 5 μg DrTS，與 125 mM 麥芽糖(在 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 中) 混合反應於 96 孔盤內，並以聚合酶連鎖反應器於 20℃ 反應 30 分鐘，接著反應 95℃、10 分鐘以中止 DrTS 反應。
取 10 μL 反應後樣品與 70 μL 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 與 20 μL maltase (1 Unit，SIGMA Cat#G0660) 於 96 孔盤內於 37
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℃ 下反應 7 小時，同時取 125mM 麥芽糖無酵素進行同樣的反應做 為控制組。將此溶液稀釋 50 倍取 50 μL 加入 100 μL Glucose assay reagent (SIGMA，Cat#G3660 與 SIGMA，Cat#D2679) 於 37℃ 下反 應 30 分鐘，最後加入 100 μL、12 N H2SO4 來呈色，再將此 96 孔盤 放入 ELISA reader 讀取 540 nm 吸光值，代入由葡萄糖標準品所繪製 的標準曲線公式中，乘回稀釋倍數，將每一個樣品中的葡萄糖量與標 準品的葡萄糖量相減，差值即為海藻糖的量。而此利用 maltase 進行 TS 活性測定的方法即為 Maltase-coupled TS assay。
葡萄糖之標準曲線：先製備 1 mg/mL 葡萄糖溶液，再分別稀釋 成 12.5、25、50、100、150、200 μg/mL 等濃度，取不同濃度葡萄糖 標準品 50 μL 加入 100 μL Glucose assay reagent，於 37℃ 下反應 30 分鐘，最後加入 100 μL、12 N H2SO4 來呈色，再將此 96 孔盤放入 ELISA reader 讀取 540 nm 吸光值，做為葡萄糖標準品以求其標準曲 線。
八、 Glucose isomerase(GI)-coupled TS 1. 葡萄糖或果糖對 DrTS 活性影響
取 5 μg DrTS 於 125 mM 麥芽糖並混合 (0、20、40、60、80、100、
120 mM) 葡萄糖或果糖 (SIGMA，Cat#F3510) (在 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 中) 在 20℃ 和 40℃ 反應 24 小時，並以聚合
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3. GI-coupled TS
取 20 μg GI 與 5 μg DrTS 於 125 mM 麥芽糖 (在 20 mM sodium [validoxylamine A (VAA) (自製) (0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12 mM)、validamycin A (VA) (Duchefa，Cat#V0170) (0、0.02、0.04、0.06、
0.08、0.1、0.12 mM)、kanamycin A (Acroscat，Cat #BP906-5) (0、20、
40、60、80、100、120 mM)、acarbose (SIGMA，Cat #A8980) (0、20、
40、60、80、100、120 mM)、azactidine (Acros，Cat#22662) (0、20、
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40、60、80、100、120 mM)、lactose (Acros，Cat#36889) (0、20、40、
60、80、100、120 mM)、lactulose (Fluka，Cat#61360) (0、20、40、
60、80、100、120 mM) 或 isomaltulose (SIGMA，Cat #P2007) (0、20、
40、60、80、100、120 mM)] 反應於 20℃、24 小時，並以聚合酶連 鎖反應器於 95℃、10 分鐘以中止酵素反應，產物分析以 HPLC 定 量。
十、 利用酵素水解或酸水解生產 validoxylamine A (VAA) 1. 酵素水解
(a) Pichia pastoris β-glucosidase (medium) 水解
於 100 μL 的總反應體積中，取 80 μL 的 β-glucosidase (medium)
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將水解樣品以 13 mm NYLON 0.22 μm syringe filter (membrane solutions) 過濾，取 10 μL 的樣品以 HPLC；管柱：分析級逆相層析管 柱 (Syncronis aQ)；管柱恆溫箱：30℃；流速：1 mL/min；偵測器：
光二極體陣列式偵測器 (L-2455)；幫浦：SFD 2100 Quaternary gradient pump；溶劑為 methanol：ddH2O：disodium hydrogen phosphate = 2.5 : 96.5 : 1；分析時間：15 min；波長：210 nm，進行水解反應後的產物 分析。依時間順序分別為 VAA (約 5:10 出現) 與 VA (約 7:00 出現)。
在酸水解時由於 pH 值的減少，因此反應物及產物出現的訊號鋒時間 提早，依時間順序分別為 VAA (約 3:50 出現) 與 VA (約 4:50 出現)。
4. VAA 純化
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將分析後的 10 mL 酸水解樣品以 7 g Ba(OH)2 中和至 pH 5-6 並 離心去沉澱物後過濾，之後將 10 mL 樣品以低流速通過 2 mL 陽離子 樹脂管柱 (Aberlite ® IR-120 [H+])，並以 10 mL、1M NH4OH 沖洗下來。
將沖洗的樣品濃縮成 1 mL 後，以低流速通過 2mL 陰離子樹脂管柱 (Dowex® 1X2 [OH–])，並以 10 mL 二次去離子水沖洗下來，以進一步 的得到純化的 VAA，並利用冷凍乾燥濃縮機進行乾燥濃縮，可得到 白色結晶狀的 VAA。
5. 管柱再生與離子交換
原買入的陽離子樹脂 (Aberlite® IR-120) 帶著 Na+ 離子，利用樹 脂三倍體積的 1M HCl 以低流速通過樹脂，讓 H+ 離子競爭 Na+ 離子，
使得樹脂帶 H+ 離子，之後以二次去離子水平衡及保存樹脂。
原買入的陰離子樹脂 (Dowex® 1X2) 帶著 Cl- 離子，利用樹脂三 倍體積的 1M NaOH 以低流速通過樹脂，讓 OH– 離子競爭 Cl- 離子，
使得樹脂帶 OH– 離子，之後以二次去離子水平衡及保存樹脂。
38 有水解活性的水解酶 (hydrolase)，如：Halothermothrix Orenii
α-amylase、Bacillus cereus oligo-1,6-glucosidase 或 Deepest Sea
Bacteria α-glucosidase；另一類是具有異構化 (isomerizaton) 活性的蔗 糖異構酶 (sucrose isomerase，SI)，如：MutB (PDB entry: 1ZJA，
Pseudomonas mesoacidophila MX-45 trehalulose synthase)、SmuA (PDB entry: 3GBD，Protaminobacter isomaltulose synthase) 或 PalI (PDB entry: 1M53，Klebsiella sp LX3 isomaltulose synthase)。與 DrTS 胺基酸序列最相似的蛋白質為 SI 的 MutB，其胺基酸序列與 DrTS
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40 Thr154、Phe174 與 Gln254。
在 SI 中，只有一個催化的水分子 Wat4248 (MutB 編號) 會直接參 與水解反應 (Ravaud et al., 2007, 2009)，在 MutB 的結構中，有個親 水性的 Asn325 (MutB 編號，圖七) 會去結合這個催化的水分子。疊 合 DrTS 與 SI 的立體結構後，在 DrTS 的相同的位置上也有個親水
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N317A (AAC→GCG)、N317F (AAC→TTC)、N317L (AAC→CTG)、
R316G (CGC→GGC) 與 N253F (AAC→TTC)。
依據方法三.5. 進行點突變，並以自動核苷酸定序圖譜分析 (圖十 一)，定序結果與野生型 DrTS 基因比對，確認突變皆已完成，且並
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的量則是逐漸減少，取而代之的是果糖的生成量則是逐漸增加，反應 至 24 小時於 20℃ 與 40℃ 皆約 50% 的果糖生成 (圖二十五)。
4. GI-coupled DrTS
依據方法八.3. 進行 GI-coupled DrTS。隨著反應時間的增加，加 入有活性的 GI 會比加入已失活性的 GI 的其 DrTS 海藻糖生成量要
47 acarbose 的濃度增加，正逆反應的活性會逐漸減少。當 acarbose 增加 至 120 mM 時，正反應海藻糖轉化率會減少 16.2%，逆反應麥芽糖轉
melibiose 或 isomaltulose) 對 DrTS 的正逆反應活性影響
依據方法九進行海藻糖類似物對 DrTS 的正逆反應活性影響。隨
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著 azactidine、lactulose、lactose、sucrose、thiodiglucoside、melibiose 或 isomaltulose 的濃度增加，正逆反應的活性不受影響。
六、 利用酵素水解或酸水解生產 VAA 1. 水解實驗
(1) Pichia pastoris β-glucosidase (medium) 水解反應
依據方法十.1. 進行 Pichia pastoris β-glucosidase (medium) 水解 反應。隨著反應時間的增加，VA 訊號峰面積約 16%，並沒有隨著
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積的生成 (圖三十二 D)。
(5) H2SO4 水解反應
依據方法十.2. 進行 H2SO4 水解反應。反應至 20 分鐘，VA 被完 全作用，且約有 45% VAA 訊號峰面積的生成。
2. VAA 的純化
此後加入 Ba(OH)2 中和至 pH 5 後離心過濾，VAA 訊號峰面積並 沒有減少，此後將樣品通入 Aberlite ® IR-120 [H+] 管柱，發現所流出 的 flowthrough 其 VAA 只剩約 1/3 訊號峰面積，表示有約 2/3 訊號 峰面積的 VAA 被管柱抓住，此後利用 NH4OH 進行沖洗並濃縮後，
通入 Dowex ® 1X2 [OH–] 管柱並以二次去離子水進行沖洗能得到高 純度的 VAA (圖三十三)，此後利用冷凍乾燥濃縮機進行凍乾，可得 到約 0.1 g 的 VAA 白色粉末。
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isomaltulose) 及 α-1,1-鍵結的海藻酮糖 (α-D-glucopyranoside-1,1-D- fructofuranosyl，trehalulose)，會有微弱的水解活性產生副產物葡萄糖 與果糖 (D-fructose)。SI 的酵素結構之間是十分相似 (高達 80% 結構 疊合的一致性)，不同的菌種的 SI 其異麥芽酮糖與海藻酮糖的產物比 率也不相同。SmuA 與 PalI 主要催化生成 α-1,6-鍵結的異麥芽酮糖，
而 MutB 則主要催化生成 α-1,1-鍵結的海藻酮糖 (Ravaud et al., 2007, 2009; Zhang et al., 2003a)。
目前 MutB、SmuA 與 PalI 的酵素結構已經被發表了 (附錄十)。
目前 MutB、SmuA 與 PalI 的酵素結構已經被發表了 (附錄十)。