利用酵素工程技術提升海藻糖合成酶的酵素轉化效率

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 利用酵素工程技術提升海藻糖合成酶的酵素轉化效率 Improvement in the conversion rate of trehalose synthase by enzyme engineering. 研究生：曾信豪 Hsin-Hao Tseng. 指導教授：李冠群博士 Dr. Guan-Chiun Lee. 中華民國一○一年八月.

(2) 致謝時光飛逝，歲月如梭，轉眼間兩年的碩士班生涯即將邁入尾聲，未來即將踏上一個嶄新的旅程。在過去的日子裡，我遇到了許多人，正所謂「有緣千里來相會，無緣對面不相識。」，有了你們讓我的生活變得更美好，真的很感謝你們，因為有你們才會有現在的我。. 本論文可以順利完成，感謝李冠群老師、李振綱老師以及王玉麒老師細心的校閱，並提供寶貴的意見與指正，使本論文得以更臻完備。感謝李冠群老師這兩年的殷切指導與敦敦教誨，使我在學業及待人處事上受益良多，師恩浩大，銘記在心。. 感謝學樺學長在實驗上的指導與教導攀岩的技術，讓我能夠習得許多實驗技巧與獲得健壯的體魄，感謝亭君學姐兩年來的關心與照顧，讓我每天都能保持愉快的心情做研究。. 感謝曉蓉學姐、啟翔學長、紘綸學長、資陵學姐、欣宜學姐及欣嵐學姐在實驗上的協助與鼓勵，使我的研究能夠得到莫大的幫助，謝謝陪伴我兩年的胤榮，雖然常常與你鬥嘴，但其實我非常珍惜我們一起做實驗的時光，還有舒琇學妹、家鴻學妹及汶涵學妹，雖然常常被你們欺負與捉弄，但這讓實驗室增添許多歡樂的氣氛，也祝你們實驗能成功順利，另外感謝其他實驗室所有學長姐及同學們，因為認識了你們，讓我的人生能夠更加的精采!. 最後要感謝在研究所的生涯中一直支持我的家人，因為你們的支持與體諒，讓我能夠順利完成碩士的學業，並再一次感激我的恩師李冠群老師，謝謝您在研究上的教導與生活上的啟迪，最後將此論文獻給所有幫助過我的師長及朋友，謝謝你們。.

(3) 目錄表次......................................................................................................... viii 圖次........................................................................................................... ix 附錄........................................................................................................... xi 摘要.......................................................................................................... xii Abstrate....................................................................................................xv 壹、緒論....................................................................................................1 一、海藻糖的性質 ................................................................................1 二、海藻糖的應用 ................................................................................4 三、海藻糖的生合成路徑 ....................................................................6 四、海藻糖合成酶 (trehalose synthase，TS) 的介紹 .........................7 1. TS 的簡介 ........................................................................................7 2. TS 的海藻糖轉化率 ........................................................................8 3. TS 的副反應 ....................................................................................9 4. TS 推測的作用機制 ......................................................................10 5. 耐輻射奇異球菌海藻糖合成酶 (Deinococcus radiodurans trehalose synthase，DrTS) .................................................................13 i.

(4) 五、蛋白質結構模擬 ..........................................................................13 1. 蛋白質三級結構模擬 ....................................................................13 2. 蛋白質嵌合模擬 ............................................................................15 六、蛋白質工程 ..................................................................................15 貳、研究目的.......................................................................................... 17 參、材料與方法...................................................................................... 19 一、模擬 DrTS 蛋白質三級結構.......................................................19 二、模擬 DrTS 與麥芽糖的複合物立體結構...................................19 三、 DrTS 蛋白質工程 ........................................................................20 1. DrTS 基因重組質體 ......................................................................20 2. 宿主菌株與培養基的選擇 ............................................................20 3. 質體 DNA 製備 .............................................................................21 4. DNA 之定量與電泳 ......................................................................21 5. 突變設計 ........................................................................................21 四、 DrTS 蛋白質表達 ........................................................................24 1. 勝任細胞 (competent cell) 的製備 ...............................................24 2. E.coli 轉型 (transformation) ..........................................................25 ii.

(5) 3. DrTS 蛋白質表達 ..........................................................................25 五、 DrTS 蛋白質純化 ........................................................................26 1. 蛋白質粗萃取液 ............................................................................26 2. 固定化金屬親和性層析法純化蛋白質 ........................................26 3. 高效能 96 孔盤型式蛋白質純化與透析......................................27 六、蛋白質分析 ..................................................................................28 1. 蛋白質電泳 ....................................................................................28 2. 蛋白質定量 ....................................................................................31 七、酵素活性分析 ..............................................................................31 1. TS 活性分析－HPLC (High-performance liquid chromatography)... ..............................................................................31 2. TS 活性分析－Maltase-coupled TS assay ....................................32 八、 Glucose isomerase (GI)-coupled TS .............................................33 1. 葡萄糖或果糖對 DrTS 活性影響 .................................................33 2. GI 活性分析 ...................................................................................34 3. GI-coupled TS ................................................................................34 九、 α-澱粉酶抑制劑或海藻糖類似物對 DrTS 正逆反應活性影響........................................................................................................... 34 iii.

(6) 十、利用酵素水解或酸水解生產 validoxylamine A (VAA)............35 1. 酵素水解 ........................................................................................35 2. 酸水解 ............................................................................................36 3. Validamycin A (VA) 與 VAA 分析 ..............................................36 4. VAA 純化 .......................................................................................36 5. 管柱再生與離子交換 ....................................................................37 肆、結果.................................................................................................. 38 一、模擬 DrTS 與麥芽糖的複合物立體結構...................................38 1. 胺基酸序列搜尋比對 ....................................................................38 2. 模擬 DrTS 的蛋白質三級結構 .....................................................38 3. DrTS 的受質結合位的預測 ..........................................................39 二、 DrTS 的蛋白質工程 ....................................................................41 1. DrTS 的點突變 ..............................................................................41 2. 野生型 DrTS 的轉化率分析 .........................................................42 3. 突變株 DrTS (N317A) 的轉化率分析 .........................................42 4. 突變株 DrTS (N317F) 的轉化率分析 ..........................................42 5. 突變株 DrTS (N317L) 的轉化率分析..........................................43 iv.

(7) 6. 突變株 DrTS (R316G) 的轉化率分析 .........................................43 7. 突變株 DrTS (N253F) 的轉化率分析 ..........................................44 8. 野生型及各突變株 DrTS 的比活性比較.....................................44 9. 定點飽和突變株 DrTS (T154X) 的比活性分析..........................45 三、利用 GI-coupled TS 提升 DrTS 的海藻糖轉化率 ....................45 1. 葡萄糖對 DrTS 的活性影響 .........................................................45 2. 果糖對 DrTS 的活性影響 .............................................................45 3. GI 的活性分析 ...............................................................................45 4. GI-coupled DrTS ............................................................................46 四、抑制 DrTS 逆反應以提升海藻糖轉化率...................................46 1. DrTS 的逆反應轉化率分析 ..........................................................46 2. VA 對 DrTS 的正逆反應活性的影響..........................................46 3. Kanamycin A 對 DrTS 的正逆反應活性影響 .............................47 4. Acarbose 對 DrTS 的正逆反應活性影響 ....................................47 5. VAA 對 DrTS 的正逆反應活性影響 ...........................................47. v.

(8) 6. 海藻糖類似物 (azactidine、lactulose、lactose、sucrose、 thiodiglucoside、melibiose 或 isomaltulose) 對 DrTS 的正逆反應活性影響... .............................................................................................47 六、利用酵素水解或酸水解生產 VAA ............................................48 1. 水解實驗 ........................................................................................48 2. VAA 的純化 ..................................................................................49 伍、討論.................................................................................................. 50 一、模擬 DrTS 與麥芽糖的複合物立體結構...................................50 1. 模擬 DrTS 的蛋白質三級結構 .....................................................50 2. DrTS 受質結合位的預測 ..............................................................52 二、 DrTS 的蛋白質工程 ....................................................................54 1. 野生型 DrTS 的轉化率分析 .........................................................54 2. 突變株 DrTS (N317A、N317F 與 N317L) 的轉化率分析 ........54 3. 突變株 DrTS (R316G) 的轉化率分析 .........................................55 4. 突變株 DrTS (N253F) 的轉化率分析 ..........................................55 5. 突變株 DrTS (T154F) ....................................................................56 三、利用 GI-coupled TS 提升 DrTS 的海藻糖轉化率 ....................56 vi.

(9) 1. 葡萄糖或果糖對 DrTS 的活性影響 .............................................57 2. GI-coupled TS ................................................................................57 四、抑制 DrTS 逆反應以提升海藻糖轉化率...................................58 1. DrTS 的逆反應轉化率分析 ..........................................................58 2. α-澱粉酶抑制劑或海藻糖類似物對 DrTS 正逆反應活性的影響........... .............................................................................................59 五、利用酵素水解或酸水解生產 VAA ............................................60 1. 酵素水解 ........................................................................................60 2. 酸水解 ............................................................................................60 陸、參考文獻.......................................................................................... 62. vii.

(10) 表次表一、定點飽和突變的引子設計 ..........................................................67 表二、定位突變的引子設計 ..................................................................68 表三、PDB 資料庫中 DrTS 的胺基酸序列搜尋比對..........................69 表四、比較 SI 與 DrTS 的功能性胺基酸.............................................70. viii.

(11) 圖次圖一、模擬 DrTS 的蛋白質三級結構 ...................................................71 圖二、模擬 DrTS 與麥芽糖的複合物立體結構 ...................................72 圖三、DrTS 受質結合位的預測 ............................................................73 圖四、DrTS 與 SI 的活性中心結構比對 ..............................................74 圖五、DrTS、MutB、SmuA 與 PalI 的胺基酸序列及二級結構比對 ...................................................................................................................75 圖六、不同種 TS 的胺基酸序列比對 ...................................................76 圖七、MutB 與 DrTS 的催化水分子結合位 ........................................77 圖八、突變 Asn317 成疏水性胺基酸 Ala、Phe 或 Leu......................78 圖九、MutB 與 DrTS 的芳香族胺基酸 Phe 夾子構造........................79 圖十、突變 Asn253 成芳香族的胺基酸 Phe ........................................80 圖十一、突變株 DrTS 的 DNA 定序....................................................81 圖十二、定位突變實驗的蛋白質純化 ..................................................82 圖十三、野生型 DrTS 的轉化率分析 ...................................................83 圖十四、突變株 DrTS (N317A) 的轉化率分析 ...................................84 圖十五、突變株 DrTS (N317F) 的轉化率分析 ....................................85 圖十六、突變株 DrTS (N317L) 的轉化率分析 ....................................86 圖十七、突變株 DrTS (R316G) 的轉化率分析....................................87 ix.

(12) 圖十八、突變株 DrTS (N253F) 的轉化率分析 ....................................88 圖十九、野生型與突變株 DrTS 的轉化率比較 ...................................89 圖二十、野生型與突變株 DrTS 的比活性比較 ...................................90 圖二十一、定點飽和突變株 DrTS (T154X) 的比活性分析 ................91 圖二十二、突變 Thr154 成芳香族的胺基酸 Phe .................................92 圖二十三、葡萄糖對 DrTS 的活性影響 ...............................................93 圖二十四、果糖對 DrTS 的活性影響 ...................................................94 圖二十五、GI 的活性分析 .....................................................................95 圖二十六、GI-coupled DrTS ..................................................................96 圖二十七、DrTS 的逆反應轉化率分析 ................................................97 圖二十八、VA 對 DrTS 的正逆反應活性影響 ....................................98 圖二十九、Kanamycin A 對 DrTS 的正逆反應活性影響 ...................99 圖三十、Acarbose 對 DrTS 的正逆反應活性影響 ............................100 圖三十一、VAA 對 DrTS 的正逆反應活性影響 ...............................101 圖三十二、酵素水解生產 VAA ...........................................................103 圖三十三、酸水解生產 VAA 及純化..................................................104. x.

(13) 附錄附錄一、海藻糖 (α,α-1,1- trehalose) 結構圖 .......................................105 附錄二、海藻糖的特性 ........................................................................106 附錄三、海藻糖的生合成途徑 ............................................................107 附錄四、已定性的海藻糖合成酶 ........................................................108 附錄五、海藻糖合成酶與 α-澱粉酶家族所具有的四個保守區及其催化和受質結合位.........................................................................................109 附錄六、α-澱粉酶的三級結構 ............................................................. 110 附錄七、α-澱粉酶的反應機制 ............................................................. 111 附錄八、推測的 TS 的作用機制 ......................................................... 112 附錄九、PCR 流程................................................................................ 113 附錄十、MutB 的三級結構 .................................................................. 116 附錄十一、不同種 SI 的產物專一性及水解活性 .............................. 117 附錄十二、VAA、VA 與海藻糖的結構.............................................. 118. xi.

(14) 摘要海藻糖 (trehalose) 存在於許多生物體當中，除了作為能量的儲存形式之外，在脫水等逆境時穩定蛋白質和生物膜的結構，保護細胞免於環境壓力。在食品、化妝、醫藥業上都有廣泛的應用。海藻糖合成酶 (trehalose synthase，TS) 為可逆催化麥芽糖分子內鍵結轉化成海藻糖的酵素，屬於一種麥芽糖異構酶，同時，TS 亦有水解麥芽糖產生葡萄糖的副反應，為海藻糖的生合成路徑之一。本研究在提升 TS 的轉化效率，並以 Deinococcus radiodurans trehalose synthase (DrTS) 為研究對象，利用已知結構之 SI (sucrose isomerase) 為模板模擬出 DrTS 立體三級結構。結構顯示，DrTS 的整體結構與一般的 α-amylase 的結構相似，在中央擁有一個催化的區域，由 (β/α)8 的桶狀結構所組成，以及一個富有 loop 的子區域和兩個反向平行的 β-sheet 區域。藉由將麥芽糖偶合來模擬 DrTS 與受質結合的立體結構，發現距離麥芽糖 5 Å 的周圍有 21 個胺基酸會與受質結合。從 DrTS 與 SI 的胺基酸序列與立體結構的比對，發現這 21 個胺基酸當中有 9 個是不相同的，推測這 9 個胺基酸可能造成 DrTS 與 SI 功能上有差異的原因，再與其他 TS 的胺基酸比對後，發現這 9 個不同的胺基酸中，有 3 個胺基酸不同於其他 TS，分別為 Thr154、Phe174 和 Gln254。推測這 3 個胺基酸位置可能是決定不同的 TS 具有不同生化性質或轉化率的原因， xii.

(15) 本研究利用定點飽和突變與高效率純化暨活性篩選系統針此 3 個胺基酸進行突變，篩選出高海藻糖轉化率突變種，其中在 Thr154 突變庫當中，挑選出兩株活性大於野生型三倍者，經 DNA 定序顯示其 Thr154 皆被取代為 Phe。此外，Asn317 被預測可能與參與水解反應的水分子結合，而在 316 位置 DrTS 具有一種與其他 SI 明顯不保守的胺基酸 Arg，推測可能也會影響與水分子的結合，以及 Asn253 被預測可能藉由阻礙活性中心的開口處保護中間產物，避免水分子進入催化中心造成水解。為了減少水解的副反應，因此將親水性的 Asn317 藉由定位突變取代成疏水性的 Phe、Leu 或 Ala，並將帶正電的 Arg316 藉由定位突變取代成不帶電性的 Gly，結果顯示 Asn317 突變成 Phe、Leu 或 Ala 以及 Arg316 突變成 Gly 雖然會使水解副反應減少，然而卻會造成酵素活性降低。將 Asn253 藉由定位突變取代成芳香族的 Phe，結果顯示 Asn253 突變成 Phe 會使水解副反應與酵素活性完全喪失。此外利用另兩種策略來改善 DrTS 轉化率。一種是偶合葡萄糖異構酶 (Glucose isomerase，GI)，將 TS 反應副產物葡萄糖轉化成果糖，來減少副產物的抑制效果，結果顯示偶合 GI 能提升 DrTS 在高溫的海藻糖轉化率約 4%。另一種方法是抑制 TS 的逆反應，藉由加入 α-葡萄糖苷酶抑制劑 (validoxylamine A、validamycin A、 kanamycin A、acarbose 或 azactidine) 或是海藻糖的類似物 (lactose、 xiii.

(16) lactulose 或 isomaltulose)。結果 kanamycin A 抑制逆反應比抑制正反應多 5% ，validoxylamine A、validamycin A 或 acarbose 對正逆反應的抑制程度相近，然而 azactidine、lactose、lactulose 或 isomaltulose 對 DrTS 的正逆反應沒有影響。以上結果可以提供從事 TS 之蛋白質工程的參考。關鍵字：海藻糖、海藻糖合成酶、分子模擬、突變、轉化率、蔗糖異構酶、葡萄糖異構酶、validoxylamine A. xiv.

(17) Abstrate Trehalose, a non-reducing disaccharide, existing in various organisms can serve as energy storage and as a protectant of protein and lipid against various stresses. It has become as an important compound in foods, cosmetics and pharmaceuticals industries. Trehalose synthase (TS) is one of the biosynthesis pathways of trehalose, which reversibly catalyzes the intramolecular transglucosylation (isomerization) of maltose to produce trehalose, also known as maltose isomerase, as well as the side reaction of irreversible hydrolysis of maltose to produce two glucose molecules. However, the structure as well as the enzymatic mechanism of TS has not been determined. Sucrose isomerase (SI) and TS have isomerase activity and belong to the same subfamily of the α-amylase family. Three-dimensional structures of three SIs have been determined. The tertiary structural model of Deinococcus radiodurans trehalose synthase (DrTS) which has been characterized as a cold-active enzyme was built using a SI structure as template. The overall DrTS structure is highly conserved with α-amylase family. It possesses a central catalytic domain formed by a (β/α)8-barrel structure, a loop rich subdomain and two antiparallel β-sheet domains. The DrTS-substrate complex model was also built by docking with its substrate maltose. 21 amino acid residues located in close contact with maltose within the 5 Å cut-off distance have been identified and may play important roles in substrate binding. By amino sequence and three-dimensional structure alignments with the SIs, nine of the 21 residues were identified as different from SIs and may play important roles in the TS function. Among these nine distinct residues, xv.

(18) Thr154, Phe174, and Gln254 are not conserved in the TS family from various species. To deduce the three residues are relative with biochemical properties and conversion rate of TS, site-specific saturation mutations of these residues were performed to screen for mutant enzymes which exhibit high isomerization activity. A high-throughput purification and assay system was developed to screen Thr154 random libraries, resulting that 2 coloies with higher activies than the wild type, showing 3-fold increased activity, DNA sequencing showed that Thr154 were altered to Phe. Furthermore, the Asn317 was predicted to interact with the water molecule which may participate in the hydrolysis side-reaction. The Arg316 may influence the catalytic water binding whereas it is non-identical in the SIs. The Asn253 was predicted to be able to prevent hydrolysis by blocking the entrance of the active site pocket. To reduce hydrolysis activity of the side reaction, the hydrophilic Asn317 were altered to hydrophobic Phe, Leu or Ala by site-directed mutagenesis. The non-identical and positively charged of Arg316 to nonpolar Gly may result in reducing hydrolysis side-reaction, and the Asn254 were altered to aromatic Phe.The results showed that the activities of N317A, N317F, N317L and R316G mutants were signicantly decreased, and N253F mutant led to a complete loss in activity. In addition, two approaches were also performed to improve the conversion rate of DrTS. One is coupling TS with glucose isomerase (GI) which converts and thus removes the side-reaction product glucose into fructose to reduce the product inhibition. The results indicated that the trehalose conversion rate of GI-coupled DrTS was enhanced. The other one is inhibiting the xvi.

(19) reversed. reaction. of. TS. by. adding. α-glucosidase. inhibitors. (validoxylamine A, validamycin A, kanamycin A, acarbose or azactidine), or trehalose analogs (lactose, lactulose or isomaltulose). The results indicated that both the forward and reversed reactions of DrTS were inhibited by validoxylamine A, validamycin A, kanamycin A and acarbose. However, azactidine, lactose, lactulose and isomaltulose almost had no inhibition effect on the forward and reversed reaction of DrTS. In general, the results provide feasible methods to improve the conversion rate of DrTS for industrial application of trehalose production. Keywords: trehalose, trehalose synthase, molecule modeling, mutation, conversion rate, sucrose isomerase, glucose isomerase, validoxylamine A. xvii.

(20) 壹、緒論一、海藻糖的性質海藻糖 (trehalose，α-D-glucopyranosyl α-D-glucopyranoside， C12H22O11，Mw = 342.31 Da) 由兩個葡萄糖 (D-glucose) 單糖，藉由 α,α-1,1-糖苷鍵結合形成的非還原性雙糖分子 (附錄一)，廣泛存在於自然界的生物體中，例如細菌、酵母菌、真菌、昆蟲、無脊椎動物以及一些植物中，對於生物體之主要功能在於幫助抵抗環境乾燥、寒冷、高溫、高鹽、輻射、高滲透壓等環境壓力 (Paul et al., 2008)。海藻糖有三種不同的異構物 (isomer) 分別為 α,α-1,1-、α,β-1,1-以及 β,β-1,1-等鍵結型式，在自然界存在最多的形式大多以 α,α-1,1-鍵結的海藻糖為主，其餘的異構物在自然界中的含量非常稀少且不具有生物功能 (Pan et al., 2004)。海藻糖水溶液的性質穩定，不易被酸所水解，且海藻糖吸濕值較低，即使在相對濕度 92% 環境時，其水分含量仍穩定地維持在 9.54%。海藻糖的熔點為 97℃，當溫度上升至 130℃ 時，海藻糖會融化並失去結晶水形成無水結晶體，最後無水海藻糖加熱至 203℃ 時融化 (附錄二) (Richards et al., 2002)。海藻糖最初由 H.A. Wiggers 於 1832 年從黑麥的麥角菌 (Claviceps purpurea) 中分離出來，發現將黑麥的麥角水溶液靜置一段 1.

(21) 時間後，在容器的內壁形成了無色、不具還原力及微甜的結晶，因而發現了海藻糖。1858 年 Mitscherlich 由菇類中分離出海藻糖，並將它命名為「mycose」。同年，Berthelot 由來自中東的一種昆蟲在樹葉上所分泌的殼 (cocoon-like shell)，其乾燥後被作為甜味劑 (此分泌物被稱作 trehalamanna)，此後 Berthelot 從中萃取出一種醣類，將它命名為 trehalique glucose 或「trehalose」 (Elbein et al., 2003; Richards et al., 2002)。海藻糖的甜度為蔗糖 (sucrose) 的 45%，並且相較於大部分的糖類，海藻糖對熱及 pH 值有較寬的穩定範圍 (附錄二)，也因此它是最穩定的糖類之一，它不易與胺基酸或蛋白質作用，因此可避免產生梅納反應 (maillard reaction；非酵素性褐變反應) (Higashiyama, 2002)。海藻糖在生物體中所扮演的角色很多，可以被用來當作一種能量儲存的形式，也是細胞進行生合成所需要的碳源之一，例如昆蟲體內的海藻糖可扮演血糖的角色，也是飛行時的能量來源，在昆蟲的血淋巴 (hemolymph) 當中，海藻糖含量佔 80〜89%，昆蟲的發育時期，海藻糖佔體內總碳水化合物約 20% (Elbein et al., 2003; Richards et al., 2002)。海藻糖的功能不僅可以幫助穩定細胞膜與蛋白質，也可以協助生物體在不利生存的環境條件下存活。當線蟲 (Aphelenchus avenae) 在 2.

(22) 逐漸脫水的時候，最多可將身體乾重的 20% 轉變成海藻糖 (Elbein et al., 2003)。另外，一種生長在沙漠中的復甦植物鱗葉卷柏 (Selaginella lepidophylla)，乾重約含 12.5% 的海藻糖及 1.5% 的蔗糖，此種植物可以在完全乾燥的情況下，透過復水後回到正常的生長狀態 (Adams et al., 1990)。在低等生物，如古生細菌當中亦可發現海藻糖與細胞在極端逆境中存活的相關性，不論在極熱、極冷、極酸、極鹼、滲透壓的變化等不利的環境條件下大多可見海藻糖的存在。酵母菌培養過程中，當生長曲線由對數期進入穩定期時，細胞內海藻糖的含量也會跟著增加。並發現可能與存活率有關，更多酵母菌對逆境的耐受性研究，如對熱與乾燥壓力下的耐受性、滲透壓逆境等，同樣凸顯海藻糖的重要性 (Hounsa et al., 1998)。海藻糖的機制之所以可以在冷凍-解凍、加熱-冷卻或脫水-復水的循環中穩定維持生命系統，很可能與海藻糖的分子構型有關 (Richards et al., 2002)。由分子模擬的研究發現海藻糖可以藉由取代水分子並與生物分子結構結合，在環境壓力的情況下，穩定生物分子及抑制不可逆的變性 (梅納反應) (Donnamaria et al., 1994)。海藻糖保護分子的作用機制目前可分為三種理論：水替代理論 (water replacement)、玻璃化理論 (glass transformation) 及化學的穩定 3.

(23) (chemical stability)。關於水替代的理論，認為海藻糖能與生物分子形成穩定的氫鍵，代替生物分子在空間結構中所需要的水分子。也就是生物體內的蛋白質、核酸、醣類、脂質及其他生物大分子周圍均包覆著一層水膜，而這層膜是維持生物分子結構及功能不可或缺的基質，當生物分子在脫水、凍結的狀態下失去水膜時，海藻糖分子也帶有如水分子一般的氫氧基，能在失去水膜時與生物分子形成氫鍵，形成一層保護膜來代替水膜，適應大分子不規則的極性基團，使生物分子能維持活性 (Hengherr et al., 2008; Richards et al., 2002)。玻璃化假說認為，液態中的糖類經蒸發可以轉化或保持玻璃態 (glass state) 而不結晶。海藻糖其獨特的性質就在於它可形成在高溫及完全乾燥的狀態下仍穩定不吸濕的玻璃態，這樣的特性使得海藻糖的玻璃態比起其他糖類，在極端的環境下更可維持不變。玻璃態可支撐生物分子，使生物分子在經過脫水後，仍可能夠恢復原來的結構 (Crowe and Crowe, 2000)。二、海藻糖的應用由於海藻糖的特殊性質與作用機制，因此目前被廣泛應用在食品加工、醫藥、生化製品及化妝品產業中 (Iturriaga et al., 2009)。(1) 可用來保護酵素活性：海藻糖能被用來在常溫之下保存不耐熱的酵素， 4.

(24) 例如 DNA 聚合酶、限制酵素和 DNA 接合酶 (Colaco et al., 1992)；(2) 扮演複合分子的穩定者和保護者：能保存一些不穩定的分子，例如能保持抗體的乾燥在常溫下並維持活性達數個月 (Roser and Colaco, 1993)；(3) 食品的添加物：海藻糖能利用在食品乾燥或食品加工上來保持食品的芳香與口感，例如水果或蔬菜；海藻糖是無毒性的並已被利用在人類的飲食中，例如存在於麵包、蜂蜜、蘑菇和酒當中 (Kidd and Devorak, 1994)；(4) 保存細胞、組織和器官：在有海藻糖的存在下，將細胞、組織和器官冷凍後可以保存數個月，能改善儲存期限 (Eroglu et al., 2000)；(5) 改善花的儲存期限：添加 50 到 100 mM 的海藻糖到鬱金香和唐菖蒲中能避免蒸發，可以增加在花瓶中儲存的時間 (Iwaya-Inoue and Takata, 2001)；(6) 基因轉殖植物產物的篩選標記：阿拉伯芥植物 (A. thaliana) 的 AtTPS1 基因編碼 TPS1 酵素，當植物過度表達這基因時會使葡萄糖進入種子或組織中 (Avonce et al., 2004)，而植物進行萌發或分化時會被葡萄糖抑制，因此 AtTPS1 能被用來作為植物轉型過程的篩選標記基因 (Leyman et al., 2006)；(7) 在化妝品產業中：海藻糖能減少人體皮膚 70% 不良氣體的排放，可添加於臉霜、體霜與除臭劑中 (Higashiyama, 2002)；(8) 在醫療用途上：在亨丁頓舞蹈症 (Huntington's chorea) 中，海藻糖能預防腦中多麩醯胺酸 (polyglutamine) 的形成 (Katsuno et al., 2004)。在骨質疏鬆症 5.

(25) (osteoporosis) 中，海藻糖能減少缺乏卵巢母鼠的骨骼變異 (Higashiyama, 2002)。三、海藻糖的生合成路徑目前已知的海藻糖生合成路徑主要有以下五種 (附錄三)：(1) TPS-TPP 路徑 (又稱 OtsA-OtsB)，此路徑經 trehalose-6-phosphate synthase (TPS；EC 2.4.1.15) 催化，將 Uridine diphosphate-glucose (UDP-glucose) 與 glucose-6-phosphate (glucose-6P) 轉化成中間產物 trehalose-6-phosphate (T-6-P)，再由 trehalose-phosphate phosphatase (TPP；EC 3.1.3.12) 將中間產物去磷酸根，產生一個海藻醣分子，此路徑廣泛存在於古細菌、細菌、真菌、植物或節肢動物中 (Kaasen et al., 1994)。(2) TreP 路徑由 trehalose phosphorylase (TreP；EC 2.4.1.64) 催化，將 glucose 與 glucose-1-phosphate (glucose-1P) 合成海藻糖，此路徑存在於真菌、野生動物與細菌中 (Han et al., 2003)。(3) TS 路徑由 trehalose synthase (TS；EC 5.4.99.16) 催化 maltose，將 maltose 的 α,α-1,4-糖苷鍵轉化為 α,α-1,1-鍵結的trehalose，此路徑僅存於細菌中 (Nishimoto et al., 1995)。(4) TreY-TreZ 路徑 (又稱 MTS-MTH 路徑)，由兩個酵素 maltooligosyltrehalose synthase (TreY，MTS；EC 5.4.99.15) 和 maltooligosyltrehalose trehalohydrolase (TreZ，MTH；EC 3.2.1.141) 催化 maltooligosaccharide 或 starch 形成 trehalose。MTS 催化 6.

(26) maltooligosaccharide 位於還原端的 α-1,4-糖苷鍵，轉換成 α-1,1-鍵結，形成 maltooligosyltrehalose，再由 MTH 作用在鄰近 α-1,1-鍵結旁的 α-1,4-鍵結上，釋放出 trehalose 與剩餘的 maltooligosaccharide，此路徑存在於古細菌與細菌當中 (Maruta et al., 1996)。(5) TreT 路徑，由 trehalose glycosyltransferring synthase (TreT；EC 2.4.1.245) 催化，將 ADP-glucose 與 glucose 聚合生成 trehalose 並釋放 ADP，此路徑存在於古細菌與細菌中 (Ryu et al., 2005)。此外海藻糖在生物體的分解代謝主要由 trehalase (TreH；EC 3.2.1.28) 催化，水解 trehalose 以生成 glucose (Kyosseva et al., 1995)。四、海藻糖合成酶 (trehalose synthase，TS) 的介紹 1. TS 的簡介 TS 會催化麥芽糖 (maltose)，使得麥芽糖發生分子內的重組，將 α,α-1,4-糖苷鍵的麥芽糖轉化成 α,α-1,1-鍵結的海藻糖，但會伴隨著副產物葡萄糖的產生。TS 的優點有單一的催化反應、高受質專一性以及低成本。直到目前為止，大約有十種不同菌株的 TS 已經被定性了 (附錄四)。目前所發現的 TS 幾乎全部來自於細菌，在真菌中僅有一例被發現 (Giannesi et al., 2006)。除了嗜熱菌的 TS，其它大部分的 TS，最適反應溫度範圍在 25℃〜35℃，最適的 pH 值在 6.5〜8.5 左右，最大的海藻糖轉化率 (conversion rate) 約在 50〜70% 之間 (附錄 7.

(27) 四)。在海藻糖的應用範圍日益擴大，市場需求日益增加，發展出一種簡單經濟的海藻糖生產工業是目前須解決的問題。海藻糖的工業生產最初是藉由微生物發酵或直接由酵母中提取，但生產成本過高，已經逐漸被酵素合成所取代。TS 與其他酵素相比具有更大的優勢，只需要一種酵素一次反應就能產生海藻糖，並且原料是低成本的麥芽糖，因此很適合應用在大規模的工業生產當中。目前 TS 尚未被用於工業化生成海藻糖，主要是因為應用於工業的酵素需有幾種特性：1. 具有熱穩定性，由於糖化作用 (saccharification) 的溫度須高於 55℃，才不會導致細菌污染，但目前除了嗜熱菌的 TS，其餘的 TS 並不具備這樣高溫的熱穩定性。2. 需有高的海藻糖轉化率，TS 在轉化麥芽糖成海藻糖的過程會產生副產物葡萄糖，且隨著溫度愈高，葡萄糖的量也會隨著上升，降低海藻糖的產量。3. 能大量取得酵素，如利用基因工程來大量表達 TS。目前的 TS 有著 1 和 2 兩樣缺點，所以無法應用在工業化生產海藻糖。如果能改進酵素的特性使其符合工業化的需求，就能將低價的麥芽糖轉變成高價的海藻糖，那將極具經濟效益 (Chou et al., 2010)。 2. TS 的海藻糖轉化率 TS 在麥芽糖與海藻糖之間的催化反應是一種可逆的過程，但大 8.

(28) 部分都傾向於海藻糖的生成，不同來源的 TS 在不同反應溫度下，其麥芽糖轉化成海藻糖的轉化率也都不同，例如 Pimelobacter sp. R48 的 TS 在 5℃ 反應時有約 82% 的海藻糖轉化率 (Nishimoto et al., 1996b)。Mycobacterium smegmatis 的 TS 在 37℃ 反應時有約 50% 海藻糖的轉化率 (Pan et al., 2004)。Pseudomonas stutzeri CJ38 的 TS 在 15℃ 反應時約有 75% 的海藻糖轉化率 (Lee et al., 2005)。 Thermobifida fusca 的 TS 在 25℃ 反應時約有 60% 的海藻糖轉化率 (Wei et al., 2004)。Deinococcus radiodurans 的 TS 反應溫度降至 5℃ 時則可增加至 92% 的海藻糖轉化率 (Wang et al., 2007)。Picrophius torridus 的 TS 在 20℃ 反應時約有 71% 的海藻糖轉化率 (Chen et al., 2006)。Thermus aquaticus ATCC 33923 的 TS 在最適反應溫度 60℃ 反應時有 70% 的海藻糖轉化率，當反應溫度降至 40℃ 時，海藻糖轉化率可達到 82% (Nishimoto et al., 1996a)。Thermus thermophilius 的 TS 在 30℃ 反應時約有 80% 的海藻糖轉化率 (Wang et al., 2007)。 Meiothermus ruber 的 TS 在 20℃ 反應時約有 65% 的海藻糖轉化率 (Zhu et al., 2010)。TS 的海藻糖轉化率一般不被麥芽糖濃度所影響，當麥芽糖濃度在 2.5%〜40% 之間時，海藻糖生成的轉化率不受影響 (Nishimoto et al., 1996b)。 3. TS 的副反應 9.

(29) TS 除了有分子內轉糖作用外，也會有水解的活性 (Nishimoto et al., 1996a; Nishimoto et al., 1996b)，在催化麥芽糖和海藻糖間結構轉換的同時常伴有副產物葡萄糖的產生，且水解的活性會隨著反應溫度的增加而增強。例如，Meiothermus ruber 的 TS 在 20℃ 時葡萄糖的轉化率約為 2.3%，但當反應溫度升高至 50℃ 時葡萄糖的轉化率增加至 18.4%；並且葡萄糖會抑制 TS 的酵素活性，Meiothermus ruber 的 TS 對麥芽糖的 Kcat/Km 為 1164.5 (mol/l/s)，對海藻糖的 Kcat/Km 為 696.6 (mol/l/s)，對麥芽糖與葡萄糖 (10 mmol/l) 混合物的 Kcat/Km 為 330.1 (mol/l/s)。以及 TS 對麥芽糖與葡萄糖混合物其 Km 增加了 3.6 倍，而 Vmax 卻不改變，這表示葡萄糖對於 TS 是種競爭性抑制物，並且葡萄糖的 Ki 只有 3.76 mmol/l，表示葡萄糖對於 TS 的抑制效果很強，並且 TS 對於麥芽糖與海藻糖皆有水解活性並反應成葡萄糖，而葡萄糖會反過來抑制酵素活性 (Zhu et al., 2010)。 4. TS 推測的作用機制由於尚未得到 TS 的蛋白質結晶結構，因此目前 TS 的反應機制僅僅侷限於理論推測階段。日本的 Nishimoto 在 TS 與麥芽糖反應時加入有同位素放射性的葡萄糖，結果顯示並沒有海藻糖或是麥芽糖的生成，證明 TS 的催化反應是分子內的重組轉糖作用，而不是分子間的反應 (Nishimoto et al., 1996a)。韓國的 Koh 利用核磁共振 (Nuclear 10.

(30) Magnetic Resonance，NMR) 和電噴霧質譜 (Electrospray Ionizsation MassSpectrometry，ESI-MS) 的分析方法發現麥芽糖與海藻糖的轉換包含兩個過程，α,α-1,4-糖苷鍵的斷裂與 α,α-1,1-鍵結的生成，並推測副產物葡萄糖的生成是由於水分子被作為親核體 (nucleophile) 攻擊了葡萄糖殘基而生成的 (Koh et al., 2003)。根據比對 TS 的胺基酸序列後發現，TS 有 α-澱粉酶家族 (α-amylase，glycoside hydrolase family 13，GH13) 所具有的四個保守區 (附錄五)，因此推測 TS 為 α-澱粉酶家族成員之一 (Zhu et al., 2009)。這類的家族成員皆有個催化區在 N 端序列由 (β/α)8 的桶狀結構 (TIM barrel) 所組成 (附錄六) 以及有相似的催化機制 (MacGregor et al., 2001)，在胺基酸序列的 Ⅱ 區和 Ⅲ 區有著扮演催化角色的胺基酸，Ⅱ 區的 Asp 為親核體，攻擊在受質的第一個碳上；Ⅲ 區的 Glu 為酸/鹼催化劑 (acid/base catalyst)，會提供一個氫質子給糖苷鍵上的氧原子，使得糖苷鍵斷裂。而 Ⅰ 區和 Ⅳ 區的 His 為受質的結合位。根據 α-澱粉酶家族的催化機制 (附錄七)，推測 TS 的可能的作用機制為藉由催化兩次取代反應來完成海藻糖和麥芽糖的異構化過程。 TS 與麥芽糖在催化中心結合後，親核體 Asp 會攻擊在麥芽糖的第一個碳上以及酸/鹼催化劑 Glu 會提供一個氫質子給糖苷鍵上的氧原子，形成酵素及受質的過渡態。之後發生第一次取代反應，使得麥芽糖的 11.

(31) 糖苷鍵斷裂，產生酵素與葡萄糖的共價結合的中間產物。此後，當酵素進行異構化反應，使得另一個游離在外的葡萄糖分子會被轉移， Glu 會攻擊游離在外的葡萄糖分子的第一個碳上的氫氧基，造成葡萄糖上第一個碳上的氫氧基能進行親核性攻擊酵素與葡萄糖的共價結合的中間產物的第一個碳，發生第二次取代反應，產生產物海藻糖 (附錄八)。在過去的研究中，將 TS 的催化胺基酸 Asp 和 Glu 突變為 Ala，TS 的活性則幾乎喪失，證明這兩個胺基酸對酵素而言是相當重要的位置 (Chen et al., 2006)。而酵素在第一次取代反應發生後也可能走向負反應，如果水分子進入了催化中心，並做為親核體先攻擊中間產物的第一個碳時，則會產生副產物葡萄糖，也就是水解的副反應 (Zhu et al., 2009)。 TS 可催化麥芽糖及海藻糖相互轉換的可逆反應，指的是麥芽糖及海藻糖皆可當 TS 的受質。Pan 等人於 2004 年研究 TS 的催化機制發現 TS 具有兩個結合位，分別結合麥芽糖及海藻糖，將 TS 反應在高濃度無放射性的海藻糖與微量有放射性的麥芽糖，依然能將微量有放射性的麥芽糖為受質，生成有放射性的海藻糖。如果 TS 結合位相同，高濃度的海藻糖會去競爭結合位，從而阻止了麥芽糖的結合。 TS 以麥芽糖為受質時會催化 α,α-1,4-糖苷鍵的斷裂，而以海藻糖為受質時則催化 α,α-1,1-糖苷鍵的斷裂，因此其催化機制可能不相同， 12.

(32) 這也說明了 TS 可能存在兩個受質結合位，分別結合麥芽糖及海藻糖。在研究中另外發現了，葡萄糖會抑制 TS 的活性，在反應時加入額外的葡萄糖，會抑制 TS 活性，這研究也證明了酵素與葡萄糖中間產物的假設 (Pan et al., 2004)。 5. 耐輻射奇異球菌海藻糖合成酶 (Deinococcus radiodurans trehalose synthase，DrTS) 耐輻射奇異球菌 (Deinococcus radiodurans) 屬於格蘭氏陽性菌，也屬於一種耐輻射的細菌，目前它的基因組 DNA 已經都被定序完成了。因此將耐輻射奇異球菌的 TS 基因選殖出來後，即為耐輻射奇異球菌海藻糖合成酶 (Deinococcus radiodurans trehalose synthase， DrTS)，目前 DrTS 已經被定性完成，其酵素最適反應溫度為 15℃、最適 pH 值為 6.5，最高熱穩定性為 40℃ 以及 pH 值穩定性介於 5.5 至 8.0 (Zhu et al., 2009)。五、蛋白質結構模擬 1. 蛋白質三級結構模擬目前對於蛋白質結構的研究方法，主要可分為兩大類，一類是利用實驗的方法，例如以 X 光繞射或以核磁共振的方法來建立蛋白質的結構模型；另一種則是利用電腦的計算，透過目前有的結構資訊並配合理論計算，來模擬出未知結構的蛋白質。預測的方法則包括了同 13.

(33) 源模擬法 (homology modeling)、摺疊辨識法 (protein fold recognition) 以及重頭起算法 (ab initio) 三種 (Schwede et al., 2003)。同源模擬法：將目標蛋白質的胺基酸序列與蛋白質結構資料庫 (Protein Data Bank，PDB) 已知蛋白質進行比對，找出最佳的三級結構模板，以此模板為模型將目標序列輸入後，取得目標蛋白質的三級結構，經分子動能模擬 (molecular dynamics) 及能量最適化 (energy minimization) 運算，以得到目標蛋白質的三級分子結構模型。一般而言，蛋白質序列和模板序列之間的相似度越高，所模擬出來的蛋白質結構其準確性也就越高。同源模擬法主要應用在藥物設計、蛋白質定點突變研究或蛋白質活性中心分析；由於以比較同源性的方式，具有相當的可信度，其結構的變異相對較低，因此是目前蛋白質結構模擬中，最常使用的方法 (Schwede et al., 2003)。摺疊辨識法：將目標蛋白質的胺基酸序列分區段，代入已知蛋白質結構序列的相似摺疊模板，觀察二者在某一區域內之相似度，依序列順序跟結構排列的法則，經能量最適化，來找出符合要求的分子。此法需耗費大量的計算資源，對於蛋白質的核心部份具有較高的準確度，其外圍的二級結構則較差 (Yang et al., 2011)。重頭起算法：以分子動力學的原理，考慮胺基酸和溶液的所有交互作用力，找出分子間最穩定的狀態；由胺基酸序列開始，來計算出 14.

(34) 蛋白質的三級結構。此法同樣需要大量計算，且只能對短鏈胜肽進行預測 (Wang et al., 2012)。 2. 蛋白質嵌合模擬蛋白質嵌合模擬是以電腦模擬分子及分子之間的作用情況，以預測可能的結合結構。典型的嵌合方法是以能量為基礎的評分方式去定義出最可能的蛋白質與配位體 (ligand) 結合結構，能量較低的結構比起能量較高的結構其結合結構越可信，因此利用分子嵌合模擬能進行優化來找出一個能量最低最穩定的結構 (Thomsen and Christensen, 2006)。六、蛋白質工程蛋白質工程就是藉由蛋白質的立體結構與催化反應的作用機制之間的關係，利用基因工程的手法，改造原有的蛋白質來獲得性質與功能更加完善的蛋白質，甚至創造出全新的、自然界中本來不存在的蛋白質，更有效率且完善的提供人類需求 (Rubingh, 1997)。蛋白質工程的目的包括：1. 蛋白質結構與功能關係的研究；2. 蛋白質折疊的研究；3. 增加蛋白質的穩定性；4. 增加酵素的催化活性； 5. 改變受質分子辨認結合與其專一性等。最終目的在於改變蛋白質與受質結合之間的特性，製造出有助於醫學與工業應用的蛋白質或藥物 (Rubingh, 1997)。 15.

(35) 蛋白質工程的方法分為兩大類，第一類為理性的設計 (rational design)，利用蛋白質已知的結構和功能來設計突變的位點，並利用定位突變 (site-directed mutagenesis) 的技術來進行改造，是個屬於低成本且較快速的方法。第二類為定向演化 (directed evolution) 的方式，利用隨機突變的技術來進行改造，這種方式是仿造自然演化的模式，並且通常會比理性的設計還會有更佳的蛋白質改善，利用定向演化來進行蛋白質的改造時，最大的優點是不需要預先得知蛋白質的立體結構，但缺點是需要大量、大規模的篩選，因此並不是所有的蛋白質都適合以定向演化來改造 (Rubingh, 1997)。. 16.

(36) 貳、研究目的海藻糖的獨特性，目前在食品、醫藥、化妝品及工業之產業應用上，已受到廣泛的注視與應用，惟提高海藻糖產量及降低生成產成本遂成為研究致力的方向。在海藻糖的工業生產中，TS 具有比其他酵素更大的優勢，只需一種酵素一次反應就可生成海藻糖，並且原料是低成本的麥芽糖；然而如何進一步的提高海藻糖合成酶的轉化率和穩定性仍是目前所面臨的問題，因此本論文擬以耐輻射奇異球菌海藻糖合成酶 (Deinococcus radiodurance trehalose synthase，DrTS) 作為研究的對象，期望可以藉由酵素工程的技術來提升 DrTS 的酵素轉化效率。為了達到以上的目的，本研究擬定以下幾項研究目標： 1. 模擬 DrTS 與麥芽糖的複合物立體結構：由於尚未得到 TS 的蛋白質結晶結構，因此在我們的研究中，會以分子同源模擬法建立 DrTS 蛋白質三級結構，並藉由電腦模擬分子嵌合 (docking) 軟體模擬 DrTS 與麥芽糖的複合物立體結構，並根據此結構推測出幾個影響此酵素催化性質的胺基酸。 2. 以定位突變 (site-directed mutagenesis) 或定點飽和突變 (site-specific saturation mutations) 來建構 DrTS 的突變株：由麥芽糖嵌合 DrTS 的立體結構所推測出個幾個影響此酵素催化性質的胺基酸，利用定位突變或定點飽和突變來建構出可能減少水 17.

(37) 解的副反應或改善催化性質的 DrTS 突變株，並分析酵素轉化率。 3. 藉由結合 (couple) 葡萄糖異構酶 (glucose isomerase，GI) 來減少副產物葡萄糖的抑制：將 DrTS 與 GI 共同反應，利用 GI 將 DrTS 產生的副產物葡萄糖轉化成果糖 (fructose) 以減少葡萄糖的抑制性，並分析酵素活性。 4. 藉由加入 α-澱粉酶抑制劑或海藻糖類似物來抑制 DrTS 的逆反應：加入 α-澱粉酶抑制劑或海藻糖類似物來抑制 DrTS 的逆反應，分析酵素正逆反應活性。. 18.

(38) 參、材料與方法一、模擬 DrTS 蛋白質三級結構將 DrTS 的胺基酸序列輸入美國國家生物科技資訊中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI) 的蛋白質資料庫 (Protein Data Bank，PDB) 中進行胺基酸序列搜尋比對 (BLAST) (Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005)，搜尋最相似胺基酸序列的已知結構蛋白質，並利用序列比對軟體 (ClustalW) (Li, 2003) 進行比對。藉由蛋白質分子三級結構模擬網站 (Swiss-Model) (Schwede et al., 2003) 模擬 DrTS 的蛋白質分子三級結構，並根據最相似的已知結構蛋白質來做為模板 (template)，以得到模擬的 DrTS 蛋白質分子三級結構。利用分子三級結構顯示軟體 (PyMol) (DeLano and Lam, 2005) 來進行結構的顯示、疊合 (superimposition) 與胺基酸的突變模擬。二、模擬 DrTS 與麥芽糖的複合物立體結構藉由化合物資訊中心 (Hetero-Compound Information Centre， HIC-Up) (Connell et al., 1996) 下載麥芽糖的分子結構模型。藉由電腦模擬分子嵌合軟體 (Molegro Virtual Docker，MVD) (Thomsen and Christensen, 2006) 模擬 DrTS 與麥芽糖的複合物立體結構，此軟體利用嵌合模擬法 (docking simulation) 預測分子與分子之間的作用情況，以模擬可能的結合結構。利用 MVD 內建的偵測活性中心工具 19.

(39) (detect cavities)，透過 DrTS 與模板的結構疊合，將嵌合的範圍設立在模板的活性中心周圍，進行 100 次嵌合的模擬，其結果藉由 MVD 內建的均方根偏差 (root mean square deviation，rmsd) 與結合能 (binding energy) 來計算排序。並利用 MVD 內建的側鏈最適化 (sidechain minimization) 進行突變胺基酸的能量最適化。三、DrTS 蛋白質工程 1. DrTS 基因重組質體本實驗所使用的 TS 為陳俊傑學長由耐輻射奇異球菌 (Deinococcus radiodurance) 選殖出來 (Wang et al., 2007)，接入 pET-23a(+) 質體內並送入 Escherichia coli (E.coli) 品系 BL21(DE3) 進行表達，並在胺基酸序列 C 端接上 6 個 Histidine-tag 方便之後使用陰離子交換樹脂 Ni2+ resin 進行基因表達後的蛋白質純化。 pET-23a(+) 原有 3666 bps，並帶有 T7 promoter、T7 terminator、 Ampicillin 抗性基因與 multiple cloning site。DrTS 基因插入在 EcoRI 與 NdeI 的切位中間，整個質體大小為 5287 bps。 2. 宿主菌株與培養基的選擇選取 E.coli 品系 DH5α 或 BL21(DE3) 做為宿主細胞，DH5α 用以複製大量質體 DNA；BL21(DE3) 藉由 T7 RNA polymerase 啟動蛋白質大量表達，適合用來做蛋白質表達與純化相關實驗。由於 20.

(40) pET-23a(+) 質體具有 Ampicillin 抗性基因，因此具有 Ampicillin 之抗性，故選用的培養基為 LB medium (1 L 含有 10 g 的 bio-tryptone、5 g 的 yeast extract、10 g 的 NaCl)，並搭配 Ampicillin (100 μg/mL)。 3. 質體 DNA 製備將帶有 pET-23a(+)-DrTS 的 DH5α 接種到 3 mL LB (含有 100 μg/mL Ampicillin) medium 中，隔夜培養，離心 3000 rpm、10 分鐘，除去上清液留下沉澱菌體，操作 Mini PlusTM Plasmid DNA Extraction System Kit (VIOGENE，Cat#GF2002)，以抽取質體 DNA。 4. DNA 之定量與電泳 4.1. DNA 定量取 1 μL DNA 以分光光度計測 OD260 下之吸光值，並以二次去離子無菌水 (ddH2O) 作為對照組，測其吸光值並換算成 DNA 濃度 (μg/μL)。 4.2. DNA 電泳將 DNA 樣品以 5：1 的比例加入 6X DNA loading dye，注入 1% 的瓊脂 (agarose) 電泳膠片中，電壓設定為 120 伏特，進行電泳膠片分析。 5. 突變設計 5.1 定點飽和突變引子設計 21.

(41) 將設計好的定點飽和突變引子以引子分析軟體 (Primer Premier 6) (Singh et al., 1998) 分析，其 GC content (%) 要高於 40%；每個突變點設計兩條作為的定點飽和突變之引子，每條引子核苷酸的數目應介於 20-25 之間，且突變的核苷酸需位在引子序列的正中間位置 (表一)。將突變的核苷酸設計成 NNK 只需要 150 個菌株即能取代成各種胺基酸 (Kretz et al., 2004)。 5.2 定位突變引子設計將設計好的定位突變引子以引子分析軟體分析，其 GC content (%) 要高於 40%；每個突變點設計一條或兩條做為定位突變之引子，只設計一條核苷酸的數目應介於 35-45 之間；設計兩條核苷酸的數目應介於 20-25 之間，且突變的核苷酸需位在引子序列的正中間位置 (表二)。利用 Watcut 網站 (http://watcut.uwaterloo.ca/ watcut/watcut/template.php?act=silent_new) 的寧靜突變搜尋 (silent mutation scanning) 來設計新限制切位但不改變蛋白質的胺基酸序列，以進行突變株的篩選。 5.3 點突變引子合成點突變核苷酸引子是委託百力生物科技股份有限公司合成。點突變核苷酸引子在經過合成後，依其建議加入適當量之二次去離子無菌水，調整其點突變核苷酸引子濃度為 100 μM，並存放於 -20℃ 以備 22.

(42) 使用。 5.4 點突變 PCR 溶液點突變 PCR 反應溶液是根據 QuickChange Osite-Directed Mutagenesis kit 中的方法修改而來，加入的量及組成如下： Volume (μL). Components Pfu DNA polymerase 10 X buffer with MgSO4. 5. ds DNA template pET-23a(+)-DrTS (10 ng/μL). 1. forward primer (10 mM/μL). 2. reverse primer (10 mM/μL). 2. dNTP (N=A,T,C,G) (2.5 mM/μL). 4. ddH2O. 35.5. Pfu DNA polymerase (3 U/μL). 0.5. 進行點突變時 PCR 總體積為 50 μL，進行 PCR 反應，接著設定 PCR 反應條件。進行點突變實驗過程中，為了避免額外的突變發生，故選擇具有校正功能之聚合酶 (Pfu DNA polymerase)。 5.5 點突變 PCR 反應點突變之 PCR 反應溫度是根據 QuickChange Osite-Directed Mutagenesis kit 中的方法來調整其反應 denature、annealing 及 extension 的溫度與時間，extension 時間隨著質體長度增加而加長，1 Kb 需 2 分鐘，PCR 流程見附錄九。反應結束後以瓊脂電泳膠片進行產物分析確認 DNA 片段大小與 pET-23a(+)-DrTS 大小相同，為 5.2 23.

(43) Kb。 5.6 DpnI 剪切為了避免未突變的 ds DNA template 影響轉型時的效率，因此加入 0.5μL DpnI，於 37℃ 作用 4 小時，將已甲基化之 ds DNA template pET-23a(+)-DrTS 進行剪切，降低模板 DNA 片段經轉型而產生的背景值，以提高突變 DNA 突變株的突變機率。 5.7 DNA 定序分析此部份委託基龍米克斯生物科技股份有限公司進行。四、DrTS 蛋白質表達 1. 勝任細胞 (competent cell) 的製備首先挑取 E. coli 品系 BL21(DE3) 或 DH5α 之單一菌落，接種於 3 mL LB medium，37℃、225 rpm 隔夜培養。而後取 1 mL 菌液加入 30 mL LB medium，於 37℃、225 rpm 培養 3 小時，冰浴 10 分鐘，再以 4℃、3000 rpm 離心 10 分鐘。去除上清液，再以預冷的 30 mL、 100 mM CaCl2 重新懸浮菌體，置於冰上 30 分鐘，並每隔 5 分鐘輕輕搖晃，之後再離心並倒掉上清液。以預冷的 3 mL、100 mM CaCl2 重新懸浮菌體，每 200 μL 分裝至微量離心管中，置放於 4℃ 中至隔夜轉型效率可達最高。加入甘油 (glycerol) 到終濃度為 15%，並於 -80 ℃ 中保存，使用期限不超過一個月。 24.

(44) 2. E.coli 轉型 (transformation) 將質體 DNA 與勝任細胞混合均勻，冰浴 30 分鐘，再以 42℃ 熱休克 (heat shock) 2 分鐘，冰浴 2 分鐘後加入 1 mL LB medium，於 37℃、225 rpm 培養 1 小時，再以 3000 rpm 離心 10 分鐘，留下約 200 μL 的菌液，重新懸浮菌體後塗於含有 Ampicillin (100 μg/ml) 的培養基中，置於 37℃ 培養箱中培養隔夜，再挑選菌落培養。 3. DrTS 蛋白質表達 3.1 蛋白質表達挑選 LB-Ampicillin 培養基的單一菌落，培養於 3 mL LB medium (含有 100 μg/ml Ampicillin) 中隔夜培養 (37℃、225 rpm)，取 1 mL 加入 50 mL LB medium (含有 100 μg/ml Ampicillin)，並加入 0.4 mM IPTG 於 25℃、150 rpm 培養 24 小時以誘導蛋白質大量表現。經過破菌後離心 (12,000 rpm、10 min)，取上清液跑 SDS-PAGE，並於 marker 顯示約 62 kDa 位置有一個主要 band，即為誘導出來之 DrTS。 3.2 96 孔盤型式蛋白質表達挑選 LB-Ampicillin 培養基上的菌落，培養在深孔 96 孔盤內，每個深孔內有 500 μL LB medium (內含 100 μg/mL Ampicillin)，將深孔 96 孔盤傾斜 30°，在 37℃、220 rpm 震盪培養隔夜，接著將菌液取 20 25.

(45) μL 加入 500 μL LB medium (內含 100 μg/mL Ampicillin、0.4 mM IPTG) 於新的 96 孔深盤內，同樣傾斜 30°，在 20℃、220 rpm 震盪培養隔夜，誘導 DrTS 的表現。五、DrTS 蛋白質純化 1. 蛋白質粗萃取液經過蛋白質誘導的 50 mL 菌液，以 4℃、6000 rpm 離心 10 分鐘，去除上清液，並將菌體重新懸浮於 10 mL sonication lysis solution (100 mM NaCl、1 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、pH 7.4)，以 misonic sonicator (機型 XL-2000) 進行超音波震盪，震盪時置於冰上，每震盪 15 秒就靜置 15 秒，以防樣品溫度過高，直至菌液稍微澄清為止 (約 8 至 10 次循環)。最後以 4℃、10000 rpm 下離心 10 分鐘，上清液即為蛋白質粗萃取溶液。 2. 固定化金屬親和性層析法純化蛋白質利用 pET 表達系統所表現的 DrTS，在 C 端帶有 His-tag，因此可以利用固定化金屬親和性層析法 (Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC) 純化，其條件如下：1mL His-tag resin (GE Healthcare Ni Sepharose 6 Fast Flow)，先以 10mL binding buffer (20 mM sodium-phosphate buffer pH 7.4、0.5 M NaCl、20 mM imidazole) 平衡管住，加入蛋白質粗萃取液 5 mL，再以 10 mL binding buffer 洗 26.

(46) 去雜蛋白，最後加入 10 mL elution buffer (20 mM sodium phosphate buffer、0.5 M NaCl、0.5 mM imidazole、pH 7.4)，將目標蛋白從管柱沖離下來，並收集具有目標蛋白的部分，利用濃縮離心管以 20 mM sodium-phosphate buffer pH 7.4 進行濃縮透析，以 4℃、10,000 rpm 離心 10 分鐘，去除廢液，重複濃縮透析的動作約五次。透析後將酵素液分裝至微量離心管中，置於 -20℃ 保存。 3. 高效能 96 孔盤型式蛋白質純化與透析 3.1 高效能 96 孔盤型式蛋白質純化將深孔 96 孔盤每個孔內加入 50 μL FastBreakTM cell lysis reagent (Promega，Cat#RV8573)，放於培養箱中以 220 rpm 震盪 20 分鐘，再以 3700 rpm 離心 10 分鐘，取上清液 450 μL 至另一個深孔 96 孔盤中，加入 50 μL His-tag resin，置於培養箱中以 150 rpm 震盪 10 分鐘使 DrTS 附著於 resin 上，再將上清液與 resin 混合物加入 filtration plate (Promega， Cat#V3680)，流洗 1 分鐘後，離心 2000 rpm、15 秒來移除雜蛋白，再加入 2 mL binding buffer，流洗 1 分鐘來移除雜蛋白，之後離心 2000 rpm 共 15 秒來移除 binding buffer，將 filtration Plate 置於 collection plate 上，並加入 100 μL elution buffer 於 filtration plate 的孔內，放在搖晃台上搖晃 10 分鐘使 DrTS 與 resin 脫離，再離心 2000 rpm 共 15 秒來收集純化後的 DrTS。 27.

(47) 3.2 高效能 96 孔盤型式蛋白質去鹽將純化後的 100 μL DrTS 蛋白質加至去鹽的 96 孔盤 (PD MultiTrap G-25)，離心 2000 rpm 共 3分鐘來收集去鹽後的 DrTS。 3.3 PD MultiTrap G-25 回收再利用由於卡在 resin 中的蛋白質與鹽類無法經由三次沖洗而全部洗出，所以必須在使用後，參考 gel filtration resin 的清洗方式，先以 300 μL 二次去離子水沖洗五次，再使用 300 μL、0.2 M 的 NaOH 浸泡 resin 共 30 分鐘以去除殘留蛋白質與 resin 的結合，之後再用二次去離子水沖洗五次將 NaOH 洗淨，再用 20% 酒精浸泡 resin 保存。六、蛋白質分析 1. 蛋白質電泳 a. 蛋白質電泳試劑 (a) 40% (w/v) acrylamide：ACRYL/BIS = 37.5：1 solution (Bioshop， Cat#BIS001)。 (b) Ammonium persulphate (APS)：10% (w/v) solution。 (c) SDS solution：配置 10% (w/v) 溶液保存於室溫。 (d) Stacking gel buffer：配置 0.5 M Tris-HCl 溶液，pH 6.8。 (e) Resolving gel buffer：配置 1.5 M Tris-HCl 溶液，pH 8.8。 28.

(48) (f) Tris-glycine electrophoresis buffer：含 0.025 M Tris、0.192 M glycine 與 0.1% SDS，pH 8.3。 b. SDS-聚丙醯胺膠體溶液調配法 Reagent. 12% Resolving gel. ddH2O. 5% Stacking gel. 5.28 mL. 3.06 mL. 3.6 mL. 0.64 mL. 40% Acrylamide/Bis Stock 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8). 3.0 mL. 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8). 1.25 mL. 10% SDS Stock. 120 μL. 50 μL. 10% Ammonium Persulfate. 120 μL. 50 μL. 6 μL. 5 μL. 12.126 mL. 5.055 mL. TEMED Total volume c. 膠體的製備. 將陶瓷片和玻璃片中間以 0.75 mm 的 spacer 兩條夾起，再放入製膠器中，將螺絲鎖緊，並注意底下有無空隙會使液體流出。先注滿 95% 酒精，放置五分鐘確認底部是否有漏，倒掉酒精後倒立放置到乾了後，將 12% resolving gel 注入至離頂部約 1.5 到 2 公分的間隔，並倒入 95% 酒精將膠壓平。待膠凝固後將酒精倒掉，注入 5% stacking gel 倒滿並插齒梳，待膠凝固後拔除齒梳，並將玻璃片組從製膠器上拿出。 d. 5X SDS sample buffer 製備與電泳條件 29.

(49) (a) 40% (w/v) acrylamide：ACRYL/BIS=37.5：1 solution (b) 25.6% β-mercaptoethanol (c) 10% SDS stock (d) 8% bromophenol blue (e) 50% glycerol 蛋白質樣品準備完全後，加入 5X SDS sample buffer 至終濃度為 1X，並熱至 100℃ 反應 5 分鐘，拿出冷卻後即可取出適量注入樣品槽中。先以 75 伏特進行電泳，待染料進入 resolving gel 後，將電壓增加至 130 伏特繼續進行電泳。 e. 電泳膠體的染色 (a) 染色液 4 g coomassie blue (R-250) 溶於 1 L 之甲醇水溶液 (甲醇：水＝1： 1)，再加入 100 mL 冰醋酸。 (b) 褪染液冰醋酸：甲醇：水＝1：2：7 取下電泳完成的膠體，浸泡於染色液中並放於搖晃台上搖動 30 分鐘，之後將染色液置換成褪染液，加入擦手紙並於搖晃台上搖動，當擦手紙顏色與褪染液的顏色同樣深時就置換擦手紙，隔夜即可褪染完成。完成後以一次水浸泡膠體使膠體恢復原來大小，並以玻璃紙封膠進行乾燥保存。 30.

(50) 2. 蛋白質定量使用 5 倍稀釋 (Bio-Rad，Cat#500-0006) protein assay dye reagent (200 μL) 與不同濃度的標準品 BSA (0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL) (10 μL) 混和於 96 孔盤內，使用 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) reader (BioTek uQuant) 測定波長 595 nm 吸光值，製作出標準曲線，再使用同樣的條件測定樣品，代入標準曲線公式中即可求出蛋白質濃度。七、酵素活性分析 1. TS 活性分析－HPLC (High-performance liquid chromatography) 取 5 μg DrTS (由濃度 0.25 mg/mL 的 DrTS 取 20 μL)，添加於 125 mM 麥芽糖 (SIGMA，Cat#M5885) (在 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 中)，反應於 20℃ 與 40℃ 以及不同的反應時間 (0、2、 4、6、8、10、24、30 小時) 後，以聚合酶連鎖反應器於 95℃ 反應 10 分鐘終止酵素反應。而後將樣品以 13 mm NYLON 0.22 μm syringe filter (membrane solutions) 過濾，取 20 μL 的樣品以 HPLC；管柱： SUGAR SZ5532；管柱恆溫箱：60℃；流速：1 mL/min；偵測器：RI 2000 Refractive Index detector；幫浦：SFD 2100 Quaternary gradient pump；溶劑為 acetonitriled：ddH2O：formic acid = 75:25:1；分析時間：15 min，進行酵素反應後的醣類分析 (HPLC 知詳細操作及分析 31.

(51) 方法請見下一段敘述)。以時間為橫軸，產物量為縱軸，來決定反應的時間及酵素量。活性單位 (U) 定義為：每分鐘產生 1 mg 海藻糖所需要的酵素量。 HPLC 之操作及分析方法如下：首先將葡萄糖 (SIGMA， Cat#G5767)、麥芽糖以及海藻糖 (SIGMA，Cat#T9531) 配成不同濃度之標準溶液 (10、25、50、100、150 mM)，以專用注射針筒將上述標準溶液及 DrTS 酵素活性分析之樣品分別注入系統進行分析，每次樣品體積皆取 20 μL，並使用操作軟體紀錄 HPLC 之分析圖譜。將分析圖譜中標準品之訊號峰作面積積分，以標準品濃度為橫軸，面積為縱軸，即可作出標準曲線。依時間順序分別為葡萄糖 (約 5:20 出現)、麥芽糖 (約 7:30 出現) 與海藻糖 (約 9:00 出現)。取樣品與標準品相同滯留時間下之訊號峰面積帶入上述之標準曲線後，即可求得該樣品所含的海藻糖濃度。 2. TS 活性分析－Maltase-coupled TS assay 取 5 μg DrTS，與 125 mM 麥芽糖(在 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 中) 混合反應於 96 孔盤內，並以聚合酶連鎖反應器於 20℃ 反應 30 分鐘，接著反應 95℃、10 分鐘以中止 DrTS 反應。取 10 μL 反應後樣品與 70 μL 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 與 20 μL maltase (1 Unit，SIGMA Cat#G0660) 於 96 孔盤內於 37 32.

(52) ℃ 下反應 7 小時，同時取 125mM 麥芽糖無酵素進行同樣的反應做為控制組。將此溶液稀釋 50 倍取 50 μL 加入 100 μL Glucose assay reagent (SIGMA，Cat#G3660 與 SIGMA，Cat#D2679) 於 37℃ 下反應 30 分鐘，最後加入 100 μL、12 N H2SO4 來呈色，再將此 96 孔盤放入 ELISA reader 讀取 540 nm 吸光值，代入由葡萄糖標準品所繪製的標準曲線公式中，乘回稀釋倍數，將每一個樣品中的葡萄糖量與標準品的葡萄糖量相減，差值即為海藻糖的量。而此利用 maltase 進行 TS 活性測定的方法即為 Maltase-coupled TS assay。葡萄糖之標準曲線：先製備 1 mg/mL 葡萄糖溶液，再分別稀釋成 12.5、25、50、100、150、200 μg/mL 等濃度，取不同濃度葡萄糖標準品 50 μL 加入 100 μL Glucose assay reagent，於 37℃ 下反應 30 分鐘，最後加入 100 μL、12 N H2SO4 來呈色，再將此 96 孔盤放入 ELISA reader 讀取 540 nm 吸光值，做為葡萄糖標準品以求其標準曲線。八、Glucose isomerase (GI)-coupled TS 1. 葡萄糖或果糖對 DrTS 活性影響取 5 μg DrTS 於 125 mM 麥芽糖並混合 (0、20、40、60、80、100、 120 mM) 葡萄糖或果糖 (SIGMA，Cat#F3510) (在 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 中) 在 20℃ 和 40℃ 反應 24 小時，並以聚合 33.

(53) 酶連鎖反應器於 95℃、10 分鐘以中止 DrTS 反應，產物分析以 HPLC 定量。 2. GI 活性分析將 GI (Novozymes) 20 μg 與 50 mM 葡萄糖 (在 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 中) 在 20℃ 和 40℃ 反應 0、4、24 小時，並以聚合酶連鎖反應器於 95℃ 反應 10 分鐘，並將已前處理反應於 100℃ 的失活 GI 作為控制組，產物分析以 HPLC 定量。 3. GI-coupled TS 取 20 μg GI 與 5 μg DrTS 於 125 mM 麥芽糖 (在 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 中) 混合在 20℃ 和 40℃ 反應 0、2、4、6、8、 10、24、30 小時，並以聚合酶連鎖反應器於 95℃ 反應 10 分鐘，產物分析以 HPLC 定量。九、α-澱粉酶抑制劑或海藻糖類似物對 DrTS 正逆反應活性影響取 5 μg DrTS 與 125 mM 麥芽糖和海藻糖混合不同濃度的抑制劑 [validoxylamine A (VAA) (自製) (0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12 mM)、validamycin A (VA) (Duchefa，Cat#V0170) (0、0.02、0.04、0.06、 0.08、0.1、0.12 mM)、kanamycin A (Acroscat，Cat #BP906-5) (0、20、 40、60、80、100、120 mM)、acarbose (SIGMA，Cat #A8980) (0、20、 40、60、80、100、120 mM)、azactidine (Acros，Cat# 22662) (0、20、 34.

(54) 40、60、80、100、120 mM)、lactose (Acros，Cat# 36889) (0、20、40、 60、80、100、120 mM)、lactulose (Fluka，Cat#61360) (0、20、40、 60、80、100、120 mM) 或 isomaltulose (SIGMA，Cat #P2007) (0、20、 40、60、80、100、120 mM)] 反應於 20℃、24 小時，並以聚合酶連鎖反應器於 95℃、10 分鐘以中止酵素反應，產物分析以 HPLC 定量。十、利用酵素水解或酸水解生產 validoxylamine A (VAA) 1. 酵素水解 (a) Pichia pastoris β-glucosidase (medium) 水解於 100 μL 的總反應體積中，取 80 μL 的 β-glucosidase (medium) 與 20 μL、0.5% 的 VA (立農) 在 pH 7.0、25℃ 反應 0、2、6、24 小時，產物以 HPLC 分析。 (b) Cellulase 水解於 100 μL 的總反應體積中，取 80 μL、0.5% 的 cellulase (Yakult R-10) 與 20 μL、1.25% 的 VA 在 pH 7.0、25℃ 反應 0、2、6、24 小時，產物以 HPLC 分析。 (c) Pentinase 水解於 100 μL 的總反應體積中，取 80 μL、1% 的 pentinase (SIGMA， Cat#P9932) 與 20 μL、1.25% 的 VA 在 pH 7.0、25℃ 反應 0、2、6、 35.

(55) 24 小時，產物以 HPLC 分析。 (d) Agarase 水解於 100 μL 的總反應體積中，取 80 μL、1 unit 的 agarase (SIGMA， Cat#A6306) 與 20 μL、1.25% 的 VA 在 pH7.0、40℃ 反應 0、2、6、 24 小時，產物以 HPLC 分析。 2. 酸水解於 10 mL 的總反應體積中，加入 5mL、1 M 的 H2SO4 與 5mL、 30% 的 VA 於 100℃ 反應 20 分鐘，產物以 HPLC 分析。 3. Validamycin A (VA) 與 VAA 分析將水解樣品以 13 mm NYLON 0.22 μm syringe filter (membrane solutions) 過濾，取 10 μL 的樣品以 HPLC；管柱：分析級逆相層析管柱 (Syncronis aQ)；管柱恆溫箱：30℃；流速：1 mL/min；偵測器：光二極體陣列式偵測器 (L-2455)；幫浦：SFD 2100 Quaternary gradient pump；溶劑為 methanol：ddH2O：disodium hydrogen phosphate = 2.5 : 96.5 : 1；分析時間：15 min；波長：210 nm，進行水解反應後的產物分析。依時間順序分別為 VAA (約 5:10 出現) 與 VA (約 7:00 出現)。在酸水解時由於 pH 值的減少，因此反應物及產物出現的訊號鋒時間提早，依時間順序分別為 VAA (約 3:50 出現) 與 VA (約 4:50 出現)。 4. VAA 純化 36.

(56) 將分析後的 10 mL 酸水解樣品以 7 g Ba(OH)2 中和至 pH 5-6 並離心去沉澱物後過濾，之後將 10 mL 樣品以低流速通過 2 mL 陽離子樹脂管柱 (Aberlite ® IR-120 [H+])，並以 10 mL、1M NH4OH 沖洗下來。將沖洗的樣品濃縮成 1 mL 後，以低流速通過 2mL 陰離子樹脂管柱 (Dowex ® 1X2 [OH–])，並以 10 mL 二次去離子水沖洗下來，以進一步的得到純化的 VAA，並利用冷凍乾燥濃縮機進行乾燥濃縮，可得到白色結晶狀的 VAA。 5. 管柱再生與離子交換原買入的陽離子樹脂 (Aberlite ® IR-120) 帶著 Na+ 離子，利用樹脂三倍體積的 1M HCl 以低流速通過樹脂，讓 H+ 離子競爭 Na+ 離子，使得樹脂帶 H+ 離子，之後以二次去離子水平衡及保存樹脂。原買入的陰離子樹脂 (Dowex ® 1X2) 帶著 Cl- 離子，利用樹脂三倍體積的 1M NaOH 以低流速通過樹脂，讓 OH– 離子競爭 Cl- 離子，使得樹脂帶 OH– 離子，之後以二次去離子水平衡及保存樹脂。. 37.

(57) 肆、結果一、模擬 DrTS 與麥芽糖的複合物立體結構 1. 胺基酸序列搜尋比對將 DrTS 胺基酸序列置於 NCBI 內的 PDB 資料庫中進行比對，其相似度最高的蛋白質大多屬於 α-澱粉酶家族，有著大於 90% 的覆蓋率 (query coverage)。依據酵素催化性質可分為兩類，一類是只擁有水解活性的水解酶 (hydrolase)，如：Halothermothrix Orenii α-amylase、Bacillus cereus oligo-1,6-glucosidase 或 Deepest Sea Bacteria α-glucosidase；另一類是具有異構化 (isomerizaton) 活性的蔗糖異構酶 (sucrose isomerase，SI)，如：MutB (PDB entry: 1ZJA， Pseudomonas mesoacidophila MX-45 trehalulose synthase)、SmuA (PDB entry: 3GBD，Protaminobacter isomaltulose synthase) 或 PalI (PDB entry: 1M53，Klebsiella sp LX3 isomaltulose synthase)。與 DrTS 胺基酸序列最相似的蛋白質為 SI 的 MutB，其胺基酸序列與 DrTS 有 31% 的一致性 (identity) 和 49% 的相似性 (similary) (表三)。 2. 模擬 DrTS 的蛋白質三級結構利用 Swiss-Model 進行 DrTS 的蛋白質分子三級結構模擬，並以同樣擁有異構化活性及胺基酸序列相似度最高的 MutB 為模板，所模擬出的結構如圖一。模擬的片段為 5 到 551 個胺基酸，所利用的模 38.